从人脐带组织中生成间充质干细胞及其分化为骨骼肌谱系

摘要

我们描述了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞并将其分化为骨骼肌谱系的方案。

摘要

探索间充质干细胞的治疗潜力取决于分离的难易程度，分化的效力以及来源的可靠性和稳健性。我们在这里描述了一种逐步方案，用于从人脐带组织（uMSCs）中分离间充质干细胞，其免疫表型以及这种培养物在几段传代中的繁殖。在这个过程中，uMSCs的存活率很高，因为没有酶消化。此外，去除血管，包括脐带动脉和静脉，确保内皮来源的细胞没有污染。使用流式细胞术，分离时的 uMSC 为 CD45⁻CD34⁻，表明造血谱系中没有细胞。重要的是，它们表达了关键的表面标记，CD105，CD90和CD73。在建立培养物后，本文描述了一种诱导这些uMSC分化成骨骼肌谱系的有效方法。对分化 uMSC 中肌源性进展的详细分析显示，uMSCs 表达 Pax7（分化初始阶段肌源祖细胞的标志物），其次是 MyoD 和 Myf5 的表达，最后是终末分化标志物肌球蛋白重链 （MyHC）。

引言

人类脐带被认为具有强大的间充质干细胞库，由于其强大的增殖和分化速率，免疫调节特性以及从所有三个胚层生成细胞的能力，目前正在探索再生疗法¹。脐带组织由多个区室组成，如脐带血、脐静脉内皮下和沃顿果冻（WJ），其本身包括三个模糊区域 - 血管周围区，血管间区和羊膜下或脐带衬里（CL）²。虽然uMSC可以从所有这些不同的区域中分离出来，并广泛地表达关键的MSC标记物，但这些区室是否包含相同的uMSC群体或显示其分化效力的差异^{尚不清楚3}。因此，uMSC的隔离方案需要在其隔离模式和区域中具有更高的精度，对分化电位进行可靠的表征，最后需要对脐带的不同隔室进行比较分析。

在这种情况下，很少有研究表明，脐带不同部位之间的uMSC增殖和鉴别电位存在差异。其中，从CL和WJ区域分离的uMSC之间的比较分析显示，CL衍生的uMSCs^3，4具有更大的增殖潜力。在另一项研究中，与血管周围细胞（HUCPV）相比，WJ衍生的uMSCs在增殖测定中表现更好⁵。在检查脐带血来源的uMSCs和没有血管污染的脐带组织来源的umMSC之间的差异时，报告了两个区室之间关键MSC标志物的差异表达，以及脐带组织来源的umSCCs⁶的增殖速率增加。

在几项研究 uMSC 主要在中胚层谱系组织（如成骨性、脂肪原性和软骨成因谱系）中的分化潜力的研究中，很少有研究提供肌源分化和后续表征的详细方案，以及各种脐带区室之间的比较分析。在这种情况下，我们开发了一种强大的肌肉分化方案，并观察到与脐带血⁶相比，脐带组织衍生的uMSC显示出优越的肌源分化能力。在这里，详细描述了从整个脐带组织中分离uMSCs的逐步方案，这些组织没有与脉管系统相关的细胞，它们的表征以及它们分化成肌源谱系。

研究方案

本研究中脐带组织的使用得到了干细胞研究机构委员会（IC-SCR），机构伦理委员会，转化健康科学与技术研究所（IEC-THSTI），哈里亚纳邦古尔冈市公民医院机构伦理委员会和机构生物安全委员会THSTI的批准。在出生时从足月分娩中采集人脐带组织样本。从受试者那里获得知情书面同意。所有方法均按照相关准则和规定进行。

1. 从脐带组织中分离间充质干细胞

1. 在分娩时，切下至少5厘米的脐带，最好靠近胎盘，并通过用70%乙醇擦拭外表面来消毒脐带。将脐带组织块从一个含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的50mL收集管依次转移到另一个含有相同盐水的50mL收集管中。在1小时内将带有冰上受试者姓名的收集管运输到实验室。
   注意:对于大型研究，对样本进行条形码以使其能够在整个研究中进行跟踪可能很有用。重要的是，所有处理人体组织的人员都应获得乙型肝炎疫苗的完整方案。
2. 在实验室中，在BSL-2罩中打开紫外线25分钟，以便在使用前对高压灭菌的仪器和移液器进行灭菌。
3. 将脐带组织片从收集管转移到10cm² 组织培养处理的培养皿中，其中含有富含5g / L葡萄糖，50μg/ mL庆大霉素，2.5μg/ mL两性霉素B，100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素的PBS（ 图1中的示意图）。
4. 使用手术刀，沿其纵轴垂直切开脊髓组织，以获得两个半圆柱形的碎片。由于脐带扭转和粘液表面，用另一只手握住的一对镊子固定组织。
5. 此时，观察脐动脉和静脉，并使用手术刀从表面沿一个方向刮掉血管，以去除血管。在PBS中再次冲洗脐带组织，以除去与组织相关的所有残留血液。确保刮擦是温和的，以保持血管周围WJ中细胞的完整性。
6. 将每半根脐带组织切成0.5厘米³ 大小的碎片，并将碎片放在培养皿上，腔面朝下。将培养皿在含有5%CO 2的37°C加湿室中短暂孵育₁₀分钟。
7. 孵育后，用20mL含有MEM Alpha修饰的培养基浸入含有脐带组织片的培养皿中，不含L-谷氨酰胺，核糖核苷和脱氧核糖核苷，15%胎牛血清（未热灭活）和50μg/ mL庆大霉素。沿侧面轻轻添加生长培养基，以防止组织外植体从其方向上移位。加入多余的培养基以占在孵育期间将被组织外植体吸收的部分。
8. 孵育3天后，向培养物中加入新鲜培养基。确保培养物在处理培养物时免受外植体的冲击和移动。
9. 1周后，使用无菌镊子单独去除组织碎片，并使用适当的生物危害袋丢弃以进行处理。保留现有培养基并加入10 mL新鲜生长培养基。每4天更换一次生长培养基，直到单个菌落达到70%的汇合度。
   注意:细胞可能不会均匀分布在整个培养皿中，因为需要监测单个增殖集落是否与时间汇合。通常，在一个月内，一个10厘米² 的培养皿会产生足够的细胞，可以分成一个单独的培养皿。
10. 使用胰蛋白酶/ EDTA溶液（1x 0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA在Hanks平衡盐溶液[HBSS]中）收获贴壁细胞。在25°C下以470× g 离心细胞悬浮液5分钟，并将细胞沉淀重悬于生长培养基中。

2. uMSCS的免疫表型和传播

1. 一旦贴壁细胞达到50%-60%汇合度并充分扩散，继续进行免疫表型分析。不要对完全融合的培养物进行MSC标志物分析，因为这往往会导致关键MSC标志物的下调。
2. 胰蛋白酶消化后，将1×10⁶ 个细胞/ mL的细胞悬液分布在FACS管（1×10^个5 个细胞/管）中，并用适当的荧光团连接抗体（均为1:50稀释）组合染色:未染色;CD105 + CD90;CD105 + CD73;CD105;CD90;CD73;CD34 + CD45（普通荧光基团）;每个荧光基团的同种型对照。在流式细胞仪上记录至少10，000个事件总数，以便进一步分析。
   注意:由于细胞是针对每个表面标记物单独分析的，因此不需要对细胞亚群进行门控。
3. 除上述标志物外，确认由单个脐带组织样品产生的uMSC系中存在阳性和阴性表面标记物（表1）。
4. 通过流式细胞术分析标记的细胞，并确定CD105 ⁺ CD90 ⁺ 和CD105 ⁺ CD73 ^+细胞的 百分比。分别分析CD105⁺ 和CD34⁻CD45⁻ 细胞。

3. uMSCs分化为骨骼肌

1. 在PBS中用0.01%胶原蛋白和20μg/ mL层粘连蛋白涂覆组织培养板。在室温下涂覆这些板至少4小时。
2. 在生长培养基中以10，000个细胞/ cm² 的密度平板uMSCs。
3. 当细胞汇合70%时，吸出生长培养基并用PBS冲洗培养物2倍。向 uMSC 中加入包含 DMEM + 5% 马血清 + 0.1 μM 地塞米松 + 50 μM 氢化可的松的肌源分化培养基 （M1）。为了确定肌源进展的动力学，每隔一天向培养物中加入M1培养基。
4. 为了确定肌源性进展的动力学，分别在2天，4-5天，6-7天和10-14天分析uMSCs的Pax7，MyoD，Myogenin和MyHC表达。

结果

从脐带组织中分离 uMSC 的成功率>95%，这与全脐带血的成功率很低。成功分离uMSCs后，FACS分析显示所有细胞均为CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺。然而，在比较分析中，从脐带血中分离出的uMSCs显示异质群体，其中一定比例的细胞显示CD34 ⁺ CD45 ⁺ CD105 ⁺ （〜15%）。此外，双阳性CD105 ⁺ CD90 ⁺ 的数量较少（约5%）（补充图S1）。这?...

讨论

关键步骤
该方案的一个关键步骤是在无菌条件下收集组织，从递送时间到维持无菌培养物，持续整个繁殖期。在脐带收集过程中，脐带必须不接触任何未灭菌的表面，并在收集到含有补充抗生素的PBS的管中之前用70%乙醇进行外部拭子。重要的是要限制脐带收集和组织处理之间的时间，以进行uMSC分离。如果需要将组织从收集部位运输到实验室，必须注意将组织保持在含抗生素的缓冲...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL