Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique

Résumé

Nous décrivons un protocole pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation dans la lignée musculaire squelettique.

Résumé

L’exploration du potentiel thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses dépend de la facilité d’isolement, de la puissance vers la différenciation, ainsi que de la fiabilité et de la robustesse de la source. Nous décrivons ici un protocole par étapes pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain (cSM), leur immunophénotypage et la propagation de telles cultures sur plusieurs passages. Dans cette procédure, la viabilité des uMSC est élevée car il n’y a pas de digestion enzymatique. De plus, l’ablation des vaisseaux sanguins, y compris les artères du cordon ombilical et la veine, garantit qu’il n’y a pas de contamination des cellules d’origine endothéliale. En utilisant la cytométrie en flux, les cSEm lors de l’isolement sont CD45⁻CD34⁻, ce qui indique une absence de cellules de la lignée hématopoïétique. Il est important de noter qu’ils expriment les marqueurs de surface clés, CD105, CD90 et CD73. Lors de l’établissement des cultures, cet article décrit une méthode efficace pour induire la différenciation de ces uMSC dans la lignée musculaire squelettique. Une analyse détaillée de la progression myogénique dans les uMSC différenciés révèle que les uMSC expriment Pax7, un marqueur des progéniteurs myogéniques dans les premiers stades de différenciation, suivis de l’expression de MyoD et Myf5, et, enfin, d’un marqueur de différenciation terminal, la chaîne lourde de myosine (MyHC).

Introduction

Le cordon ombilical humain a été crédité de posséder un réservoir robuste de cellules souches mésenchymateuses, qui sont actuellement explorées pour les thérapies régénératives en raison de leurs taux de prolifération et de différenciation robustes, de leurs propriétés immunomodulatrices et de leur capacité à générer des cellules à partir des trois couches germinales¹. Le tissu du cordon ombilical se compose de plusieurs compartiments tels que le sang de cordon ombilical, le sous-endothélium de la veine ombilicale et la gelée de Wharton (WJ), qui englobe en soi trois régions indistinctes: la zone périvasculaire, la zone intervasculaire et le sous-amnion ou la muqueuse du cordon (CL)². Bien que les uMSC puissent être isolés de toutes ces différentes régions et exprimer largement les marqueurs clés du MSC, il n’est pas clair si ces compartiments contiennent la même population d’uMSC ou présentent des différences dans leurs puissances de différenciation³. Par conséquent, les protocoles d’isolement des uMSC nécessitent une plus grande précision dans leur mode et leur région d’isolement, la caractérisation robuste des potentiels de différenciation et, enfin, une analyse comparative à partir de différents compartiments du cordon.

Dans ce contexte, peu d’études ont démontré des différences dans les potentiels prolifératifs et différentiatifs de l’uMSC entre les différentes parties du cordon. Parmi ceux-ci, des analyses comparatives entre des uMSC isolés des régions CL et WJ ont révélé un plus grand potentiel prolifératif dans les uMSC dérivés de CL ^3,4. Dans une étude distincte, les uMSC dérivés du WJ ont obtenu de meilleurs résultats dans les essais de prolifération que les cellules périvasculaires (HUCPV)⁵. Lors de l’examen des différences entre les cSEm dérivés du sang de cordon et les cSEm dérivés du tissu de cordon ombilical dépourvus de contamination vasculaire, une expression différentielle des marqueurs clés du CSM a été rapportée entre les deux compartiments, ainsi qu’une augmentation des taux de prolifération dans les cSEm dérivés du tissu du cordon⁶.

Parmi les nombreuses études examinant les potentiels de différenciation des cSEm principalement dans les tissus de la lignée mésodermique tels que les lignées ostéogéniques, adipogéniques et chondrogènes, très peu ont fourni des protocoles détaillés pour la différenciation myogénique et la caractérisation ultérieure, ainsi que des analyses comparatives entre divers compartiments du cordon. Dans ce contexte, nous avons développé un protocole robuste de différenciation musculaire et observé que les uMSC dérivés du tissu du cordon présentaient des capacités de différenciation myogénique supérieures à celles du sang de cordon⁶. Ici, un protocole par étapes est détaillé pour l’isolement des uMSC de l’ensemble du tissu du cordon dépourvu de cellules associées au système vasculaire, leur caractérisation et leur différenciation dans la lignée myogénique.

Protocole

L’utilisation du tissu de cordon ombilical dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel pour la recherche sur les cellules souches (IC-SCR), le Comité d’éthique institutionnelle, l’Institut translationnel des sciences et de la technologie de la santé (IEC-THSTI), le Comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital civil de Gurugram, Haryana, et le Comité institutionnel de biosécurité, THSTI. Des échantillons de tissu de cordon humain ont été prélevés lors d’accouchements à terme au moment de la naissance. Le consentement écrit éclairé a été obtenu des sujets. Toutes les méthodes ont été mises en œuvre conformément aux directives et réglementations pertinentes.

1. Isolement des CSM du tissu du cordon ombilical

1. Au moment de l’accouchement, coupez au moins 5 cm de cordon, de préférence plus près du placenta, et stérilisez le cordon en frottant la surface extérieure avec de l’éthanol à 70%. Transférer séquentiellement le morceau de tissu de cordon d’un tube de collecte de 50 mL contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un autre contenant la même chose. Transporter le tube de collecte portant le nom du sujet sur glace jusqu’au laboratoire dans un délai de 1 h.
   REMARQUE: Pour une étude plus vaste, il peut être utile de code-barres des échantillons pour permettre leur suivi tout au long de l’étude. Il est important de noter que tout le personnel manipulant des tissus humains devrait se voir offrir le schéma thérapeutique complet du vaccin contre l’hépatite B.
2. En laboratoire, allumez l’UV pendant 25 minutes dans la hotte BSL-2 pour stériliser les instruments et les pipettes autoclavés avant utilisation.
3. Transférer le morceau de tissu de cordon du tube de collecte dans une boîte de 10 cm² traitée par culture tissulaire contenant du PBS enrichi en 5 g/L de glucose, 50 μg/mL de gentamicine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine B, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (schéma à la figure 1).
4. À l’aide d’un scalpel, trancher le tissu du cordon verticalement le long de son axe longitudinal pour obtenir deux demi-pièces cylindriques. En raison de la torsion du cordon et de la surface mucoïde, épinglez le tissu avec une paire de pinces tenues dans l’autre main.
5. À ce stade, observez les artères ombilicales et la veine et retirez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un scalpel pour les gratter dans une direction de la surface. Rincez à nouveau le tissu du cordon ombilical dans le PBS pour éliminer tout le sang résiduel associé au tissu. Assurez-vous que le raclage est doux pour préserver l’intégrité des cellules dans le WJ entourant les vaisseaux.
6. Hacher chaque moitié du tissu du cordon en fragments de 0,5 cm^{de 3} tailles et placer les fragments avec la surface luminale vers le bas sur le plat. Incuber brièvement le plat pendant 10 min dans une chambre humidifiée à 37 °C contenant 5 % de CO₂.
7. Après l’incubation, inonder la boîte contenant les morceaux de tissu du cordon avec 20 mL de milieu contenant MEM Alpha Modification sans L-glutamine, ribo- et désoxyribonucléosides, 15% de sérum bovin fœtal (non inactivé par la chaleur) et 50 μg / mL de gentamycine. Ajouter doucement le milieu de croissance le long des côtés pour éviter que les explantes tissulaires ne soient délogées de leur orientation. Ajouter l’excès de milieu pour tenir compte d’une fraction qui sera absorbée par les explantes tissulaires pendant l’incubation.
8. Après 3 jours d’incubation, ajoutez du milieu frais aux cultures. Assurez-vous que les cultures sont protégées des chocs et des mouvements des explants lors de la manipulation de la vaisselle.
9. Après 1 semaine, retirez les fragments de tissu individuellement à l’aide d’une pince stérile et jetez-les à l’aide de sacs appropriés pour l’élimination. Conserver le milieu existant et ajouter 10 mL de milieu de croissance frais. Remplacez le milieu de croissance tous les 4 jours jusqu’à ce que les colonies individuelles atteignent une confluence de 70%.
   REMARQUE: Il est probable que les cellules ne seront pas réparties uniformément dans tout le plat, car il y aura des colonies prolifératives individuelles qui devront être surveillées pour la confluence avec le temps. Généralement, en un mois, un plat de 10 cm² génère suffisamment de cellules pour être divisé en un plat séparé.
10. Récoltez les cellules adhérentes à l’aide d’une solution de trypsine/EDTA (1x 0,25% de trypsine et 0,02% d’EDTA dans la solution saline équilibrée de Hanks [HBSS]). Centrifuger la suspension cellulaire à 470 × g pendant 5 min à 25 °C et remettre la pastille cellulaire en milieu de croissance.

2. Immunophénotypage et propagation de l’uMSCS

1. Procéder à l’immunophénotypage une fois que les cellules adhérentes ont atteint 50% à 60% de confluence et sont bien réparties. N’effectuez pas d’analyse des marqueurs MSC sur des cultures entièrement confluentes, car cela tend à provoquer une régulation négative des marqueurs MSC clés.
2. Après la trypsinisation, distribuer une suspension cellulaire de 1 × 10⁶ cellules/mL dans des tubes FACS (1 × 10⁵ cellules/tube) et la coloration avec des anticorps appropriés liés aux fluorophores (tous dilutions 1:50) en combinaison : non colorés ; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluorophore commun); contrôles d’isotype pour chaque fluorophore. Enregistrez un nombre total d’événements d’au moins 10 000 sur le cytomètre en flux pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : Étant donné que les cellules sont analysées séparément pour chaque marqueur de surface, il n’est pas nécessaire de contrôler les sous-ensembles de cellules.
3. En plus des marqueurs ci-dessus, confirmer la présence de marqueurs de surface positifs et négatifs dans les lignes uMSC créées à partir d’échantillons individuels de tissu de cordon (tableau 1).
4. Analysez les cellules marquées par cytométrie en flux et déterminez le pourcentage de cellules CD105⁺CD90⁺ et CD105⁺CD73⁺ . Analysez séparément les cellules CD105⁺ et CD34⁻CD45⁻ .

3. Différenciation des cSM en muscle squelettique

1. Enduire les plaques de culture tissulaire avec 0,01% de collagène et 20 μg/mL de laminine dans le PBS. Enduisez ces plaques pendant au moins 4 h à température ambiante.
2. Plaque uMSC à une densité de 10 000 cellules/^cm2 en milieu de croissance.
3. Lorsque les cellules sont confluentes à 70%, aspirez le milieu de croissance et rincez les cultures 2x avec du PBS. Ajouter au CSM un milieu de différenciation myogénique (M1) composé de DMEM + 5 % de sérum de cheval + 0,1 μM de dexaméthasone + 50 μM d’hydrocortisone. Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, ajouter le milieu M1 tous les deux jours aux cultures.
4. Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, analysez les cSM pour l’expression de Pax7, MyoD, Myogénine et MyHC à 2 jours, 4-5 jours, 6-7 jours et 10-14 jours, respectivement.

Résultats

Le succès de l’isolement des cSUm du tissu du cordon ombilical est >95%, contrairement aux faibles taux de réussite du sang de cordon entier. Une fois l’isolement réussi des cSEm, l’analyse FACS révèle que toutes les cellules sont CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. Cependant, dans l’analyse comparative, les cSEm isolés du sang de cordon présentent des populations hétérogènes, dans lesquelles une proportion de cellules présentent CD34 ⁺ CD45 ⁺ CD...

Discussion

Étapes critiques
Une étape critique de ce protocole est la collecte de tissus dans des conditions aseptiques, du moment de l’accouchement au maintien des cultures stériles, pendant toute la durée de la propagation. Lors de la collecte du cordon, il est essentiel que le cordon ne touche aucune surface non stérilisée et soit tamponné à l’extérieur avec de l’éthanol à 70% avant d’être collecté dans des tubes contenant du PBS complété par des antibiotiques. Il est important de limit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL