İnsan Göbek Kordonu Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin Üretimi ve İskelet Kas Soyuna Farklılaşması

Özet

Mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan izolasyonu ve iskelet kası soyuna farklılaşması için bir protokol tanımladık.

Özet

Mezenkimal kök hücrelerin terapötik potansiyelini araştırmak, izolasyonun kolaylığına, farklılaşmaya yönelik potansiyele ve kaynağın güvenilirliğine ve sağlamlığına bağlıdır. Burada, mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan (uMSC'ler) izolasyonu, immünofenotiplenmesi ve bu kültürlerin birkaç pasaj üzerinde yayılması için kademeli bir protokol tarif ediyoruz. Bu prosedürde, enzimatik sindirim olmadığı için uMSC'lerin yaşayabilirliği yüksektir. Ayrıca, göbek kordonu arterleri ve damar dahil olmak üzere kan damarlarının çıkarılması, endotel kökenli hücrelerin kirlenmemesini sağlar. Akış sitometrisi kullanılarak, izolasyon üzerine uMSC'ler CD45-CD34-'dür ^ve hematopoetik soydan hücrelerin yokluğunu gösterir. Önemli olarak, anahtar yüzey işaretleyicilerini, CD105, CD90 ve CD73'ü ifade ederler. Kültürlerin kurulmasından sonra, bu yazıda bu uMSC'lerde iskelet kası soyuna farklılaşmayı indüklemek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Diferansiye uMSC'lerde miyojenik progresyonun ayrıntılı bir analizi, uMSC'lerin farklılaşmanın ilk aşamalarında miyojenik progenitörler için bir belirteç olan Pax7'yi, ardından MyoD ve Myf5'in ekspresyonunu ve son olarak bir terminal farklılaşma belirteci olan miyozin ağır zincirini (MyHC) ekspresyonunu ifade ettiğini ortaya koymaktadır.

Giriş

İnsan göbek kordonunun, sağlam proliferasyon ve farklılaşma oranları, immünomodülatör özellikleri ve üç germ katmanının hepsinden hücre üretme yetenekleri nedeniyle şu anda rejeneratif tedaviler için araştırılmakta olan sağlam bir mezenkimal kök hücre rezervuarına sahip olduğu düşünülmektedir¹. Göbek kordonu dokusu, göbek kordonu kanı, göbek damarı subendoteli ve Wharton'un jölesi (WJ) gibi kendi içinde üç belirsiz bölgeyi kapsayan çoklu bölmelerden oluşur - perivasküler bölge, intervasküler bölge ve alt amniyon veya kordon astarı (CL)². uMSC'ler tüm bu farklı bölgelerden izole edilebilse ve anahtar MSC belirteçlerini geniş çapta ifade edebilse de, bu bölmelerin aynı uMSC popülasyonunu içerip içermediği veya farklılaşma potansiyellerinde farklılıklar gösterip göstermediği konusunda netlik yoktur³. Bu nedenle, uMSC'lerin izolasyonu için protokoller, izolasyon modlarında ve bölgelerinde daha büyük bir hassasiyet, farklılaşma potansiyellerinin sağlam karakterizasyonu ve son olarak, kablonun farklı bölmelerinden karşılaştırmalı bir analiz gerektirir.

Bu bağlamda, az sayıda çalışma, kordonun farklı kısımları arasındaki uMSC proliferatif ve farklılaştırıcı potansiyellerinde farklılıklar göstermiştir. Bunlardan CL ve WJ bölgelerinden izole edilen uMSC'ler arasındaki karşılaştırmalı analizler, CL kaynaklı uMSC'lerde daha büyük bir proliferatif potansiyel ortaya koymuştur ^3,4. Ayrı bir çalışmada, WJ kaynaklı uMSC'ler, proliferasyon tahlillerinde perivasküler hücrelere (HUCPV) kıyasla daha iyi performans ^{göstermiştir5}. Kordon kanı kaynaklı uMSC'ler ile vasküler kontaminasyondan yoksun kordon dokusu kaynaklı uMSC'ler arasındaki farkların incelenmesinde, iki bölme arasında anahtar MSC belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonunun yanı sıra kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde proliferasyon oranlarının arttığı bildirilmiştir⁶.

uMSC'lerin öncelikle osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylar gibi mezoderm soyunun dokularına farklılaşma potansiyellerini inceleyen çeşitli çalışmalardan çok azı, miyojenik farklılaşma ve müteakip karakterizasyon için ayrıntılı protokollerin yanı sıra çeşitli kordon bölmeleri arasındaki karşılaştırmalı analizler sağlamıştır. Bu bağlamda sağlam bir kas farklılaşma protokolü geliştirdik ve kordon dokusu kaynaklı uMSC'lerin kordon kanı^6'ya kıyasla daha üstün miyojenik farklılaşma yetenekleri gösterdiğini gözlemledik. Burada, uMSC'lerin vaskülatür ile ilişkili hücrelerden yoksun tüm kordon dokusundan izolasyonu, karakterizasyonu ve miyojenik soya farklılaşması için kademeli bir protokol detaylandırılmıştır.

Protokol

Bu çalışmada göbek kordonu dokusunun kullanımı Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR), Kurumsal Etik Komitesi, Translasyonel Sağlık Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (IEC-THSTI), Sivil Hastane Kurumsal Etik Komitesi, Gurugram, Haryana ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi, THSTI tarafından onaylanmıştır. İnsan kordon dokusu örnekleri, doğum sırasında term doğumlardan toplandı. Deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır. Tüm yöntemler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. MSC'lerin kordon dokusundan izolasyonu

1. Doğum sırasında, tercihen plasentaya daha yakın olan en az 5 cm'lik kordonu kesin ve dış yüzeyi% 70 etanol ile süpürerek kordonu sterilize edin. Kordon dokusu parçasını, fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir 50 mL toplama tüpünden aynı şeyi içeren bir başkasına sırayla aktarın. Buz üzerinde deneğin adını taşıyan toplama tüpünü 1 saat içinde laboratuvara taşır.
   NOT: Daha büyük bir etüt için, numunelerin etüt boyunca izlenmesini sağlamak için numunelerin barkodlanması yararlı olabilir. Önemli olarak, insan dokularını işleyen tüm personele hepatit B aşısının tam rejimi sunulmalıdır.
2. Laboratuvarda, kullanmadan önce otoklavlanmış aletleri ve pipetleri sterilize etmek için BSL-2 davlumbazda 25 dakika boyunca UV'yi açın.
3. Kordon dokusu parçasını toplama tüpünden 5 g / L glikoz, 50 μg / mL gentamisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile zenginleştirilmiş PBS içeren 10^cm2 doku kültürü ile muamele edilmiş bir kaba aktarın ( Şekil 1'de şematik).
4. Bir neşter kullanarak, iki yarı silindirik parça elde etmek için kordon dokusunu uzunlamasına ekseni boyunca dikey olarak dilimleyin. Kordon burulması ve mukoid yüzey nedeniyle, diğer elde tutulan bir çift forseps ile dokuyu sabitleyin.
5. Bu noktada, göbek damarlarını ve damarı gözlemleyin ve kan damarlarını yüzeyden bir yönde kazımak için bir neşter kullanarak çıkarın. Dokuyla ilişkili tüm artık kanı çıkarmak için kordon dokusunu PBS'de bir kez daha durulayın. Damarları çevreleyen WJ'deki hücrelerin bütünlüğünü korumak için kazımanın nazik olduğundan emin olun.
6. Kordon dokusunun her bir yarısını 0,5^cm3 büyüklüğünde parçalar halinde kesin ve parçaları ışık yüzeyi aşağı bakacak şekilde tabağın üzerine yerleştirin. Çanağı,% 5 CO 2 içeren 37 ° C nemlendirilmiş bir odada 10 dakika boyunca kısaca kuluçkaya_yatırın.
7. Kuluçkadan sonra, kordon dokusu parçalarını içeren çanağı, L-glutamin, ribo- ve deoksiribonükleositler,% 15 fetal sığır serumu (ısıl inaktive değil) ve 50 μg / mL gentamisin-içermeyen MEM Alpha Modifikasyonu içeren 20 mL ortam ile doldurun. Doku eksplantlarının oryantasyonlarından çıkmasını önlemek için büyüme ortamını yanlar boyunca yavaşça ekleyin. Kuluçka sırasında doku eksplantları tarafından ıslatılacak bir fraksiyonu hesaba katmak için fazla ortam ekleyin.
8. 3 günlük inkübasyondan sonra, kültürlere taze ortam ekleyin. Bulaşıkları tutarken kültürlerin şoklardan ve eksplantların hareketlerinden korunduğundan emin olun.
9. 1 hafta sonra, steril forseps kullanarak doku parçalarını ayrı ayrı çıkarın ve bertaraf için uygun biyolojik tehlike torbaları kullanarak atın. Mevcut ortamı koruyun ve 10 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Bireysel koloniler% 70'lik bir birleşime ulaşana kadar büyüme ortamını her 4 günde bir değiştirin.
   NOT: Hücrelerin çanak boyunca eşit olarak dağılmaması muhtemeldir, çünkü zamanla birleşmesi için izlenmesi gereken bireysel proliferatif koloniler olacaktır. Genel olarak, bir ay içinde, 10^cm2'lik bir çanak, ayrı bir kaba bölünmek için yeterli hücre üretir.
10. Tripsin / EDTA çözeltisi (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde [HBSS]'de% 1x% 0.25 tripsin ve% 0.02 EDTA) kullanarak yapışkan hücreleri toplayın. Hücre süspansiyonunu 470 × g'da 25 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini büyüme ortamında yeniden askıya alın.

2. uMSCS'nin immünofenotiplenmesi ve yayılması

1. Yapışkan hücreler% 50-60 birleşimine ulaştığında ve iyi yayıldığında immünofenotiplemeye geçin. MSC işaretleyici analizini tam akıcı kültürler üzerinde yapmayın, çünkü bu anahtar MSC belirteçlerinin aşağı regülasyonuna neden olma eğilimindedir.
2. Tripsinizasyondan sonra, FACS tüplerinde 1 × 10⁶ hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu dağıtın (1 × 10⁵ hücre / tüp) ve uygun florofora bağlı antikorlarla (hepsi 1:50 seyreltme) kombinasyon halinde boyanın: lekelenmemiş; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (ortak florofor); Her florofor için izotip kontrolleri. Daha fazla analiz için akış sitometresine en az 10.000 toplam olay sayısı kaydedin.
   NOT: Hücreler her yüzey işaretçisi için ayrı ayrı analiz edildiğinden, hücre alt kümeleri üzerinde geçit gerekli değildir.
3. Yukarıdaki belirteçlere ek olarak, bireysel kordon dokusu örneklerinden oluşturulan uMSC hatlarında pozitif ve negatif yüzey belirteçlerinin varlığını doğrulamaktadır (Tablo 1).
4. Etiketli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve CD105 + CD90 + ve CD105 ⁺ CD73 ⁺ hücrelerinin yüzdesini belirleyin. CD105⁺ ve CD34⁻CD45⁻ hücrelerini ayrı ayrı analiz edin.

3. uMSC'lerin iskelet kasına farklılaşması

1. PBS'de %0.01 kollajen ve 20 μg/mL laminin içeren doku kültürü plakalarını kaplayın. Bu plakaları oda sıcaklığında en az 4 saat kaplayın.
2. Büyüme ortamında 10.000 hücre/^cm2 yoğunlukta plaka uMSC'ler.
3. Hücreler% 70 birleştiğinde, büyüme ortamını aspire edin ve kültürleri PBS ile 2 kat durulayın. uMSC'lere DMEM +% 5 at serumu + 0.1 μM deksametazon + 50 μM hidrokortizondan oluşan miyojenik farklılaşma ortamı (M1) ekleyin. Miyojenik progresyonun kinetiğinin belirlenmesi için, kültürlere her gün M1 ortamı ekleyin.
4. Miyojenik progresyonun kinetiğini belirlemek için, sırasıyla 2 gün, 4-5 gün, 6-7 gün ve 10-14 günde Pax7, MyoD, Myogenin ve MyHC ekspresyonu için uMSC'leri analiz edin.

Sonuçlar

uMSC'lerin kordon dokusundan izole edilmesinin başarısı, tam kordon kanından elde edilen zayıf başarı oranlarının aksine% >95'tir. uMSC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi üzerine, FACS analizi tüm hücrelerin CD34-CD45-CD105 ⁺ CD90 ⁺ olduğunu ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, karşılaştırmalı analizde, kordon kanından izole edilen uMSC'ler, hücrelerin bir kısmının CD34 + CD45 + CD105 ⁺ (~% 15) gösterdiği heterojen pop...

Tartışmalar

Kritik adımlar
Bu protokoldeki kritik bir adım, tüm yayılma süresi boyunca, doğum anından steril kültürlerin bakımına kadar aseptik koşullar altında dokunun toplanmasıdır. Kordon toplama sırasında, kordonun sterilize edilmemiş herhangi bir yüzeye temas etmemesi ve antibiyotik takviyeli PBS içeren tüplerde toplanmadan önce% 70 etanol ile harici olarak temizlenmesi esastır. uMSC izolasyonu için kordon toplanması ve dokunun işlenmesi arasındaki süreyi sınırlamak önemlidir. ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)	HiMedia	A001A-50mL
Anti-GAPDH antibody	Sigma Aldrich	G8795
Anti-MyHC antibody (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anti-MyoD antibody (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anti-Pax7 antibody	DSHB	DSHB-C1-576
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	559869
Collagen Type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexamethasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II or FACSAria III	BD Biosciences
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil	GIBCO	10270106	not to be heat-inactivated
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59	BD Biosciences	557508
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1264
Horse serum	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminin	Merck	L2020
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides	Hyclone	SH30568.FS	Basal medium for uMSCs
PE Mouse anti-human CD105 clone 266	BD Biosciences	560839
PE Mouse anti-human CD44 clone 515	BD Biosciences	550989
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4	HiMedia	M1866
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL