Geração de Células-Tronco Mesenquimal do Tecido do Cordão Umbilical Humano e sua Diferenciação na Linhagem Muscular Esquelética

Resumo

Descrevemos um protocolo para o isolamento das células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e sua diferenciação na linhagem muscular esquelética.

Resumo

Explorar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais depende da facilidade de isolamento, potência em direção à diferenciação e confiabilidade e robustez da fonte. Descrevemos aqui um protocolo stepwise para o isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano (uMSCs), sua imunofenofoteca, e a propagação de tais culturas ao longo de várias passagens. Neste procedimento, a viabilidade dos MOSCs é alta porque não há digestão enzimática. Além disso, a remoção dos vasos sanguíneos, incluindo as artérias do cordão umbilical e a veia, garante que não haja contaminação de células de origem endotelial. Usando citometria de fluxo, os uMSCs no isolamento são CD45-CD34⁻, indicando ausência de células da linhagem hematopoiética. É importante ressaltar que eles expressam marcadores de superfície chave, CD105, CD90 e CD73. Após o estabelecimento de culturas, este artigo descreve um método eficiente para induzir a diferenciação nesses FUSÕES na linhagem muscular esquelética. Uma análise detalhada da progressão miogênica em uMSCs diferenciados revela que os uMSCs expressam Pax7, um marcador para progenitores miogênicos nos estágios iniciais de diferenciação, seguido pela expressão de MyoD e Myf5, e, finalmente, um marcador de diferenciação terminal, cadeia pesada de miosina (MyHC).

Introdução

O cordão umbilical humano foi creditado por possuir um robusto reservatório de células-tronco mesenquimais, que atualmente estão sendo exploradas para terapias regenerativas devido às suas robustas taxas de proliferação e diferenciação, propriedades imunomodulatórias e capacidade de gerar células de todas as três camadas germinativas¹. O tecido do cordão umbilical consiste em múltiplos compartimentos, como o sangue do cordão umbilical, o subendotélio da veia umbilical e a geleia de Wharton (WJ), que por si só abrange três regiões indistintas - a zona perivascular, a zona intervascular e o subameamento ou o revestimento do cordão (CL)². Embora os MSCs possam ser isolados de todas essas diferentes regiões e expressem amplamente os principais marcadores MSC, não há clareza sobre se esses compartimentos contêm a mesma população de uMSCs ou apresentam diferenças em suas potências de diferenciação³. Assim, os protocolos para o isolamento dos UMSCs requerem maior precisão em seu modo e região de isolamento, a caracterização robusta de potenciais de diferenciação e, finalmente, uma análise comparativa de diferentes compartimentos do cabo.

Nesse contexto, poucos estudos demonstraram diferenças nos potenciais proliferativos e diferenciais do UMSC entre diferentes partes do cabo. Destes, análises comparativas entre os RCSS isolados das regiões cl e WJ revelaram maior potencial de proliferação em UMSCs^derivados da CL ^3,4. Em um estudo separado, os UMSCs derivados do WJ tiveram melhor desempenho em ensaios de proliferação em comparação com células perivasculares (HUCPV)⁵. Ao examinar diferenças entre os UMSCs derivados do sangue do cordão e os UMSCs derivados do tecido do cordão desprovidos de contaminação vascular, foi relatada expressão diferencial dos principais marcadores MSC entre os dois compartimentos, bem como o aumento das taxas de proliferação nos UMSCs derivados do tecido do cordão⁶.

Dos diversos estudos que examinam os potenciais de diferenciação dos MICOSCs principalmente em tecidos da linhagem de mesoderm, como linhagenia, adipogênica e linhagenia, muito poucos forneceram protocolos detalhados para diferenciação miogênica e caracterização subsequente, bem como análises comparativas entre vários compartimentos de cordão. Neste contexto, desenvolvemos um robusto protocolo de diferenciação muscular e observamos que os uMSCs derivados do tecido do cordão apresentam capacidades de diferenciação miogênica superiores em comparação com o sangue do cordão^{umbilical 6}. Aqui, um protocolo stepwise é detalhado para o isolamento de uMSCs de todo o tecido do cordão umbilical desprovido de células associadas à vasculatura, sua caracterização e sua diferenciação na linhagem miogênica.

Protocolo

O uso de tecido do cordão umbilical neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Pesquisa de Células-Tronco (IC-SCR), pelo Comitê de Ética Institucional, Instituto Translacional de Ciência e Tecnologia em Saúde (IEC-THSTI), pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Civil, Gurugram, Haryana e pelo Comitê de Biossegurança Institucional, THSTI. Amostras de tecido do cordão humano foram colhidas a partir de partos a termo no momento do nascimento. O consentimento por escrito informado foi obtido dos sujeitos. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes.

1. Isolamento de MSCs do tecido do cordão umbilical

1. No momento da entrega, corte pelo menos 5 cm de cabo, de preferência mais próximo da placenta, e esterilize o cabo limpando a superfície externa com 70% de etanol. Transfira o pedaço do tecido do cordão um tubo de coleta de 50 mL contendo soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para outro contendo o mesmo. Transporte o tubo de coleta com o nome do sujeito no gelo para o laboratório dentro de 1h.
   NOTA: Para um estudo maior, pode ser útil fazer código de barras nas amostras para permitir seu rastreamento ao longo do estudo. É importante ressaltar que todo o pessoal que manuseia tecidos humanos deve ser oferecido o regime completo da vacina contra hepatite B.
2. No laboratório, ligue o UV por 25 min no capô BSL-2 para esterilizar instrumentos autoclaved e pipetas antes de usar.
3. Transfira a peça do tecido do cabo do tubo de coleta para um prato tratado com cultura de tecido de 10 cm² contendo PBS enriquecido com 5 g/L de glicose, 50 μg/mL gentamicina, 2,5 μg/mL de anfotoricina B, penicilina U/mL e 100 μg/mL streptomicy (esquema na Figura 1).
4. Usando um bisturi, corte o tecido do cordão verticalmente ao longo de seu eixo longitudinal para obter duas peças cilíndricas. Devido à torção do cordão e à superfície mucoide, fixe o tecido com um par de fórceps presos na outra mão.
5. Neste ponto, observe as artérias umbilicais e a veia e remova os vasos sanguíneos usando um bisturi para raspá-los em uma direção da superfície. Enxágüe o tecido do cordão umbilical mais uma vez em PBS para remover todo o sangue residual associado ao tecido. Certifique-se de que a raspagem é suave para preservar a integridade das células no WJ ao redor dos vasos.
6. Pique cada metade do tecido do cordão em fragmentos do tamanho de 0,5 cm³ e coloque os fragmentos com a superfície luminal voltada para baixo sobre o prato. Incubar o prato brevemente por 10 min em uma câmara umidificada de 37 °C contendo 5% de CO₂.
7. Após a incubação, inunde o prato contendo as peças de tecido do cordão com 20 mL de médio contendo MEM Alpha Modification sem L-glutamina, ribo-e desoxyribonucleosídeos, 15% soro bovino fetal (não inativado pelo calor) e 50 μg/mL gentamicina. Adicione o meio de crescimento suavemente ao longo dos lados para evitar que as explantas teciduais sejam desalojadas de sua orientação. Adicione o excesso de meio para contabilizar uma fração que será absorvida pelas explantas teciduais durante a incubação.
8. Após 3 dias de incubação, adicione meio fresco às culturas. Certifique-se de que as culturas estão protegidas contra choques e movimento das explantas enquanto manuseam os pratos.
9. Após 1 semana, remova os fragmentos de tecido individualmente usando fórceps estéreis e descarte usando sacos de risco biológico apropriados para descarte. Mantenha o meio existente e adicione 10 mL de meio de crescimento fresco. Substitua o meio de crescimento a cada 4 dias até que colônias individuais atinjam uma confluência de 70%.
   NOTA: É provável que as células não sejam distribuídas uniformemente por todo o prato, pois haverá colônias proliferativas individuais que precisam ser monitoradas para confluência com o tempo. Geralmente, dentro de um mês, um prato de 10 cm² gera células suficientes para ser dividido em um prato separado.
10. Colher as células aderentes usando a solução trypsin/EDTA (1x 0,25% trypsin e 0,02% EDTA em Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugar a suspensão celular a 470 × g por 5 min a 25 °C e resuspensar a pelota celular em meio de crescimento.

2. Imunofenoftipagem e propagação de uMSCS

1. Prossiga para a imunofenoftipagem uma vez que as células aderentes atingiram 50%-60% de confluência e estão bem espalhadas. Não realize análises de marcadores MSC em culturas totalmente confluentes, pois isso tende a causar a queda dos principais marcadores MSC.
2. Após a trypsinização, distribua uma suspensão celular de 1 × 10⁶ células/mL em tubos FACS (1 × 10⁵ células/tubo) e colorir com anticorpos ligados ao fluoróforo apropriados (todas as 1:50 diluição) em combinação: não manchadas; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoróforo comum); controles de isótipo para cada fluoróforo. Registo de um número total de eventos de pelo menos 10.000 no citômetro de fluxo para análise posterior.
   NOTA: Uma vez que as células são analisadas para cada marcador de superfície separadamente, o gating em subconjuntos celulares não é necessário.
3. Além dos marcadores acima, confirme a presença de marcadores de superfície positivos e negativos nas linhas uMSC criadas a partir de amostras individuais de tecido do cordão (Tabela 1).
4. Analise as células rotuladas por citometria de fluxo e determine a porcentagem das células CD105⁺CD90⁺ e CD105⁺CD73⁺+ Analise as células CD105⁺ e CD34-CD45⁻ separadamente.

3. Diferenciação de uMSCs em músculo esquelético

1. Placas de cultura de tecido de revestimento com 0,01% de colágeno e 20 μg/mL laminina na PBS. Cubra estas placas por um mínimo de 4h em temperatura ambiente.
2. UMSCs de placa a uma densidade de 10.000 células/cm² em meio de crescimento.
3. Quando as células são 70% confluentes, aspiram o meio de crescimento e enxaguam as culturas 2x com PBS. Adicionar meio de diferenciação miogênica (M1) composto por DMEM + 5% de soro de cavalo + 0,1 μM dexametasona + 50 μM hidrocortisona aos uMSCs. Para determinar a cinética da progressão miogênica, adicione m1 médio a cada dois dias às culturas.
4. Para determinar a cinética da progressão miogênica, analise uMSCs para pax7, myogenina e myhc expressão em 2 dias, 4-5 dias, 6-7 dias e 10-14 dias, respectivamente.

Resultados

O sucesso do isolamento dos UMSCs do tecido do cordão umbilical é >95%, ao contrário das baixas taxas de sucesso do sangue do cordão umbilical. Após o isolamento bem-sucedido dos uMSCs, a análise facs revela que todas as células são CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. No entanto, na análise comparativa, os ICSS isolados do sangue do cordão umbilical apresentam populações heterogêneas, em que uma proporção de células mostram CD34⁺CD45⁺CD105⁺

Discussão

Passos críticos
Um passo crítico neste protocolo é a coleta de tecido em condições assépticas, desde o momento da entrega até a manutenção de culturas estéreis, durante toda a duração da propagação. Durante a coleta do cabo, é essencial que o cabo não toque em nenhuma superfície não esterilizada e seja examinado externamente com 70% de etanol antes da coleta em tubos contendo PBS complementados com antibióticos. É importante limitar o tempo entre a coleta do cabo e o processamento ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL