Caenorhabditis elegans Genomik DNA'sının Küçük Ölçekli Ekstraksiyonu

Özet

Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.

Özet

Tek veya birkaç Caenorhabditis elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu, genotipleme hatları, klonlama ve dizileme için PCR dahil olmak üzere birçok aşağı akış uygulamasına sahiptir. C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu için geleneksel proteinaz K bazlı yöntemler birkaç saat sürer. C. elegans kütikülünü etkili bir şekilde açan ve genomik DNA'yı çıkaran ticari ekstraksiyon kitleri sınırlıdır. Sınıf ve araştırma uygulamaları için iyi çalışan C. elegans genomik DNA'sını çıkarmak için kolay, daha hızlı (~ 15 dakika) ve uygun maliyetli bir yöntem burada bildirilmiştir. Bu DNA ekstraksiyon yöntemi, PCR gerçekleştirmek için güvenilir bir şablon elde etmek için başlangıç materyali olarak tek veya birkaç geç larva (L4) veya yetişkin nematodları kullanmak üzere optimize edilmiştir. Sonuçlar, DNA kalitesinin, farklı boyutlardaki gen hedeflerini PCR ile yükseltmek için uygun olduğunu ve reaksiyon başına tek bir yetişkinden genomik DNA'nın ellide birine kadar seyreltmelerde bile tek veya birkaç hayvanın genotiplenmesine izin verdiğini göstermektedir. Bildirilen protokoller, PCR tabanlı uygulamalar için tek veya küçük bir C. elegans örneğinden DNA şablonunu hızlı bir şekilde üretmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.

Giriş

Burada, DNA'yı PCR tabanlı uygulamalar için erişilebilir kılmak amacıyla Caenorhabditis elegans'ın lizisi için iki ilgili protokol sunulmuştur. PCR, diğerlerinin yanı sıra klonlama ve dizileme için DNA fragmanlarının genotiplenmesi ve çoğaltılması da dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılan yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Küçük (1 mm), serbest yaşayan yuvarlak kurt C. elegans, biyolojik araştırmalar için popüler bir hayvan sistemidir. Tek bir hayvandan veya birkaç hayvandan uygun genomik DNA elde etmek, diziyi PCR ile yükseltmek için yeterlidir. Geç L4 larvaları ve yetişkinleri, utero 1'de sadece ~ 1.000 somatik hücre (bazı çoklu nükleer, poliploid hücreler dahil), germ hücreleri ve (hayvan gravid bir hermafrodit ise) yavru ^içerir. Bununla birlikte, bu hayvanlar genomik DNA^2'yi çıkarmak için bozulması gereken bir kütikül ile korunmaktadır. PCR için nematod genomik DNA şablonu hazırlamak için standart yöntemler birden fazla adım içerir ve birkaç saat sürer. Hayvanlar ilk önce proteinaz K (-70 ° C veya altı) içeren solucan lizis tamponunda en az 15-45 dakika (bazı protokoller tarafından daha uzun süre tavsiye edilir) ^3,4,5,6 dondurulur. Bu adım hayvanları açar.

Dondurulduktan sonra, proteinleraz K'nın çalışması için hayvanlar 60-65 ° C'de 1 saat inkübe edilir, daha sonra enzim 95 ° C'de 15-30 dakika boyunca inaktive edilir. Proteinaz K, DNA'yı bozan nükleazları yok eder. PCR'den önce proteinaz K'nın inaktivasyonu, proteinaz K'nın DNA polimerazı bozmasını önlemek için önemlidir. Burada açıklanan iki kit tabanlı protokol, günlük araştırma ve öğretim laboratuar uygulamaları için tek bir hayvandan veya birkaç nematoddan genomik DNA'yı çıkarmak için hızlı, güvenilir ve uygun maliyetli yöntemlerdir. Kullanılan kit başlangıçta üretici tarafından hayvan dokusundan, tükürükten ve saçtan DNA çıkarmak için optimize edildi⁷. Hücreleri lize etmek ve genomik DNA'yı erişilebilir kılmak için tescilli bir doku hazırlama çözeltisi ve ekstraksiyon çözeltisi kullanır. Tescilli bir nötralizasyon çözeltisi daha sonra PCR'yi inhibe edebilecek bileşenleri nötralize eder (örneğin, tuzlar, iyonlar ve Mg^{2 +} bağlayıcı moleküller).

Genotipleme yaparken, tek bir hayvan test edilebilir. Bir suşun homozigot olup olmadığını belirlerken, tek bir hayvandan altı veya daha fazla yavruyu test etmek, bir çizginin homozigot olup olmadığına dair yüksek güven verir (heterozigot bir ebeveynden altı homozigot mutant soyunun rastgele seçilme şansı% 0.02'dir [(1/4)⁶ ×% 100 =% 0.02]). Bu yöntem 1) proteinaz K yönteminden daha az adımla basittir ve 2) şablon hazırlama süresini 15 dakikaya düşürür. Bu çalışmadaki sonuçlar, geliştirilen protokolün, PCR de dahil olmak üzere yüksek oranda saflaştırılmış DNA gerektirmeyen aşağı akış uygulamaları için güvenilir bir şekilde kullanılabilen tek veya birkaç solucandan genomik DNA'nın çıkarılmasında sağlam bir şekilde çalıştığını göstermektedir.

Protokol

1. C. elegans bakımı

NOT: N2 (vahşi tip) ve blmp-1 (tm548) C. elegans suşları standart nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları üzerinde 20 °C'de tutulmuştur.

1. 23.005 g NGM tozunu 973 mL su içinde 2 L'lik bir şişede çözerek NGM plakalarını hazırlayın. Şişe açıklığını alüminyum folyo (veya havalandırmaya izin veren otoklavlanabilir kapak) ile örtün ve kaplamayı otoklav bantla sabitleyin. Tozu çözmek ve içeriği en az 30 dakikalık bir sterilizasyon döngüsü ile sterilize etmek için otoklav.
2. Ortamı bir su banyosunda 60 ° C'ye soğutun.
3. Soğutulmuş ortama 25 mL steril 1 M fosfat (KH₂PO₄) tamponu, pH 6.0 ekleyin; 1 mL 1 M kalsiyum klorür çözeltisi; ve 1 mL 1 M magnezyum sülfat çözeltisi.
4. Homojen bir karışım elde etmek ve düzensiz soğutma ve katılaşma (~ 5 dakika) önlemek için ortamı manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Karıştırma çubuğunun bir vorteks oluşturacak kadar hızlı döndüğünden, ancak kabarcıkların ortaya çıkacağı kadar hızlı olmadığından emin olun (~ 250-300 rpm).
5. Her 10 cm'lik Petri plakasına (toplamda ~ 40 plaka) ortamın ~25 mL'sini dökün. Plakaları gece boyunca oda sıcaklığında (tipik olarak 16-25 ° C) kurulayın.
6. Bir Escherichia coli OP50 kolonisini 37 ° C'de gece boyunca 30-50 mL LB suyunda büyütün.
7. Her plakayı 500 μL E. coli OP50 kültürü ile tohumlayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında kurumasını bekleyin (tipik olarak 16-25 ° C)⁸. Plakaları 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın.
8. C. elegans'ı bir tel toplama veya başka bir yöntem kullanarak tohumlanmış plakalara aktarın ve suş için gereken sıcaklıkta L4 veya yetişkin aşamasına büyümelerine izin verin (tipik olarak 16-25 ° C, hayvanlar dauer olarak aç bırakılmışsa 1-2 gün, hayvanlar embriyo olarak kaplanmışsa 3-4 gün)⁸.

2. Tek solucanlı DNA ekstraksiyonu

NOT: Bu yöntem, DNA'yı tek bir solucandan (toplam hacmin 1,8 μL'sinde bir solucan) çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla solucan lize edilecekse bir ana karışım yapılabilir.

1. Bir termosikler, 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).
2. Aliquot 0.8 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.2 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
3. Diseksiyon mikroskobu altında bir L4 veya yetişkin hayvanı tanımlayın⁹. L4 hermafroditlerini tanımlamak için, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulva arayın. Yetişkin hermafroditleri, uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilecek plakadaki en büyük hayvanları arayarak tanımlayın.
4. Bir platin tel çekme kullanarak, seçilen hayvanı çözelti^10'a aktarın.
5. Borunun altındaki içeriği toplamak için tüpü oda sıcaklığında kısaca (2-3 sn, ≤6.000 rpm / 2.000 × g) santrifüj yapın.
6. Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 2.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.
7. Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinin 0.8 μL'sini ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
8. Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. Lisatı PCR için doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
   NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir⁷.

3. Birkaç kişinin DNA ekstraksiyonu

NOT: Bu yöntem, birkaç solucandan DNA çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla suş lize edilecekse bir ana karışım hazırlanabilir.

1. Termosikler'i 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).
2. Aliquot 2.0 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.5 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
3. L4 veya yetişkin hayvanları diseksiyon mikroskobu altında tanımlayın⁹. L4 hermafroditleri, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulvaya sahiptir. Yetişkin hermafroditler plakadaki en büyük hayvanlardır ve uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilirler.
4. Bir platin tel toplama kullanarak, birkaç hayvanı çözeltiye aktarın: 9 hayvan, 0.5 μL lizat başına 1 hayvan eşdeğeri genomik DNA verir ve 16 hayvan, 0.25 μL'de (3.5 nematod / μL) ^{10'da ~ 1} hayvan eşdeğeri genomik DNA verir.
   NOT: Bu hacme 16'dan fazla hayvan aktarmak zordur.
5. Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
6. Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 3.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.
7. Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinden 2 μL ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
8. Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
9. PCR için lizizi doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
   NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir⁷.

4. PCR reaksiyonu

NOT: Bu solucan lizis tekniğinin, hızlı bir polimeraz kullanarak bir delesyon mutasyonunu tespit eden bir aşağı akış uygulaması açıklanmaktadır. İki solucan lizis protokolünün, reaksiyon başına bir solucanın 1 /^50'sine kadar seyreltmelerde başarılı PCR için genomik şablon DNA üretmedeki etkinliği de gösterilmiştir.

1. Yukarıda Adım 2 ve Adım 3'te açıklandığı gibi, vahşi tip N2 ve mutant suşlar kullanarak tek bir solucandan ve 16 solucandan DNA çıkarın.
2. Vahşi tip N2 hayvanlarından tek solucanlı DNA'nın 2, 10, 20 ve 50 kat seyreltilmesini hazırlayın.
3. İlgilenilen sıraya özgü primerler ve hot-start PCR ana karışımı kullanarak üreticinin protokolünü izleyerek PCR reaksiyonlarını ayarlayın (Tablo 1 ve Tablo 2). Her reaksiyonda şablon olarak 1 μL seyreltilmemiş DNA veya 2 μL seyreltilmiş DNA kullanın.
4. PCR ürünlerini jel elektroforezi ve görüntüleme¹¹ ile onaylayın.

Sonuçlar

Tek veya birkaç vahşi tip yetişkinden genomik DNA, bu iki yöntemin etkinliğini karşılaştırmak için ticari kit veya geleneksel lizis protokolü kullanılarak ekstrakte edildi. Bu lizatlar daha sonra PCR'nin ~ 2.100 bp'lik daha büyük bir hedefi (blmp-1'i kodlama) veya ~ 500 bp'lik daha küçük bir hedefi (sma-10'un bir bölümünü kodlama) yükseltmesi için şablonlar olarak kullanıldı. Her iki yöntem de uygun PCR ürünlerini başarıyla vermiştir (Şekil 1A

Tartışmalar

C. elegans'ın genotiplerini belirlemek, yeni C. elegans suşları oluşturmak için genetik haçlar gerçekleştirirken önemli bir adımdır. Tek veya birkaç C. elegans kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, C. elegans'ın genotiplendirilmesinde çok önemli bir adımdır. Bu protokol, ticari bir kit kullanarak C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonunu tanımlar. Bu yöntem hızlıdır ve sağlam çalışır. Bu yöntem kullanılarak ekstrakte edilen genomik DNA, genoti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP