Generazione di cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e la loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico.

Abstract

L'esplorazione del potenziale terapeutico delle cellule staminali mesenchimali dipende dalla facilità di isolamento, dalla potenza verso la differenziazione e dall'affidabilità e dalla robustezza della fonte. Descriviamo qui un protocollo graduale per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano (uMSCs), la loro immunofenotipizzazione e la propagazione di tali colture su diversi passaggi. In questa procedura, la vitalità degli uMSC è elevata perché non vi è alcuna digestione enzimatica. Inoltre, la rimozione dei vasi sanguigni, comprese le arterie del cordone ombelicale e la vena, assicura che non vi sia contaminazione delle cellule di origine endoteliale. Utilizzando la citometria a flusso, le uMSC all'isolamento sono CD45⁻CD34⁻, indicando un'assenza di cellule dalla linea ematopoietica. È importante sottolineare che esprimono marcatori di superficie chiave, CD105, CD90 e CD73. Al momento della creazione di colture, questo documento descrive un metodo efficace per indurre la differenziazione in queste uMSC nel lignaggio del muscolo scheletrico. Un'analisi dettagliata della progressione miogenica nelle uMSC differenziate rivela che le uMSC esprimono Pax7, un marker per i progenitori miogeni nelle fasi iniziali della differenziazione, seguito dall'espressione di MyoD e Myf5 e, infine, un marcatore di differenziazione terminale, la catena pesante della miosina (MyHC).

Introduzione

Il cordone ombelicale umano è stato accreditato per possedere un robusto serbatoio di cellule staminali mesenchimali, che sono attualmente in fase di esplorazione per terapie rigenerative a causa dei loro robusti tassi di proliferazione e differenziazione, proprietà immunomodulatorie e capacità di generare cellule da tutti e tre gli strati germinali¹. Il tessuto del cordone ombelicale è costituito da più compartimenti come il sangue del cordone ombelicale, il subendotelio della vena ombelicale e la gelatina di Wharton (WJ), che di per sé comprende tre regioni indistinte: la zona perivascolare, la zona intervascolare e il sub-amnione o il rivestimento del cordone (CL)². Mentre gli uMSC possono essere isolati da tutte queste diverse regioni ed esprimere ampiamente i marcatori MSC chiave, non c'è chiarezza sul fatto che questi compartimenti contengano la stessa popolazione di uMSC o mostrino differenze nelle loro potenze di differenziazione³. Pertanto, i protocolli per l'isolamento delle uMSC richiedono una maggiore precisione nella loro modalità e regione di isolamento, la robusta caratterizzazione dei potenziali di differenziazione e, infine, un'analisi comparativa da diversi compartimenti del cavo.

In questo contesto, pochi studi hanno dimostrato differenze nei potenziali proliferativi e differenziativi uMSC tra le diverse parti del cavo. Di queste, le analisi comparative tra uMSC isolate dalle regioni CL e WJ hanno rivelato un maggiore potenziale proliferativo nelle UMSC derivate da CL ^3,4. In uno studio separato, le uMSC derivate da WJ hanno ottenuto risultati migliori nei saggi di proliferazione rispetto alle cellule perivascolari (HUCPV)⁵. Nell'esaminare le differenze tra le uMSC derivate dal sangue cordonale e le uMSC derivate dal tessuto cordonale prive di contaminazione vascolare, è stata riportata un'espressione differenziale dei marcatori MSC chiave tra i due compartimenti, nonché un aumento dei tassi di proliferazione nelle uMSC derivate dal tessuto cordonale⁶.

Dei numerosi studi che esaminano i potenziali di differenziazione delle uMSC principalmente nei tessuti del lignaggio mesodermico come i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni, pochissimi hanno fornito protocolli dettagliati per la differenziazione miogenica e la successiva caratterizzazione, nonché analisi comparative tra vari compartimenti del cordone ombelicale. In questo contesto, abbiamo sviluppato un robusto protocollo di differenziazione muscolare e osservato che le uMSC derivate dal tessuto cordonale mostrano capacità di differenziazione miogenica superiori rispetto al sangue del cordone ombelicale⁶. Qui, un protocollo graduale è dettagliato per l'isolamento delle uMSC dall'intero tessuto cordonale privo di cellule associate alla vascolarizzazione, alla loro caratterizzazione e alla loro differenziazione nel lignaggio miogenico.

Protocollo

L'uso del tessuto del cordone ombelicale in questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la ricerca sulle cellule staminali (IC-SCR), dal Comitato etico istituzionale, dall'Istituto di scienza e tecnologia della salute traslazionale (IEC-THSTI), dal Comitato etico istituzionale dell'ospedale civile, Gurugram, Haryana e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza, THSTI. Campioni di tessuto cordonale umano sono stati raccolti da parti a termine al momento della nascita. Il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.

1. Isolamento delle MSC dal tessuto del cordone ombelicale

1. Al momento della consegna, tagliare almeno 5 cm di corda, preferibilmente più vicino alla placenta, e sterilizzare la corda tamponando la superficie esterna con il 70% di etanolo. Trasferire il pezzo di tessuto cordonale in sequenza da un tubo di raccolta da 50 ml contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a un altro contenente lo stesso. Trasportare il tubo di raccolta recante il nome del soggetto su ghiaccio al laboratorio entro 1 ora.
   NOTA: per uno studio più ampio, potrebbe essere utile codificare a barre i campioni per consentire il loro monitoraggio durante lo studio. È importante sottolineare che a tutto il personale che gestisce tessuti umani dovrebbe essere offerto il regime completo del vaccino contro l'epatite B.
2. In laboratorio, accendere l'UV per 25 minuti nella cappa BSL-2 per sterilizzare strumenti e pipette autoclavati prima dell'uso.
3. Trasferire il pezzo di tessuto cordonale dal tubo di raccolta a un piatto da 10 cm² trattati con coltura tissutale contenente PBS arricchito con 5 g/L di glucosio, 50 μg/mL di gentamicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (schematico nella Figura 1).
4. Usando un bisturi, affettare il tessuto del cordone verticalmente lungo il suo asse longitudinale per ottenere due pezzi semicilindrici. A causa della torsione del cavo e della superficie mucoide, fissare il tessuto con un paio di pinze tenute nell'altra mano.
5. A questo punto, osservare le arterie ombelicali e la vena e rimuovere i vasi sanguigni utilizzando un bisturi per raschiarli via in una direzione dalla superficie. Risciacquare nuovamente il tessuto cordonale in PBS per rimuovere tutto il sangue residuo associato al tessuto. Assicurarsi che la raschiatura sia delicata per preservare l'integrità delle cellule nel WJ che circonda i vasi.
6. Tritare ogni metà del tessuto cordonale in frammenti di dimensioni 0,5 cm³ e posizionare i frammenti con la superficie luminale rivolta verso il basso sul piatto. Incubare brevemente il piatto per 10 minuti in una camera umidificata a 37 °C contenente il 5% di CO₂.
7. Dopo l'incubazione, inondare il piatto contenente i pezzi di tessuto cordonale con 20 ml di mezzo contenente MEM Alpha Modification senza L-glutammina, ribo- e desossiribonucleosidi, siero bovino fetale al 15% (non inattivato dal calore) e 50 μg/mL di gentamicina. Aggiungere delicatamente il mezzo di crescita lungo i lati per evitare che gli espianti tissutali vengano spostati dal loro orientamento. Aggiungere il mezzo in eccesso per tenere conto di una frazione che verrà assorbita dagli espianti di tessuto durante l'incubazione.
8. Dopo 3 giorni di incubazione, aggiungere terreno fresco alle colture. Assicurarsi che le colture siano protette dagli urti e dal movimento degli espianti durante la manipolazione dei piatti.
9. Dopo 1 settimana, rimuovere i frammenti di tessuto singolarmente utilizzando una pinza sterile e scartare utilizzando appositi sacchetti a rischio biologico per lo smaltimento. Mantenere il mezzo esistente e aggiungere 10 ml di terreno di crescita fresco. Sostituire il mezzo di crescita ogni 4 giorni fino a quando le singole colonie raggiungono una confluenza del 70%.
   NOTA: È probabile che le cellule non saranno distribuite uniformemente in tutto il piatto, poiché ci saranno singole colonie proliferative che devono essere monitorate per la confluenza con il tempo. Generalmente, entro un mese, un piatto di 10 cm² genera abbastanza cellule da dividere in un piatto separato.
10. Raccogliere le cellule aderenti utilizzando la soluzione di tripsina / EDTA (1x 0,25% di tripsina e 0,02% di EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugare la sospensione cellulare a 470 × g per 5 minuti a 25 °C e risospesare il pellet cellulare nel mezzo di crescita.

2. Immunofenotipizzazione e propagazione di uMSCS

1. Procedere all'immunofenotipizzazione una volta che le cellule aderenti hanno raggiunto il 50%-60% di confluenza e sono ben diffuse. Non eseguire l'analisi dei marcatori MSC su colture completamente confluenti, poiché ciò tende a causare una downregulation dei marcatori MSC chiave.
2. Dopo la tripsinizzazione, distribuire una sospensione cellulare di 1 × 10⁶ cellule/mL in tubi FACS (1 × 10⁵ cellule/tubo) e colorare con opportuni anticorpi legati al fluoroforo (tutta la diluizione 1:50) in combinazione: non macchiato; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoroforo comune); controlli isotipici per ogni fluoroforo. Registrare un numero totale di eventi di almeno 10.000 sul citometro a flusso per ulteriori analisi.
   NOTA: poiché le celle vengono analizzate separatamente per ciascun marcatore di superficie, non è necessario gating su sottoinsiemi di celle.
3. Oltre ai marcatori di cui sopra, confermare la presenza di marcatori di superficie positivi e negativi nelle linee uMSC create da singoli campioni di tessuto cordonale (Tabella 1).
4. Analizzare le cellule marcate mediante citometria a flusso e determinare la percentuale ^{di cellule} CD105⁺CD90⁺ e CD105⁺CD73+. Analizzare separatamente ^{le celle} CD105⁺ e CD34⁻CD45−.

3. Differenziazione delle uMSC in muscolo scheletrico

1. Piastre di coltura del tessuto del rivestimento con 0,01% di collagene e 20 μg/mL di laminina in PBS. Rivestire queste piastre per un minimo di 4 ore a temperatura ambiente.
2. Piastra uMSCs ad una densità di 10.000 cellule/cm² in terreno di crescita.
3. Quando le cellule sono confluenti al 70%, aspirare il mezzo di crescita e risciacquare le colture 2 volte con PBS. Aggiungere il mezzo di differenziazione miogenico (M1) composto da DMEM + 5% siero equino + 0,1 μM desametasone + 50 μM idrocortisone alle uMSC. Per determinare la cinetica della progressione miogenica, aggiungere M1 medium a giorni alterni alle colture.
4. Per determinare la cinetica della progressione miogenica, analizzare le uMSC per l'espressione di Pax7, MyoD, Myogenin e MyHC rispettivamente a 2 giorni, 4-5 giorni, 6-7 giorni e 10-14 giorni.

Risultati

Il successo dell'isolamento delle uMSC dal tessuto del cordone ombelicale è >95%, a differenza degli scarsi tassi di successo del sangue del cordone ombelicale intero. Dopo aver isolato con successo le uMSC, l'analisi FACS rivela che tutte le cellule sono CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. Tuttavia, in analisi comparativa, le uMSC isolate dal sangue del cordone ombelicale mostrano popolazioni eterogenee, in cui una percentuale di cellule mostra CD34 ⁺ CD45 ⁺ CD10...

Discussione

Passaggi critici
Un passaggio critico in questo protocollo è la raccolta del tessuto in condizioni asettiche, dal momento della consegna al mantenimento di colture sterili, per l'intera durata della propagazione. Durante la raccolta del cavo, è essenziale che il cavo non tocchi alcuna superficie non sterilizzata e venga tamponato esternamente con etanolo al 70% prima della raccolta in tubi contenenti PBS integrati con antibiotici. È importante limitare il tempo tra la raccolta del cordone e l'elabo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL