인간 탯줄 조직에서 중간엽 줄기 세포의 생성과 골격근 계보로의 분화

요약

우리는 인간 탯줄 조직으로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하고 골격근 혈통으로의 분화를 위한 프로토콜을 기술한다.

초록

중간엽 줄기 세포의 치료 잠재력을 탐구하는 것은 분리의 용이성, 분화에 대한 효능 및 공급원의 신뢰성과 견고성에 달려 있습니다. 우리는 인간 탯줄 조직 (uMSCs)으로부터 중간엽 줄기 세포의 단리, 그들의 면역 표현형, 및 여러 계대에 걸쳐 그러한 배양물의 전파를 위한 단계적 프로토콜을 여기에서 설명한다. 이 절차에서 uMSCs의 생존력은 효소 소화가 없기 때문에 높습니다. 또한, 탯줄 동맥과 정맥을 포함한 혈관을 제거하면 내피 기원의 세포가 오염되지 않도록합니다. 유세포 분석기를 사용하여, 단리시 uMSC는 CD45-CD34^-이며, 이는 조혈 혈통으로부터 세포의 부재를 나타낸다. 중요하게도, 이들은 키 표면 마커, CD105, CD90 및 CD73을 발현한다. 배양물의 확립시, 이 논문은 이들 uMSCs에서 골격근 계통으로의 분화를 유도하는 효율적인 방법을 기술한다. 분화된 uMSCs에서의 근인성 진행에 대한 상세한 분석은 uMSCs가 분화의 초기 단계에서 근인성 선조에 대한 마커인 Pax7을 발현하고, 이어서 MyoD 및 Myf5의 발현, 그리고 마지막으로 말단 분화 마커인 미오신 중쇄(MyHC)를 발현한다는 것을 밝혀낸다.

서문

인간 탯줄은 강력한 증식 및 분화 속도, 면역 조절 특성 및 세 배아층 모두에서 세포를 생성하는 능력으로 인해 재생 요법을 위해 현재 탐구되고있는 중간엽 줄기 세포의 견고한 저장소를 보유하고있는 것으로 인정 받고 있습니다¹. 탯줄 조직은 탯줄 혈, 탯줄 정맥 내피 및 와튼 젤리 (WJ)와 같은 여러 구획으로 구성되며, 그 자체로 혈관 주위 영역, 혈관 간 영역 및 양막 하부 또는 코드 라이닝 (CL)²의 세 가지 불분명 한 영역을 포함합니다. uMSCs가 이러한 모든 상이한 영역으로부터 단리되고 주요 MSC 마커를 광범위하게 발현할 수 있지만, 이들 구획이 uMSCs의 동일한 집단을 포함하는지 또는 그들의 분화 효능에서 차이를 나타내는지에 대한 명확성은 없다³. 따라서 uMSC의 분리를 위한 프로토콜은 격리 모드 및 영역에서 더 높은 정밀도, 차별화 전위의 강력한 특성화, 그리고 마지막으로 코드의 다른 구획으로부터의 비교 분석이 필요합니다.

이러한 맥락에서, 탯줄의 다른 부분 사이의 uMSC 증식 및 분화 잠재력의 차이를 입증 한 연구는 거의 없습니다. 이들 중, CL 및 WJ 영역으로부터 분리된 uMSCs 사이의 비교 분석은 CL 유래 uMSCs ^3,4에서 더 큰 증식 가능성을 나타냈다. 별도의 연구에서, WJ 유래 uMSCs는 혈관주위 세포 (HUCPV)⁵에 비해 증식 분석에서 더 잘 수행되었다. 혈관 오염이 없는 제대혈 유래 uMSCs와 탯줄 조직 유래 uMSCs 사이의 차이를 조사함에 있어서, 주요 MSC 마커의 차등적 발현은 두 구획 사이에서 보고되었고, 탯줄 조직 유래 uMSCs⁶에서 증식 속도 증가가 보고되었다.

uMSCs의 분화 가능성을 주로 골형성, 지방형성 및 연골 혈통과 같은 중배엽 혈통의 조직으로 조사하는 여러 연구 중 극소수만이 근인성 분화 및 후속 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 다양한 탯줄 구획 간의 비교 분석을 제공했습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 강력한 근육 분화 프로토콜을 개발하여 탯줄 조직 유래 uMSC가 제대혈⁶에 비해 우수한 근형성 분화 능력을 나타낸다는 것을 관찰했다. 여기서, 단계적 프로토콜은 혈관구조와 관련된 세포가 결여된 전체 탯줄 조직으로부터 uMSCs의 단리, 이들의 특성화, 및 근인성 계보로의 이들의 분화에 대해 상세히 기술되어 있다.

프로토콜

이 연구에서 탯줄 조직의 사용은 줄기 세포 연구 기관위원회 (IC-SCR), 기관 윤리위원회, 번역 건강 과학 기술 연구소 (IEC-THSTI), 민간 병원의 기관 윤리위원회, Gurugram, Haryana 및 기관 생물 안전위원회, THSTI에 의해 승인되었습니다. 인간 탯줄 조직 샘플은 출생시의 용어 전달로부터 수확되었다. 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었다. 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 탯줄 조직으로부터 MSC의 분리

1. 분만시, 탯줄 5cm 이상, 바람직하게는 태반에 더 가깝게 자르고 70 % 에탄올로 외부 표면을 면도하여 코드를 살균하십시오. 탯줄 조직 조각을 인산염 완충 식염수(PBS)를 함유하는 하나의 50 mL 수집 튜브로부터 이를 함유하는 다른 50 mL 수집 튜브로 순차적으로 옮긴다. 얼음 위에 피사체의 이름이 새겨진 수집 튜브를 1 시간 이내에 실험실로 운반하십시오.
   참고: 더 큰 연구의 경우, 연구 전반에 걸쳐 샘플을 추적할 수 있도록 바코드를 작성하는 것이 유용할 수 있습니다. 중요한 것은 인간 조직을 다루는 모든 인원에게 B 형 간염 백신의 완전한 처방을 제공해야한다는 것입니다.
2. 실험실에서는 사용하기 전에 BSL-2 후드에서 25분 동안 UV를 켜서 오토클레이브 기기와 피펫을 멸균합니다.
3. 탯줄 조직 조각을 수집 튜브에서 5 g/L 글루코스, 50 μg/mL 겐타마이신,^2.5 μg/mL 암포테리신 B, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 풍부한 PBS를 함유하는 10 cm2 조직 배양 처리 접시로 옮깁니다( 그림 1의 개략도).
4. 메스를 사용하여 탯줄 조직을 세로 축을 따라 수직으로 슬라이스하여 두 개의 반 원통형 조각을 얻습니다. 코드 비틀림과 점액 표면으로 인해 다른 손에 한 쌍의 포셉으로 조직을 고정하십시오.
5. 이 시점에서 탯줄 동맥과 정맥을 관찰하고 메스를 사용하여 혈관을 제거하여 표면에서 한 방향으로 긁어냅니다. 탯줄 조직을 PBS로 다시 한번 헹구어 조직과 관련된 모든 잔류 혈액을 제거한다. 혈관을 둘러싸고 있는 WJ에서 세포의 무결성을 보존하기 위해 스크래핑이 부드럽도록 하십시오.
6. 탯줄 조직의 각 절반을 0.5cm³ 크기의 조각으로 다듬고 발광 표면이 접시 위에 아래로 향하게하는 조각을 놓습니다. 접시를 5%_CO2를 함유하는 37°C 가습된 챔버에서 10분 동안 간략하게 인큐베이션한다.
7. 인큐베이션 후, 탯줄 조직 조각이 들어있는 접시에 L-글루타민, 리보 및 데옥시리보뉴클레오시드가 없는 MEM 알파 변형, 15% 소 태아 혈청(열 불활성화되지 않음) 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 배지 20mL를 플러시합니다. 조직 외식편이 그들의 배향에서 벗어나는 것을 방지하기 위해 측면을 따라 부드럽게 성장 배지를 첨가하십시오. 인큐베이션 동안 조직 외식편에 의해 흡수될 분획을 설명하기 위해 과량의 배지를 첨가한다.
8. 배양 3일 후, 배양물에 신선한 배지를 첨가한다. 접시를 다루는 동안 문화가 충격과 외식의 움직임으로부터 보호되도록하십시오.
9. 1 주 후, 멸균 포셉을 사용하여 조직 파편을 개별적으로 제거하고 폐기를 위해 적절한 생체 위험 백을 사용하여 폐기하십시오. 기존 배지를 유지하고 10mL의 신선한 성장 배지를 첨가한다. 개별 콜로니가 70%의 합류점에 도달할 때까지 4일마다 성장 배지를 교체한다.
   참고 : 시간이 지남에 따라 합류를 모니터링해야하는 개별 증식 콜로니가있을 것이므로 세포가 접시 전체에 균일하게 분포되지 않을 가능성이 큽니다. 일반적으로 한 달 안에 10cm² 접시는 별도의 접시로 분할하기에 충분한 세포를 생성합니다.
10. 트립신 / EDTA 용액 (행크스 밸런스 솔트 솔루션 [HBSS]의 1x 0.25 % 트립신 및 0.02 % EDTA)을 사용하여 부착성 세포를 수확하십시오. 세포 현탁액을 470 × g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 성장 배지에 재현탁시킨다.

2. uMSCS의 면역 표현 및 전파

1. 부착 세포가 50 % -60 % 합류에 도달하고 잘 퍼지면 면역 표현형으로 진행하십시오. 완전히 합류한 배양물에 대해 MSC 마커 분석을 수행하지 마십시오, 이는 주요 MSC 마커의 하향조절을 야기하는 경향이 있기 때문입니다.
2. 트립신화 후, FACS 튜브 (1 × 10⁵ 세포 / 튜브)에 1 × 10⁶ 세포 / mL의 세포 현탁액을 분배하고 적절한 형광단 결합 항체 (모든 1:50 희석)로 염색하십시오 : 염색되지 않은; CD105+CD90; CD105+CD73; CD105; CD90; CD73; CD34+ CD45 (일반적인 형광단); 각 형광단에 대한 이소타입 조절. 추가 분석을 위해 유세포 분석기에 적어도 10,000 건의 총 사건 수를 기록하십시오.
   참고: 셀은 각 표면 마커에 대해 개별적으로 분석되므로 셀 하위 집합에 대한 게이팅이 필요하지 않습니다.
3. 상기 마커 이외에, 개별 탯줄 조직 샘플로부터 생성된 uMSC 라인에서 양성 및 음성 표면 마커의 존재를 확인하였다(표 1).
4. 유세포 분석기에 의해 표지된 세포를 분석하고 CD105⁺CD90+ 및 CD105⁺CD73⁺ 세포의 백분율을 결정한다. CD105⁺ 및 CD34-CD45^- 세포를 개별적으로 분석한다.

3. uMSC를 골격근으로 분화

1. PBS 중 0.01% 콜라겐 및 20 μg/mL 라미닌으로 조직 배양 플레이트를 코팅합니다. 이 플레이트를 실온에서 최소 4 시간 동안 코팅하십시오.
2. 성장 배지에서 10,000 세포/^cm2 의 밀도로 uMSCs를 플레이트화한다.
3. 세포가 70% 합류하면, 성장 배지를 흡인하고 배양물을 PBS로 2x 헹구었다. uMSCs에 DMEM + 5% 말 혈청 + 0.1 μM 덱사메타손 + 50 μM 하이드로코르티손을 포함하는 근인성 분화 배지 (M1)를 첨가한다. 근인성 진행의 동역학을 결정하기 위해, 배양물에 격일로 M1 배지를 첨가하십시오.
4. 근인성 진행의 동역학을 결정하기 위해, 각각 2일, 4-5일, 6-7일 및 10-14일에서 Pax7, MyoD, Myogenin 및 MyHC 발현에 대한 uMSCs를 분석한다.

결과

탯줄 조직에서 uMSCs의 분리의 성공은 전체 제대혈에서 성공의 가난한 비율과 달리 >95 %입니다. uMSCs의 성공적인 단리시, FACS 분석은 모든 세포가 CD34-CD45-CD105+CD90⁺임을 밝혀내었다. 그러나, 비교 분석에서, 제대혈로부터 분리된 uMSCs는 이종 집단을 표시하며, 여기서 세포의 비율은 CD34+CD45⁺CD105⁺(~15%)^를 나타낸다. 추가적으로, 이중 양성 CD105^+<...

토론

중요한 단계
이 프로토콜의 중요한 단계는 전달 시점부터 멸균 배양물의 유지에 이르기까지 전파의 전체 기간 동안 무균 조건 하에서 조직을 수집하는 것입니다. 코드 수집 중에 탯줄은 살균되지 않은 표면에 닿지 않고 항생제가 보충 된 PBS가 함유 된 튜브에 수집하기 전에 70 % 에탄올로 외부에서 면도하는 것이 중요합니다. uMSC 단리를 위한 탯줄 수집과 조직의 처리 사이의 시간을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL