توليد الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية

Summary

نحن نصف بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية.

Abstract

يعتمد استكشاف الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة على سهولة العزلة والفعالية نحو التمايز وموثوقية ومتانة المصدر. نصف هنا بروتوكولا تدريجيا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة عن أنسجة الحبل السري البشري (uMSCs) ، وتنميطها المناعي ، وانتشار هذه الثقافات عبر عدة ممرات. في هذا الإجراء ، تكون صلاحية uMSCs عالية لأنه لا يوجد هضم إنزيمي. علاوة على ذلك ، فإن إزالة الأوعية الدموية ، بما في ذلك شرايين الحبل السري والوريد ، تضمن عدم وجود تلوث للخلايا ذات الأصل البطاني. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تكون uMSCs عند العزل CD45⁻CD34⁻ ، مما يشير إلى عدم وجود خلايا من سلالة المكونة للدم. الأهم من ذلك ، أنها تعبر عن علامات السطح الرئيسية ، CD105 ، CD90 ، و CD73. عند إنشاء الثقافات ، تصف هذه الورقة طريقة فعالة للحث على التمايز في هذه uMSCs في سلالة العضلات الهيكلية. يكشف تحليل مفصل للتقدم العضلي في uMSCs المتمايزة أن uMSCs تعبر عن Pax7 ، وهي علامة للأسلاف العضلية المنشأ في المراحل الأولية من التمايز ، تليها التعبير عن MyoD و Myf5 ، وأخيرا ، علامة تمايز طرفية ، سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC).

Introduction

يعود الفضل إلى الحبل السري البشري في امتلاك خزان قوي من الخلايا الجذعية الوسيطة ، والتي يتم استكشافها حاليا للعلاجات التجديدية بسبب معدلات انتشارها وتمايزها القوية ، وخصائصها المناعية ، وقدرتها على توليد الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث¹. يتكون نسيج الحبل السري من مقصورات متعددة مثل دم الحبل السري، وبطانة الوريد السري الفرعية، وهلام وارتون (WJ)، والذي يشمل في حد ذاته ثلاث مناطق غير واضحة - المنطقة المحيطة بالأوعية الدموية، والمنطقة بين الأوعية الدموية، والسلى الفرعي أو بطانة الحبل السري (CL)². في حين يمكن عزل uMSCs عن كل هذه المناطق المختلفة والتعبير على نطاق واسع عن علامات MSC الرئيسية ، لا يوجد وضوح حول ما إذا كانت هذه المقصورات تحتوي على نفس عدد السكان من uMSCs أو تعرض اختلافات في قدرات التمايز الخاصة بها³. وبالتالي ، تتطلب بروتوكولات عزل uMSCs دقة أكبر في أسلوبها ومنطقة عزلتها ، والتوصيف القوي لإمكانات التمايز ، وأخيرا ، تحليل مقارن من مقصورات مختلفة من الحبل.

في هذا السياق ، أظهرت دراسات قليلة اختلافات في إمكانات uMSC التكاثرية والتفاضلية بين أجزاء مختلفة من الحبل. ومن بين هذه الوسائل، كشفت التحليلات المقارنة بين uMSCs المعزولة من منطقتي CL و WJ عن إمكانات تكاثرية أكبر في uMSCs^{المشتقة} من CL ^3,4. وفي دراسة منفصلة، كان أداء uMSCs المشتقة من WJ أفضل في مقايسات الانتشار مقارنة بالخلايا المحيطة بالأوعية الدموية (HUCPV)⁵. عند فحص الاختلافات بين uMSCs المشتقة من دم الحبل السري و uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري الخالية من تلوث الأوعية الدموية ، تم الإبلاغ عن التعبير التفاضلي لعلامات MSC الرئيسية بين المقصورتين ، بالإضافة إلى زيادة معدلات الانتشار في uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل^{السري 6}.

من بين العديد من الدراسات التي تدرس إمكانات التمايز ل uMSCs في المقام الأول في أنسجة سلالة الأديم المتوسط مثل السلالات العظمية والشحمية والغضروفية ، قدم عدد قليل جدا بروتوكولات مفصلة للتمايز العضلي والتوصيف اللاحق ، بالإضافة إلى تحليلات مقارنة بين مقصورات الحبل المختلفة. في هذا السياق ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتمايز العضلات ولاحظنا أن uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري تظهر قدرات تمايز عضلي المنشأ متفوقة مقارنة بدم الحبل السري⁶. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول تدريجي لعزل uMSCs عن أنسجة الحبل السري بأكملها الخالية من الخلايا المرتبطة بالأوعية الدموية ، وتوصيفها ، وتمايزها في السلالة العضلية.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام أنسجة الحبل السري في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأبحاث الخلايا الجذعية (IC-SCR) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية ، ومعهد العلوم والتكنولوجيا الصحية الانتقالية (IEC-THSTI) ، ولجنة الأخلاقيات المؤسسية للمستشفى المدني ، جوروجرام ، هاريانا ، واللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية ، THSTI. تم حصاد عينات أنسجة الحبل السري البشري من الولادات الأجل في وقت الولادة. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص . تم تنفيذ جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة.

1. عزل MSCs من أنسجة الحبل السري

1. في وقت التسليم ، اقطع ما لا يقل عن 5 سم من الحبل ، ويفضل أن يكون أقرب إلى المشيمة ، وقم بتعقيم الحبل عن طريق مسح السطح الخارجي بنسبة 70٪ من الإيثانول. انقل قطعة أنسجة الحبل السري بالتتابع من أنبوب تجميع سعة 50 مل يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى أنبوب آخر يحتوي على نفس الشيء. انقل أنبوب التجميع الذي يحمل اسم الشخص على الجليد إلى المختبر في غضون 1 ساعة.
   ملاحظة: بالنسبة لدراسة أكبر، قد يكون من المفيد ترميز العينات بالباركود لتمكين تتبعها طوال فترة الدراسة. الأهم من ذلك ، يجب أن يعرض على جميع الموظفين الذين يتعاملون مع الأنسجة البشرية النظام الكامل للقاح التهاب الكبد B.
2. في المختبر، قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 25 دقيقة في غطاء محرك السيارة BSL-2 لتعقيم الأدوات والماصات المعقمة قبل الاستخدام.
3. انقل قطعة أنسجة الحبل السري من أنبوب التجميع إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة بحجم 10 سم 2 يحتوي على PBS غني بجلوكوز 5 جم / لتر ، وجنتاميسين 50 ميكروغرام / مل ، و^2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B ، و 100 U / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (مخطط في الشكل 1).
4. باستخدام مشرط ، قم بتقطيع أنسجة الحبل عموديا على طول محورها الطولي للحصول على قطعتين نصف أسطوانيتين. بسبب التواء الحبل والسطح المخاطي ، قم بتثبيت الأنسجة بزوج من الملقط في اليد الأخرى.
5. عند هذه النقطة، راقب الشرايين والوريد السري وأزل الأوعية الدموية باستخدام مشرط لكشطها في اتجاه واحد من السطح. شطف أنسجة الحبل السري مرة أخرى في PBS لإزالة جميع الدم المتبقي المرتبط بالأنسجة. تأكد من أن الكشط لطيف للحفاظ على سلامة الخلايا في WJ المحيطة بالأوعية.
6. افرم كل نصف من أنسجة الحبل السري إلى شظايا بحجم 0.5 سم³ سم وضع الشظايا مع السطح المضيء المواجه لأسفل على الطبق. احتضن الطبق لفترة وجيزة لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO₂.
7. بعد الحضانة ، قم بإغراق الطبق الذي يحتوي على قطع أنسجة الحبل السري ب 20 مل من الوسط الذي يحتوي على تعديل MEM Alpha بدون L-glutamine و ribo- و deoxyribonucleosides ، و 15٪ مصل بقري جنيني (غير معطل حراريا) ، و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. أضف وسط النمو بلطف على طول الجانبين لمنع إزالة الأنسجة من اتجاهها. أضف الوسط الزائد لحساب جزء سيتم امتصاصه بواسطة الأنسجة أثناء الحضانة.
8. بعد 3 أيام من الحضانة ، أضف وسيطا طازجا إلى الثقافات. تأكد من حماية الثقافات من الصدمات وحركة النباتات أثناء التعامل مع الأطباق.
9. بعد 1 أسبوع ، قم بإزالة شظايا الأنسجة بشكل فردي باستخدام ملقط معقم وتخلص منها باستخدام أكياس المخاطر البيولوجية المناسبة للتخلص منها. احتفظ بالوسط الموجود وأضف 10 مل من وسط النمو الطازج. استبدل وسيط النمو كل 4 أيام حتى تصل المستعمرات الفردية إلى التقاء 70٪.
   ملاحظة: من المحتمل ألا يتم توزيع الخلايا بشكل موحد في جميع أنحاء الطبق ، حيث ستكون هناك مستعمرات تكاثرية فردية تحتاج إلى مراقبة الالتقاء مع مرور الوقت. بشكل عام ، في غضون شهر ، يولد طبق 10 سم² خلايا كافية ليتم تقسيمها إلى طبق منفصل.
10. حصاد الخلايا الملتصقة باستخدام محلول التربسين / EDTA (1x 0.25٪ التربسين و 0.02٪ EDTA في محلول الملح المتوازن Hanks [HBSS]). الطرد المركزي تعليق الخلية في 470 × غرام لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وإعادة تعليق بيليه الخلية في وسط النمو.

2. التنميط المناعي وانتشار uMSCS

1. انتقل إلى التنميط المناعي بمجرد أن تصل الخلايا الملتصقة إلى التقاء 50٪ -60٪ وتنتشر بشكل جيد. لا تقم بإجراء تحليل علامة MSC على الثقافات المتقاربة بالكامل ، لأن هذا يميل إلى التسبب في انخفاض تنظيم علامات MSC الرئيسية.
2. بعد التربسين ، قم بتوزيع تعليق خلوي من 1 × 10⁶ خلايا / مل في أنابيب FACS (1 × 10⁵ خلايا / أنبوب) ووصمة عار بالأجسام المضادة المناسبة المرتبطة بالفلوروفور (كل تخفيف 1:50) في تركيبة : غير ملطخة ؛ CD105 + CD90 ؛ CD105 + CD73 ؛ CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (الفلوروفور الشائع) ؛ ضوابط النمط المتماثل لكل فلوروفور. سجل عددا إجماليا من الأحداث لا يقل عن 10000 على مقياس التدفق الخلوي لمزيد من التحليل.
   ملاحظة: نظرا لأنه يتم تحليل الخلايا لكل علامة سطح على حدة، فإن البوابات على المجموعات الفرعية للخلايا غير مطلوبة.
3. بالإضافة إلى العلامات المذكورة أعلاه ، تأكد من وجود علامات سطح إيجابية وسلبية في خطوط uMSC التي تم إنشاؤها من عينات أنسجة الحبل السري الفردية (الجدول 1).
4. تحليل الخلايا المصنفة بواسطة قياس التدفق الخلوي وتحديد النسبة المئوية لخلايا CD105 + CD90 ⁺ و CD105 + CD73 ⁺. تحليل خلايا CD105⁺ وCD34⁻CD45⁻ بشكل منفصل.

3. تمايز uMSCs إلى العضلات الهيكلية

1. قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة ب 0.01٪ من الكولاجين و 20 ميكروغرام / مل من اللامينين في PBS. قم بتغطية هذه اللوحات لمدة لا تقل عن 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
2. لوحة uMSCs بكثافة 10000 خلية / سم² في وسط النمو.
3. عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 70٪ ، قم بشفط وسط النمو وشطف الثقافات 2x باستخدام PBS. أضف وسط التمايز العضلي المنشأ (M1) الذي يتكون من DMEM + مصل الحصان 5٪ + 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون + 50 ميكرومتر هيدروكورتيزون إلى uMSCs. لتحديد حركية التقدم العضلي ، أضف وسط M1 كل يوم إلى الثقافات.
4. لتحديد حركية التقدم العضلي ، قم بتحليل uMSCs ل Pax7 و MyoD و Myogenin وتعبير MyHC في يومين و 4-5 أيام و 6-7 أيام و 10-14 يوما ، على التوالي.

النتائج

نجاح عزل uMSCs من أنسجة الحبل السري هو >95 ٪ ، على عكس معدلات النجاح الضعيفة من دم الحبل السري الكامل. عند العزل الناجح ل uMSCs ، يكشف تحليل FACS أن جميع الخلايا هي CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. ومع ذلك ، في التحليل المقارن ، تظهر uMSCs المعزولة من دم الحبل السري مجموعات غير متجانسة ، حيث تظهر ن...

Discussion

خطوات حاسمة
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في جمع الأنسجة في ظل ظروف معقمة ، من وقت التسليم إلى صيانة الثقافات المعقمة ، طوال مدة الانتشار. أثناء جمع الحبل ، من الضروري ألا يلمس الحبل أي سطح غير معقم ويتم مسحه خارجيا بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل جمعه في أنابيب تحتوي على ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL