Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie.

Zusammenfassung

Die Erforschung des therapeutischen Potenzials mesenchymaler Stammzellen hängt von der Leichtigkeit der Isolierung, der Potenz zur Differenzierung und der Zuverlässigkeit und Robustheit der Quelle ab. Wir beschreiben hier ein schrittweises Protokoll für die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe (uMSCs), deren Immunphänotypisierung und die Ausbreitung solcher Kulturen über mehrere Passagen. Bei diesem Verfahren ist die Lebensfähigkeit der uMSCs hoch, da keine enzymatische Verdauung stattfindet. Darüber hinaus stellt die Entfernung von Blutgefäßen, einschließlich der Nabelschnurarterien und der Vene, sicher, dass es keine Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs gibt. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie sind uMSCs bei der Isolierung CD45⁻CD34⁻, was auf eine Abwesenheit von Zellen aus der hämatopoetischen Linie hinweist. Wichtig ist, dass sie die Tastenoberflächenmarkierungen CD105, CD90 und CD73 ausdrücken. Nach der Etablierung von Kulturen beschreibt dieses Papier eine effiziente Methode, um die Differenzierung dieser uMSCs in die Skelettmuskellinie zu induzieren. Eine detaillierte Analyse der myogenen Progression in differenzierten uMSCs zeigt, dass uMSCs Pax7 exprimieren, einen Marker für myogene Vorläufer in den Anfangsstadien der Differenzierung, gefolgt von der Expression von MyoD und Myf5 und schließlich einem terminalen Differenzierungsmarker, Myosin Heavy Chain (MyHC).

Einleitung

Der menschlichen Nabelschnur wird ein robustes Reservoir mesenchymaler Stammzellen zugeschrieben, die derzeit aufgrund ihrer robusten Proliferations- und Differenzierungsraten, immunmodulatorischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, Zellen aus allen drei Keimschichten 1 zu erzeugen, für regenerative Therapien erforscht^werden. Das Nabelschnurgewebe besteht aus mehreren Kompartimenten wie dem Nabelschnurblut, dem Nabelvenensubendothel und dem Wharton-Gelee (WJ), das an sich drei ununterschiedliche Regionen umfasst - die perivaskuläre Zone, die intervaskuläre Zone und das Subamnion oder die Nabelschnurauskleidung (CL)². Während uMSCs aus all diesen verschiedenen Regionen isoliert werden können und wichtige MSC-Marker weitgehend ausdrücken, gibt es keine Klarheit darüber, ob diese Kompartimente die gleiche Population von uMSCs enthalten oder Unterschiede in ihren Differenzierungspotenzen^{aufweisen 3}. Daher erfordern Protokolle für die Isolierung von uMSCs eine größere Präzision in ihrem Modus und Bereich der Isolation, die robuste Charakterisierung von Differenzierungspotentialen und schließlich eine vergleichende Analyse aus verschiedenen Kompartimenten der Schnur.

In diesem Zusammenhang haben nur wenige Studien Unterschiede in den proliferativen und differenzativen Potentialen von uMSC zwischen verschiedenen Teilen der Schnur gezeigt. Von diesen ergaben vergleichende Analysen zwischen uMSCs, die aus den CL- und WJ-Regionen isoliert wurden, ein größeres Proliferationspotenzial in CL-abgeleiteten uMSCs ^3,4. In einer separaten Studie schnitten WJ-abgeleitete uMSCs in Proliferationsassays im Vergleich zu perivaskulären Zellen (HUCPV) besser ^ab.5. Bei der Untersuchung von Unterschieden zwischen aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs und aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs, die keine vaskuläre Kontamination aufweisen, wurde eine differentielle Expression der wichtigsten MSC-Marker zwischen den beiden Kompartimenten sowie erhöhte Proliferationsraten in Nabelschnurgewebe-abgeleiteten uMSCs^{berichtet 6}.

Von den verschiedenen Studien, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs hauptsächlich in Gewebe der Mesoderm-Linie wie osteogene, adipogene und chondrogene Linien untersuchen, haben nur sehr wenige detaillierte Protokolle für die myogene Differenzierung und anschließende Charakterisierung sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Nabelschnurkompartimenten geliefert. In diesem Zusammenhang haben wir ein robustes Muskeldifferenzierungsprotokoll entwickelt und beobachtet, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs im Vergleich zu Nabelschnurblut überlegene myogene Differenzierungsfähigkeiten^{aufweisen 6}. Hier wird ein schrittweises Protokoll für die Isolierung von uMSCs aus dem gesamten Nabelschnurgewebe ohne Zellen, die mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, ihre Charakterisierung und ihre Differenzierung in die myogene Linie detailliert beschrieben.

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Protokoll

Die Verwendung von Nabelschnurgewebe in dieser Studie wurde vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), dem Institutional Ethics Committee, dem Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), dem Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana, und dem Institutional Biosafety Committee, THSTI, genehmigt. Menschliche Nabelschnurgewebeproben wurden aus Terminlieferungen zum Zeitpunkt der Geburt entnommen. Von den Probanden wurde eine informierte schriftliche Zustimmung eingeholt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

1. Isolierung von MSCs aus Nabelschnurgewebe

1. Zum Zeitpunkt der Lieferung schneiden Sie mindestens 5 cm Schnur, vorzugsweise näher an der Plazenta, und sterilisieren Sie die Schnur, indem Sie die äußere Oberfläche mit 70% Ethanol abtupfen. Übertragen Sie das Stück Nabelschnurgewebe nacheinander von einem 50-ml-Sammelröhrchen, das phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält, zu einem anderen, das dasselbe enthält. Transportieren Sie das Sammelrohr mit dem Namen des Probanden auf Eis innerhalb von 1 Stunde ins Labor.
   HINWEIS: Bei einer größeren Studie kann es sinnvoll sein, die Proben mit einem Barcode zu versehen, um ihre Verfolgung während der gesamten Studie zu ermöglichen. Wichtig ist, dass allen Mitarbeitern, die mit menschlichem Gewebe umgehen, das vollständige Regime des Hepatitis-B-Impfstoffs angeboten wird.
2. Schalten Sie im Labor das UV für 25 Minuten in der BSL-2-Haube ein, um autoklavierte Instrumente und Pipetten vor dem Gebrauch zu sterilisieren.
3. Überführen Sie das Schnurgewebestück aus dem Entnahmeröhrchen in eine 10 cm 2 große mit Gewebekultur behandelte Schale, die PBS enthält, das mit 5 g/L Glukose, 50 μg/ml Gentamicin,^2,5 μg/ml Amphotericin B, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin angereichert ist (schematisch in Abbildung 1).
4. Schneiden Sie das Nabelschnurgewebe mit einem Skalpell vertikal entlang seiner Längsachse auf, um zwei halbzylindrische Stücke zu erhalten. Aufgrund der Nabelschnurtorsion und der Schleimhautoberfläche das Gewebe mit einer Pinzette in der anderen Hand festnageln.
5. Beobachten Sie an dieser Stelle die Nabelschnurarterien und die Vene und entfernen Sie die Blutgefäße, indem Sie sie mit einem Skalpell in eine Richtung von der Oberfläche abkratzen. Spülen Sie das Nabelschnurgewebe noch einmal in PBS, um das gesamte mit dem Gewebe verbundene Restblut zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Abkratzen schonend ist, um die Integrität der Zellen in der WJ, die die Gefäße umgibt, zu erhalten.
6. Zerkleinern Sie jede Hälfte des Schnurgewebes in 0,5 cm³ große Fragmente und legen Sie die Fragmente mit der luminalen Oberfläche nach unten auf die Schale. Brüten Sie die Schale kurz für 10 min in einer 37 °C befeuchteten Kammer, die 5% CO₂ enthält.
7. Nach der Inkubation die Schale mit den Nabelschnurgewebestücken mit 20 ml Medium, das MEM Alpha Modification ohne L-Glutamin, Ribo- und Desoxyribonukleoside, 15% fetales Rinderserum (nicht hitzeinaktiviert) und 50 μg/ml Gentamycin enthält, überfluten. Fügen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig an den Seiten hinzu, um zu verhindern, dass sich die Gewebeexplantationen von ihrer Orientierung lösen. Fügen Sie überschüssiges Medium hinzu, um einen Bruchteil zu berücksichtigen, der während der Inkubation von den Gewebeexplantaten aufgesaugt wird.
8. Nach 3 Tagen Inkubation frischen Medium zu den Kulturen hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Kulturen vor Stößen und Bewegungen der Explantate geschützt sind, während Sie mit dem Geschirr umgehen.
9. Nach 1 Woche die Gewebefragmente einzeln mit steriler Pinzette entfernen und mit geeigneten Biohazard-Beuteln zur Entsorgung entsorgen. Behalten Sie das vorhandene Medium bei und fügen Sie 10 ml frisches Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle 4 Tage, bis einzelne Kolonien einen Zusammenfluss von 70% erreichen.
   HINWEIS: Es ist wahrscheinlich, dass die Zellen nicht gleichmäßig in der Schale verteilt sind, da es einzelne proliferative Kolonien geben wird, die mit der Zeit auf Zusammenfluss überwacht werden müssen. Im Allgemeinen erzeugt eine 10 cm 2 große Schale innerhalb eines Monats genügend Zellen, um in eine separate^Schale aufgeteilt zu werden.
10. Ernten Sie die adhärenten Zellen mit Trypsin / EDTA-Lösung (1x 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Die Zellsuspension bei 470 × g für 5 min bei 25 °C zentrifugieren und das Zellpellet in Wachstumsmedium resuspendieren.

2. Immunphänotypisierung und Ausbreitung von uMSCS

1. Fahren Sie mit der Immunphänotypisierung fort, sobald die adhärenten Zellen einen Zusammenfluss von 50% -60% erreicht haben und gut verteilt sind. Führen Sie keine MSC-Markeranalyse für vollständig konfluente Kulturen durch, da dies tendenziell zu einer Herunterregulierung der wichtigsten MSC-Marker führt.
2. Nach der Trypsinisierung eine Zellsuspension von 1 × 10⁶ Zellen/ml in FACS-Röhrchen (1 × 10⁵ Zellen/Röhrchen) verteilen und mit geeigneten fluorophorgebundenen Antikörpern (alle 1:50-Verdünnung) in Kombination anfärben: ungefärbt; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (gewöhnlicher Fluorophor); Isotypkontrollen für jedes Fluorophor. Zeichnen Sie eine Gesamtzahl von Ereignissen von mindestens 10.000 auf dem Durchflusszytometer zur weiteren Analyse auf.
   HINWEIS: Da die Zellen für jeden Oberflächenmarker separat analysiert werden, ist kein Gating auf Zellteilmengen erforderlich.
3. Zusätzlich zu den oben genannten Markern ist das Vorhandensein positiver und negativer Oberflächenmarker in uMSC-Linien zu bestätigen, die aus einzelnen Nabelschnurgewebeproben erstellt wurden (Tabelle 1).
4. Analysieren Sie die markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie den Prozentsatz der CD105 + ^{CD90 + -} und CD105 + CD73 ⁺ -Zellen. Analysieren Sie CD105⁺ und CD34⁻CD45⁻ Zellen separat.

3. Differenzierung von uMSCs in Skelettmuskulatur

1. Beschichten Sie Gewebekulturplatten mit 0,01% Kollagen und 20 μg/ml Laminin in PBS. Beschichten Sie diese Platten für mindestens 4 h bei Raumtemperatur.
2. Platte uMSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen/^cm2 in Wachstumsmedium.
3. Wenn die Zellen zu 70% konfluent sind, saugen Sie das Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Kulturen 2x mit PBS aus. Fügen Sie den uMSCs myogenes Differenzierungsmedium (M1) hinzu, das aus DMEM + 5% Pferdeserum + 0,1 μM Dexamethason + 50 μM Hydrocortison besteht. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag M1-Medium hinzu.
4. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, analysieren Sie uMSCs für Pax7, MyoD, Myogenin und MyHC-Expression nach 2 Tagen, 4-5 Tagen, 6-7 Tagen bzw. 10-14 Tagen.

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Ergebnisse

Der Erfolg der Isolierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe beträgt >95%, im Gegensatz zu den schlechten Erfolgsraten von Nabelschnurblut. Nach erfolgreicher Isolierung von uMSCs zeigt die FACS-Analyse, dass alle Zellen CD34^−CD45−CD105⁺CD90⁺ sind. In der vergleichenden Analyse zeigen uMSCs, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, jedoch heterogene Populationen, wobei ein Teil der Zellen CD34 + CD45 + CD105 ⁺ (~ 15%) aufweist. Darüber hinaus...

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Diskussion

Kritische Schritte
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von Gewebe unter aseptischen Bedingungen, vom Zeitpunkt der Lieferung bis zur Aufrechterhaltung steriler Kulturen, für die gesamte Dauer der Vermehrung. Während der Schnursammlung ist es wichtig, dass die Schnur keine nicht sterilisierte Oberfläche berührt und extern mit 70% Ethanol abgewischt wird, bevor sie in mit Antibiotika ergänzten Röhrchen, die PBS enthalten, gesammelt wird. Es ist wichtig, die Zeit zwischen de...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL