Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

Riepilogo

Qui viene presentata una descrizione dell'isolamento semplice e relativamente rapido del DNA genomico di Caenorhabditis elegans da uno o pochi animali utilizzando un kit di tessuti disponibile in commercio. La preparazione del gDNA risultante è un modello adatto per la PCR.

Abstract

L'estrazione del DNA genomico da una o poche Caenorhabditis elegans ha molte applicazioni a valle, tra cui la PCR per linee di genotipizzazione, clonazione e sequenziamento. I metodi tradizionali a base di proteinasi K per l'estrazione del DNA genomico da C. elegans richiedono diverse ore. I kit di estrazione commerciali che rompono efficacemente la cuticola di C. elegans ed estraggono il DNA genomico sono limitati. Un metodo facile, più veloce (~ 15 minuti) ed economico per estrarre il DNA genomico di C. elegans che funziona bene per le applicazioni in classe e di ricerca è riportato qui. Questo metodo di estrazione del DNA è ottimizzato per utilizzare singoli o pochi nematodi tardo-larvali (L4) o adulti come materiale di partenza per ottenere un modello affidabile per eseguire la PCR. I risultati indicano che la qualità del DNA è adatta per amplificare bersagli genici di diverse dimensioni mediante PCR, consentendo la genotipizzazione di uno o pochi animali anche a diluizioni a un cinquantesimo del DNA genomico da un singolo adulto per reazione. I protocolli riportati possono essere utilizzati in modo affidabile per produrre rapidamente un modello di DNA da un singolo o un piccolo campione di C. elegans per applicazioni basate su PCR.

Introduzione

Qui, vengono presentati due protocolli correlati per la lisi di Caenorhabditis elegans per rendere il DNA accessibile per le applicazioni basate sulla PCR. La PCR è una tecnica molecolare comunemente usata per molte applicazioni, tra cui la genotipizzazione e l'amplificazione di frammenti di DNA per la clonazione e il sequenziamento, tra gli altri. Il piccolo (1 mm), nematode a vita libera C. elegans è un sistema animale popolare per la ricerca biologica. Ottenere DNA genomico adeguato da un singolo animale o da pochi animali è sufficiente per amplificare la sequenza mediante PCR. Le larve tardive di L4 e gli adulti contengono solo ~ 1.000 cellule somatiche (comprese alcune cellule poliploidi multi-nucleari), cellule germinali e (se l'animale è un ermafrodita gravido) prole in utero¹. Tuttavia, questi animali sono protetti da una cuticola che deve essere interrotta per estrarre il DNA genomico². I metodi standard per preparare il modello di DNA genomico dei nematodi per la PCR comportano più passaggi e richiedono diverse ore. Gli animali vengono prima congelati in un tampone di lisi worm contenente proteinasi K (-70 °C o inferiore) per almeno 15-45 minuti (più a lungo è raccomandato da alcuni protocolli)3,4,5,6. Questo passaggio apre gli animali.

Dopo il congelamento, gli animali vengono incubati per 1 ora a 60-65 °C affinché la proteinasi K funzioni, quindi l'enzima viene inattivato per 15-30 minuti a 95 °C. La proteinasi K distrugge le nucleasi che degradano il DNA. L'inattivazione della proteinasi K prima della PCR è importante per evitare che la proteinasi K degradi la DNA polimerasi. I due protocolli basati su kit qui descritti sono metodi rapidi, affidabili ed economici per estrarre il DNA genomico da un singolo animale o da alcuni nematodi per la ricerca quotidiana e l'insegnamento delle applicazioni di laboratorio. Il kit utilizzato è stato originariamente ottimizzato dal produttore per estrarre il DNA da tessuti animali, saliva e capelli⁷. Utilizza una soluzione proprietaria di preparazione dei tessuti e una soluzione di estrazione per lisare le cellule e rendere accessibile il DNA genomico. Una soluzione di neutralizzazione proprietaria neutralizza quindi i componenti che possono inibire la PCR (ad esempio, sali, ioni e molecole leganti Mg²+).

Durante la genotipizzazione, un singolo animale può essere testato. Quando si determina se un ceppo è omozigote, testare sei o più figli di un singolo animale dà un'alta sicurezza che una linea sia omozigote o meno (c'è una probabilità dello 0,02% di scegliere casualmente sei progenie mutanti omozigoti da un genitore eterozigote [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Questo metodo 1) è semplice, con meno passaggi rispetto al metodo della proteinasi K, e 2) riduce il tempo di preparazione del modello a 15 minuti. I risultati di questo lavoro dimostrano che il protocollo sviluppato funziona in modo robusto nell'estrazione del DNA genomico da uno o pochi vermi, che possono essere utilizzati in modo affidabile per applicazioni a valle che non richiedono DNA altamente purificato, inclusa la PCR.

Protocollo

1. Manutenzione di C. elegans

NOTA: I ceppi N2 (wild type) e blmp-1(tm548) C. elegans sono stati mantenuti su piastre standard di nematodi (NGM) a 20 °C.

1. Preparare le piastre NGM sciogliendo 23,005 g di polvere NGM in 973 ml di acqua in un pallone da 2 L. Coprire l'apertura del pallone con un foglio di alluminio (o tappo autoclavabile che consente lo sfiato) e fissare il rivestimento con nastro adesivo. Autoclave per sciogliere la polvere e sterilizzare il contenuto con un ciclo di sterilizzazione di almeno 30 min.
2. Raffreddare il mezzo a 60 °C a bagnomaria.
3. Al mezzo raffreddato, aggiungere 25 mL di tampone sterile fosfato 1 M (KH₂PO₄), pH 6,0; 1 mL di soluzione di cloruro di calcio 1 M; e 1 mL di 1 M di soluzione di solfato di magnesio.
4. Mescolare il mezzo su una piastra magnetica per ottenere una miscela omogenea e per evitare raffreddamenti e solidificazioni irregolari (~ 5 min). Assicurarsi che la barra di agitazione giri abbastanza velocemente da creare un vortice ma non così velocemente da introdurre bolle (~ 250-300 giri / min).
5. Versare ~ 25 ml del mezzo in ogni piastra di Petri da 10 cm (~ 40 piastre in totale). Asciugare le piastre a temperatura ambiente durante la notte (tipicamente 16-25 °C).
6. Coltivare una colonia di Escherichia coli OP50 in 30-50 ml di brodo LB durante la notte a 37 °C.
7. Seminare ogni piastra con 500 μL di coltura di E. coli OP50 e lasciarli asciugare a temperatura ambiente prima dell'uso (tipicamente 16-25 °C)⁸. Conservare i piatti a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
8. Trasferire C. elegans in piastre seminate utilizzando un raccoglitore di filo o un altro metodo e lasciarli crescere fino allo stadio L4 o adulto alla temperatura richiesta per il ceppo (in genere 16-25 °C, 1-2 giorni se gli animali sono stati placcati affamati come dauers, 3-4 giorni se gli animali sono stati placcati come embrioni)⁸.

2. Estrazione del DNA a verme singolo

NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da un singolo verme (un verme in 1,8 μL di volume totale). Un master mix può essere fatto se più worm saranno lisati contemporaneamente.

1. Programmare un termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 minuti seguito da 95 °C per 3 minuti (programma di lisi).
2. Aliquota 0,8 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,2 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia della soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.
3. Identificare un animale L4 o adulto sotto un microscopio di dissezione⁹. Per identificare gli ermafroditi L4, cerca una vulva caratteristica che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Identifica gli ermafroditi adulti cercando gli animali più grandi sulla piastra che possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.
4. Utilizzando un plettro in filo di platino, trasferire l'animale selezionato nella soluzione¹⁰.
5. Centrifugare brevemente il tubo (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g) a temperatura ambiente per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo.
6. Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 2.1.
7. Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 0,8 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.
8. Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
9. Utilizzare direttamente il lisato per la PCR o conservarlo a 4 °C o -20 °C per un uso futuro.
   NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi⁷.

3. Estrazione del DNA di alcuni individui

NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da alcuni vermi. Un mix master può essere preparato se più ceppi verranno lisati contemporaneamente.

1. Programmare il termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 min seguito da 95 °C per 3 min (programma di lisi).
2. Aliquota 2,0 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,5 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.
3. Identificare L4 o animali adulti sotto un microscopio di dissezione⁹. Gli ermafroditi L4 hanno una caratteristica vulva che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Gli ermafroditi adulti sono gli animali più grandi sul piatto e possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.
4. Usando un plettro di platino, trasferisci alcuni animali nella soluzione: 9 animali producono 1 equivalente animale di DNA genomico per 0,5 μL di lisato e 16 animali producono ~ 1 equivalente animale di DNA genomico in 0,25 μL (3,5 nematodi / μL) ¹⁰.
   NOTA: è difficile trasferire più di 16 animali in questo volume.
5. Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
6. Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 3.1.
7. Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 2 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.
8. Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
9. Utilizzare direttamente la lisi per la PCR o conservarla a 4 °C o -20 °C per un uso futuro.
   NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi⁷.

4. Reazione PCR

NOTA: viene descritta un'applicazione a valle di questa tecnica di lisi del verme, che rileva una mutazione di delezione utilizzando una polimerasi veloce. Viene anche dimostrata l'efficacia dei due protocolli di lisi dei vermi nella produzione di DNA modello genomico per una PCR di successo a diluizioni a 1/^{50 di} un verme per reazione.

1. Estrarre il DNA da un singolo verme e 16 vermi utilizzando N2 wild-type e ceppi mutanti, come descritto sopra nella fase 2 e nella fase 3.
2. Preparare diluizioni di 2, 10, 20 e 50 volte del DNA di un singolo verme da animali N2 selvatici.
3. Impostare le reazioni PCR seguendo il protocollo del produttore utilizzando primer specifici per la sequenza di interesse e la miscela master PCR a caldo (Tabella 1 e Tabella 2). Utilizzare 1 μL di DNA non diluito o 2 μL di DNA diluito come modello in ogni reazione.
4. Confermare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e imaging¹¹.

Risultati

Il DNA genomico di uno o pochi adulti wild-type è stato estratto utilizzando il kit commerciale o il protocollo di lisi tradizionale per confrontare l'efficacia di questi due metodi. Questi lisati sono stati poi utilizzati come modelli per la PCR per amplificare un target più grande di ~ 2.100 bp (codifica blmp-1) o un target più piccolo di ~ 500 bp (codificando una parte di sma-10). Entrambi i metodi hanno prodotto con successo prodotti PCR appropriati (Figura 1A).

...

Discussione

Determinare i genotipi di C. elegans è un passo importante durante l'esecuzione di incroci genetici per creare nuovi ceppi di C. elegans . L'estrazione del DNA genomico utilizzando una o poche C. elegans è un passo cruciale nella genotipizzazione di C. elegans. Questo protocollo descrive l'estrazione del DNA genomico da C. elegans utilizzando un kit commerciale. Questo metodo è veloce e funziona in modo robusto. Il DNA genomico estratto con questo metodo può essere utilizz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP