יצירת תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית והתמיינותם לשושלת שרירי השלד.

Abstract

חקר הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע מזנכימליים מותנה בקלות הבידוד, בעוצמה לקראת התמיינות ובאמינות ובחוסן של המקור. אנו מתארים כאן פרוטוקול מדורג לבידוד תאי גזע מזנכימליים מרקמת חבל הטבור האנושית (uMSCs), האימונופנוטיפ שלהם והתפשטות תרביות כאלה על פני מספר מעברים. בהליך זה, הכדאיות של uMSCs היא גבוהה כי אין עיכול אנזימטי. יתר על כן, הסרת כלי הדם, כולל עורקי חבל הטבור והווריד, מבטיחה כי אין זיהום של תאים ממוצא אנדותל. באמצעות ציטומטריה של זרימה, uMSCs בעת הבידוד הם CD45⁻CD34⁻, מה שמעיד על היעדר תאים מהשושלת ההמטופוייטית. חשוב לציין שהם מבטאים סמני פני שטח מרכזיים, CD105, CD90 ו-CD73. עם הקמתן של תרביות, מאמר זה מתאר שיטה יעילה להשראת התמיינות ב-uMSCs אלה לשושלת שרירי השלד. ניתוח מפורט של התקדמות מיוגנית ב- uMSCs מובחנים מגלה כי uMSCs מבטאים את Pax7, סמן לאבות מיוגניים בשלבים הראשונים של התמיינות, ואחריו הביטוי של MyoD ו- Myf5, ולבסוף, סמן התמיינות מסוף, שרשרת כבדה של מיוזין (MyHC).

Introduction

חבל הטבור האנושי נזקף לזכותו כבעל מאגר חזק של תאי גזע מזנכימליים, הנחקרים כיום לטיפולים רגנרטיביים בשל שיעורי ההתרבות וההתמיינות החזקים שלהם, התכונות האימונומודולטוריות והיכולת לייצר תאים מכל שלוש שכבות הנבט¹. רקמת חבל הטבור מורכבת ממספר תאים כגון דם טבורי, תת-האנדותל של וריד הטבור, והג'לי של וורטון (WJ), אשר כשלעצמו מקיף שלושה אזורים לא ברורים - האזור הפריווסקולרי, האזור הבין-וסקולרי, ותת-האניון או בטנת החבל (CL)². בעוד שניתן לבודד uMSCs מכל האזורים השונים הללו ולבטא באופן רחב סמני MSC מרכזיים, אין בהירות אם תאים אלה מכילים את אותה אוכלוסייה של uMSCs או מציגים הבדלים בעוצמת ההבחנה שלהם³. לפיכך, פרוטוקולים לבידוד של uMSCs דורשים דיוק רב יותר במצבם ובאזור הבידוד שלהם, אפיון חזק של פוטנציאל ההבחנה, ולבסוף, ניתוח השוואתי מתאים שונים של הכבל.

בהקשר זה, מעטים המחקרים שהדגימו הבדלים בפוטנציאלים המתרבים וההבחנתיים של uMSC בין חלקים שונים של הכבל. מתוכם, ניתוחים השוואתיים בין uMSCs שבודדו מאזורי CL ו-WJ חשפו פוטנציאל התפשטות גדול יותר ב-uMSCs שמקורם ב-CL ^3,4. במחקר נפרד, uMSCs שמקורם ב-WJ הציגו ביצועים טובים יותר במבחני התפשטות בהשוואה לתאים פריווסקולריים (HUCPV)⁵. בבחינת ההבדלים בין uMSCs שמקורם בדם טבורי לבין uMSCs שמקורם ברקמת כבל ללא זיהום כלי דם, דווח על ביטוי דיפרנציאלי של סמני MSC מרכזיים בין שני התאים, כמו גם על שיעורי שגשוג מוגברים ב-uMSCs⁶ שמקורם ברקמת כבל.

מבין מספר המחקרים שבחנו את פוטנציאל ההתמיינות של uMSCs בעיקר לרקמות של שושלת המזודרם כגון שושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות, מעטים מאוד סיפקו פרוטוקולים מפורטים להבחנה מיוגנית ולאפיון שלאחר מכן, כמו גם ניתוחים השוואתיים בין תאי חוטים שונים. בהקשר זה, פיתחנו פרוטוקול התמיינות שרירים חזק וראינו כי uMSCs שמקורם ברקמת כבל מפגינים יכולות התמיינות מיוגניות מעולות בהשוואה לדם טבורי⁶. כאן מפורט פרוטוקול שלבים לבידוד של uMSCs מכל רקמת הכבל נטולת תאים הקשורים לכלי הדם, לאפיון שלהם ולהתמיינותם לשושלת המיוגנית.

Protocol

השימוש ברקמת חבל הטבור במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר תאי גזע (IC-SCR), ועדת האתיקה המוסדית, המכון למדע וטכנולוגיה של בריאות תרגומית (IEC-THSTI), ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים האזרחי, גורוגרם, הריאנה, והוועדה לביו-בטיחות מוסדית, THSTI. דגימות רקמת חבלים אנושיות נקטפו מלידה בזמן הלידה. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנושאים . כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.

1. בידוד של MSCs מרקמת כבל

1. בזמן הלידה, חותכים לפחות 5 ס"מ של חוט, רצוי קרוב יותר לשליה, ומעקרים את הכבל על ידי גלישת המשטח החיצוני עם 70% אתנול. העבר את פיסת רקמת החוט ברצף מצינור איסוף אחד של 50 מ"ל המכיל מלח בעל מאגר פוספט (PBS) לצינור אחר המכיל את אותו הדבר. העבירו את צינור האיסוף הנושא את שם הנבדק על הקרח למעבדה תוך שעה אחת.
   הערה: עבור מחקר גדול יותר, ייתכן שיהיה זה שימושי לברקוד את הדגימות כדי לאפשר את המעקב אחריהן לאורך כל המחקר. חשוב לציין, יש להציע לכל אנשי הצוות המטפלים ברקמות אנושיות את המשטר המלא של החיסון נגד הפטיטיס B.
2. במעבדה, הפעילו את ה-UV למשך 25 דקות במכסה המנוע BSL-2 כדי לעקר מכשירים אוטוקלבים ופיפטות לפני השימוש.
3. העבר את פיסת רקמת החוט מצינור האיסוף לתבשיל של 10 ס"מ^שטופל בתרבית רקמה בגודל 10 ס"מ המכיל PBS מועשר ב-5 גרם/ל' גלוקוז, גנטמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (סכמטי באיור 1).
4. באמצעות אזמל, פורסים את רקמת החוט אנכית לאורך ציר האורך שלה כדי לקבל שני חלקים גליליים למחצה. בשל פיתול הכבל ומשטח הריריות, הצמד את הרקמה עם זוג מלקחיים המוחזקים ביד השנייה.
5. בשלב זה, התבונן בעורקי הטבור ובווריד והסר את כלי הדם על ידי שימוש באזמל כדי לגרד אותם בכיוון אחד מפני השטח. יש לשטוף שוב את רקמת החוט ב-PBS כדי להסיר את כל שאריות הדם הקשורות לרקמה. ודא שהגירוד עדין כדי לשמור על שלמות התאים ב- WJ המקיף את כלי השיט.
6. טחנו כל מחצית של רקמת החוט לרסיסים בגודל 0.5 ס"מ^{בגודל 3} והניחו את השברים כאשר המשטח הזוהר פונה כלפי מטה על המנה. דגירו את המנה לזמן קצר למשך 10 דקות בתא לח של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO₂.
7. לאחר הדגירה, הציפו את המנה המכילה את חלקי רקמת החוטים ב-20 מ"ל של מדיום המכיל MEM Alpha Modification ללא L-גלוטמין, ריבו-דאוקסיריבונוקלאוזידים, 15% סרום בקר עוברי (לא מומת בחום) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ג'נטמיצין. מוסיפים את מדיום הגדילה בעדינות לאורך הצדדים כדי למנוע את ניתוק הרקמה מהכיוון שלהם. הוסיפו עודף מדיום כדי להסביר שבר שייקלט על ידי גולשי הרקמה במהלך הדגירה.
8. לאחר 3 ימי דגירה, הוסיפו מדיום רענן לתרבויות. יש לוודא שהתרביות מוגנות מפני זעזועים ותנועתם של המוציאים תוך כדי טיפול בכלים.
9. לאחר שבוע אחד, הסר את שברי הרקמה בנפרד באמצעות מלקחיים סטריליים והשלך באמצעות שקיות ביוהאזרד מתאימות לסילוק. לשמור על המדיום הקיים ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. החלף את מדיום הצמיחה כל 4 ימים עד שמושבות בודדות מגיעות למפגש של 70%.
   הערה: סביר להניח שהתאים לא יתפזרו באופן אחיד לאורך כל המנה, מכיוון שיהיו מושבות שגשוג בודדות שיש לעקוב אחריהן לצורך מפגש עם הזמן. בדרך כלל, תוך חודש, מנה של 10 ס"מ² מייצרת מספיק תאים כדי להתפצל למנה נפרדת.
10. קציר את התאים הדבקים באמצעות תמיסת טריפסין/EDTA (1x 0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס [HBSS]). צנטריפוגה של תרחיף התא ב-470 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס והחזירו את גלולת התא במדיום הגדילה.

2. אימונופנוטיפינג והתפשטות של uMSCS

1. המשך לאימונופנוטיפ לאחר שהתאים הדבקים הגיעו למפגש של 50%-60% והם מתפשטים היטב. אל תבצע ניתוח סמני MSC על תרבויות מפגש מלאות, מכיוון שהדבר נוטה לגרום להפחתת ויסות של סמני MSC מרכזיים.
2. לאחר טריפסיניזציה, הפיצו תרחיף תא של 1 × 10⁶ תאים/מ"ל בצינורות FACS (1 × 10⁵ תאים/צינור) וכתם עם נוגדנים מתאימים המקושרים לפלואורופור (כולם דילול 1:50) בשילוב: לא מוכתם; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (פלואורופור נפוץ); בקרת איזוטיפ עבור כל פלואורופור. רשום מספר כולל של אירועים של לפחות 10,000 על ציטומטר הזרימה לניתוח נוסף.
   הערה: מאחר שהתאים מנותחים עבור כל סמן פני שטח בנפרד, אין צורך בגימור על תת-קבוצות של תאים.
3. בנוסף לסמנים לעיל, אשר את נוכחותם של סמני פני שטח חיוביים ושליליים בקווי uMSC שנוצרו מדגימות רקמת חוט בודדת (טבלה 1).
4. נתח את התאים המסומנים לפי ציטומטריית זרימה וקבע את אחוז תאי CD105⁺CD90⁺ ו-CD105⁺CD73⁺ . נתחו את תאי CD105^{+ ו-CD34−}CD45⁻ בנפרד.

3. הבחנה של uMSCs לשרירי השלד

1. ציפו צלחות תרבית רקמה ב-0.01% קולגן ו-20 מיקרוגרם/מ"ל למינין ב-PBS. מצפים צלחות אלה במשך 4 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.
2. UMSCs של צלחת בצפיפות של 10,000 תאים/ס"מ² במדיום גדילה.
3. כאשר התאים נפגשים ב-70%, שאפו את מדיום הגדילה ושטפו את התרביות פי 2 עם PBS. הוסף את מדיום ההבחנה המיוגני (M1) המורכב מ- DMEM + 5% סרום סוסים + 0.1 μM דקסמתזון + 50 μM הידרוקורטיזון ל- uMSCs. לקביעת הקינטיקה של ההתקדמות המיוגנית, הוסיפו מדיום M1 אחת ליומיים לתרבויות.
4. כדי לקבוע את הקינטיקה של התקדמות מיוגנית, נתח uMSCs עבור Pax7, MyoD, Myogenin ו- MyHC ביטוי לאחר יומיים, 4-5 ימים, 6-7 ימים ו- 10-14 ימים, בהתאמה.

תוצאות

ההצלחה של בידוד של uMSCs מרקמת כבל היא >95%, בניגוד לשיעורי ההצלחה הגרועים של דם טבורי שלם. לאחר בידוד מוצלח של uMSCs, ניתוח FACS מגלה כי כל התאים הם CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. עם זאת, בניתוח השוואתי, uMSCs המבודדים מדם טבורי מציגים אוכלוסיות הטרוגניות, כאשר חלק מהתאים מראים CD34⁺CD45⁺

Discussion

שלבים קריטיים
שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא איסוף רקמות בתנאים אספטיים, מרגע המסירה ועד לתחזוקת תרביות סטריליות, לכל משך ההתפשטות. במהלך איסוף הכבלים, חיוני שהכבל לא ייגע בשום משטח שאינו מעוקר והוא מתפתל חיצונית עם 70% אתנול לפני האיסוף בצינורות המכילים PBS בתוספת אנטיביוטיקה. חשוב ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL