Extração em pequena escala de Caenorhabditis elegans DNA genômico

Resumo

Apresentado aqui é uma descrição do isolamento simples e relativamente rápido de Caenorhabditis elegans DNA genômico de um ou poucos animais usando um kit de tecido comercialmente disponível. A preparação gDNA resultante é um modelo adequado para PCR.

Resumo

A extração de DNA genômico de um único ou alguns elegans de Caenorhabditis tem muitas aplicações a jusante, incluindo PCR para linhas de genotipagem, clonagem e sequenciamento. Os métodos tradicionais à base de proteínas à base de K para extração genômica de DNA de C. elegans levam várias horas. Kits de extração comercial que efetivamente quebram a cutícula C. elegans e extraem DNA genômico são limitados. Um método fácil, mais rápido (~15 min), e econômico de extrair DNA genômico C. elegans que funciona bem para aplicações em sala de aula e pesquisa é relatado aqui. Este método de extração de DNA é otimizado para usar nematoides únicos ou algumas larvas tardias (L4) ou nematoides adultos como material inicial para a obtenção de um modelo confiável para executar PCR. Os resultados indicam que a qualidade do DNA é adequada para amplificar alvos genéticos de diferentes tamanhos por PCR, permitindo genotipagem de animais únicos ou alguns, mesmo em diluições a um cinquenta do DNA genômico de um único adulto por reação. Os protocolos relatados podem ser usados de forma confiável para produzir rapidamente o modelo de DNA a partir de uma única ou uma pequena amostra de C. elegans para aplicações baseadas em PCR.

Introdução

Aqui, dois protocolos relacionados são apresentados para a lise de caenorhabditis elegans para tornar o DNA acessível para aplicações baseadas em PCR. PCR é uma técnica molecular comumente usada para muitas aplicações, incluindo genotipagem e amplificação de fragmentos de DNA para clonagem e sequenciamento, entre outras. A pequena (1 mm), lombriga de vida livre C. elegans é um sistema animal popular para pesquisa biológica. Obter DNA genômico adequado de um único animal ou alguns animais é suficiente para amplificar a sequência por PCR. Larvas L4 tardias e adultos contêm apenas ~1.000 células somáticas (incluindo algumas células multinucleares, poliploides), células germinativas, e (se o animal é uma hermafrodita gravid) prole no útero¹. No entanto, esses animais são protegidos por uma cutícula que deve ser interrompida para extrair o DNA genômico². Os métodos padrão para preparar o modelo de DNA genômico nematode para PCR envolvem múltiplas etapas e levam várias horas. Os animais são primeiro congelados em tampão de lise de verme contendo proteinase K (−70 °C ou abaixo) por pelo menos 15-45 min (mais tempo é recomendado por alguns protocolos)3,4,5,6. Este passo abre os animais.

Após o congelamento, os animais são incubados por 1h a 60-65 °C para o proteinase K funcionar, em seguida, a enzima é inativada por 15-30 min a 95 °C. O proteinase K destrói os núcleos que degradam o DNA. A inativação da proteinase K antes do PCR é importante para evitar que a proteinase K degrade a polimerase do DNA. Os dois protocolos baseados em kits descritos aqui são métodos rápidos, confiáveis e econômicos para extrair DNA genômico de um único animal ou alguns nematoides para pesquisas diárias e aplicações laboratoriais de ensino. O kit utilizado foi originalmente otimizado pelo fabricante para extrair DNA de tecido animal, saliva e cabelo⁷. Ele usa uma solução proprietária de preparação de tecidos e solução de extração para células de lise e torna o DNA genômico acessível. Uma solução proprietária de neutralização neutraliza então os componentes que podem inibir o PCR (por exemplo, sais, íons e moléculas de ligação Mg²⁺).

Ao genotipar, um único animal pode ser testado. Ao determinar se uma cepa é homozigosa, testar seis ou mais descendentes de um único animal dá alta confiança de que uma linha é homozigosa ou não (há uma chance de 0,02% de escolher aleatoriamente seis descendentes mutantes homozigos de um pai heterozigoso [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Este método 1) é simples, com menos passos do que o método proteinase K, e 2) diminui o tempo de preparação do modelo para 15 min. Os resultados deste trabalho demonstram que o protocolo desenvolvido funciona robustamente na extração de DNA genômico de um único ou poucos worms, que podem ser usados de forma confiável para aplicações a jusante que não requerem DNA altamente purificado, incluindo PCR.

Protocolo

1. C. elegans manutenção

NOTA: As cepas N2 (tipo selvagem) e blmp-1(tm548) C. elegans foram mantidas nas placas padrão de nematode growth media (NGM) a 20 °C.

1. Prepare as placas de NGM dissolvendo 23,005 g de pó NGM em 973 mL de água em um frasco de 2 L. Cubra a abertura do frasco com papel alumínio (ou tampa autoclavável que permita a ventilação) e fixe a cobertura com fita autoclave. Autoclave para dissolver o pó e esterilizar o conteúdo com um ciclo de esterilização de pelo menos 30 min.
2. Esfrie o médio a 60 °C em banho-maria.
3. Ao meio resfriado, adicione 25 mL de fosfato estéril de 1 M (KH₂PO₄), pH 6.0; 1 mL de solução de cloreto de cálcio de 1 M; e 1 mL de solução de sulfato de magnésio de 1 M.
4. Mexa o meio em uma placa de mexida magnética para obter uma mistura homogênea e para evitar o resfriamento e a solidificação irregulares (~5 min). Certifique-se de que a barra de rebuliço gire rápido o suficiente para criar um vórtice, mas não tão rápido que as bolhas sejam introduzidas (~250-300 rpm).
5. Despeje ~25 mL do meio em cada placa de Petri de 10 cm (~40 placas no total). Seque as placas à temperatura ambiente durante a noite (tipicamente 16-25 °C).
6. Cresça uma colônia de Escherichia coli OP50 em 30-50 mL de caldo LB durante a noite a 37 °C.
7. Semente cada placa com 500 μL de cultura E. coli OP50 e deixe-as secar em temperatura ambiente antes do uso (tipicamente 16-25 °C)⁸. Armazene as placas a 4 °C por até 3 semanas.
8. Transfira C. elegans para placas semeadas usando uma picareta de arame ou outro método e deixe-os crescer para L4 ou estágio adulto na temperatura necessária para a cepa (tipicamente 16-25 °C, 1-2 dias se os animais foram banhados famintos como dauers, 3-4 dias se os animais foram banhados como embriões)⁸.

2. Extração de DNA de um único verme

NOTA: Este método é útil para extrair DNA de um único verme (um verme em 1,8 μL de volume total). Uma mistura mestra pode ser feita se vários vermes serão lysed ao mesmo tempo.

1. Programe um termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).
2. Alíquota 0,8 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,2 μL da solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração. Misture por pipetação.
3. Identifique um L4 ou um animal adulto sob um microscópio dissecando⁹. Para identificar hermafroditas L4, procure uma vulva característica que seja visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Identifique hermafroditas adultas procurando os maiores animais na placa que podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.
4. Usando uma picareta de fio de platina, transfira o animal selecionado para a solução¹⁰.
5. Centrifugar o tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g) à temperatura ambiente para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo.
6. Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 2.1.
7. Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 0,8 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.
8. Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
9. Use diretamente o lise para PCR ou armazene-o a 4 °C ou −20 °C para uso futuro.
   NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses⁷.

3. Extração de DNA de alguns indivíduos

NOTA: Este método é útil para extrair DNA de alguns vermes. Uma mistura mestra pode ser preparada se várias cepas serão líssedas ao mesmo tempo.

1. Programe o termociclador para um ciclo a 55 °C por 10 min seguido de 95 °C para 3 min (programa de lise).
2. Alíquota 2,0 μL da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mL no gelo. Adicione 0,5 μL da solução de preparação tecidual do kit à solução de gotícula de extração. Misture por pipetação.
3. Identifique L4 ou animais adultos sob um microscópio de dissecação⁹. Hermafroditas L4 têm uma vulva característica que é visível como um meio-círculo pálido no meio do animal. Hermafroditas adultas são os maiores animais na placa e podem ter embriões ovais visíveis em seu útero.
4. Usando uma picareta de fio de platina, transfira alguns animais para a solução: 9 animais produzem 1 animal equivalente ao DNA genômico por 0,5 μL de lise, e 16 animais produzem ~1 animal equivalente ao DNA genômico em 0,25 μL (3,5 nematoides/μL)¹⁰.
   NOTA: É difícil transferir mais de 16 animais para este volume.
5. Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
6. Coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido na Etapa 3.1.
7. Quando o programa estiver completo, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Adicione 2 μL da solução de neutralização do kit à mistura. Misture por pipetação.
8. Centrifugar o tubo brevemente à temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm /2.000 × g).
9. Use diretamente a lise para PCR ou armazene-a a 4 °C ou −20 °C para uso futuro.
   NOTA: O DNA extraído é estável a 4 °C ou -20 °C por pelo menos 6 meses⁷.

4. Reação do PCR

NOTA: Uma aplicação a jusante desta técnica de lise de verme, detectando uma mutação de exclusão usando uma polimerase rápida, é descrita. A eficácia dos dois protocolos de lise de vermes na produção de DNA de modelo genômico para PCR bem sucedido em diluições a 1/^{50 de} um worm por reação também é demonstrada.

1. Extrair DNA de um único verme e 16 vermes usando cepas de n2 e mutantes do tipo selvagem, como descrito acima no Passo 2 e Passo 3.
2. Prepare diluições de 2, 10, 20 e 50 vezes de DNA de um único verme de animais N2 selvagens.
3. Configure as reações do PCR seguindo o protocolo do fabricante usando primers específicos para a sequência de interesse e mix mestre pcr de início quente (Tabela 1 e Tabela 2). Use 1 μL de DNA não diluído ou 2 μL de DNA diluído como modelo em cada reação.
4. Confirme os produtos PCR por eletroforese de gel e imagem¹¹.

Resultados

O DNA genômico de um único ou alguns adultos do tipo selvagem foi extraído usando o kit comercial ou o protocolo tradicional de lise para comparar a eficácia desses dois métodos. Esses lises foram então usados como modelos para PCR para amplificar um alvo maior de ~2.100 bp (codificação blmp-1) ou um alvo menor de ~500 bp (codificando uma parte do sma-10). Ambos os métodos produziram com sucesso produtos PCR apropriados (Figura 1A).

Em s...

Discussão

Determinar os genótipos de C. elegans é um passo importante ao realizar cruzes genéticas para criar novas cepas de C. elegans . Extração genômica de DNA usando um único ou pouco C. elegans é um passo crucial na genotipagem C. elegans. Este protocolo descreve a extração genômica de DNA de C. elegans usando um kit comercial. Este método é rápido e funciona de forma robusta. O DNA genômico extraído usando este método pode ser usado para aplicações a jusante, in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP