JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول الفحص المجهري الفلوري الخفيف والأساليب الآلية بمساعدة البرمجيات لتصور طفيليات المثقبيات والخلايا التائية المنتشرة والنائمة في الأعضاء والأنسجة السليمة والواضحة وتحديدها كميا بدقة. توفر هذه التقنيات طريقة موثوقة لتقييم نتائج العلاج وتقديم رؤى جديدة حول التفاعلات بين الطفيليات والمضيف.

Abstract

مرض شاغاس هو مرض مهمل يؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم ، وخاصة في أمريكا اللاتينية. عامل مرض شاغاس ، Trypanosoma cruzi (T. cruzi) ، هو طفيلي ملزم داخل الخلايا مع بيولوجيا متنوعة تصيب العديد من أنواع الثدييات ، بما في ذلك البشر ، مما يسبب أمراض القلب والجهاز الهضمي. لطالما كانت هناك حاجة إلى الكشف الموثوق به عن عدوى T. cruzi في الجسم الحي لفهم البيولوجيا المعقدة لمرض شاغاس وتقييم نتائج أنظمة العلاج بدقة. يوضح البروتوكول الحالي خط أنابيب متكامل للقياس الكمي الآلي للخلايا المصابة ب T. cruzi في الأعضاء المعاد بناؤها وتطهيرها بتقنية 3D. يسمح الفحص المجهري الفلوري ذو الألواح الضوئية بتصور دقيق وتحديد كمي لطفيليات T. cruzi المنتشرة والنائمة بنشاط والخلايا المستجيبة المناعية في الأعضاء أو الأنسجة بأكملها. أيضا ، تم اعتماد خط أنابيب CUBIC-HistoVision للحصول على علامات موحدة للأعضاء التي تم تطهيرها بالأجسام المضادة والبقع النووية بنجاح. يوفر تطهير الأنسجة إلى جانب التلطيخ المناعي 3D نهجا غير متحيز لتقييم بروتوكولات العلاج الدوائي بشكل شامل ، وتحسين فهم التنظيم الخلوي للأنسجة المصابة ب T. cruzi ، ومن المتوقع أن يعزز الاكتشافات المتعلقة بالاستجابات المناعية المضادة ل T. cruzi ، وتلف الأنسجة ، والإصلاح في مرض شاغاس.

Introduction

يعد مرض شاغاس ، الذي يسببه الطفيلي الأولي T. cruzi ، من بين أكثر الأمراض المدارية إهمالا في العالم ، مما يتسبب في حوالي 13000 حالة وفاة سنوية. غالبا ما تتطور العدوى من مرحلة حادة إلى مرحلة مزمنة تنتج أمراض القلب في 30٪ من المرضى ، بما في ذلك عدم انتظام ضربات القلب وفشل القلب والموت المفاجئ 1,2. على الرغم من الاستجابة المناعية القوية للمضيف التي أثيرت ضد الطفيلي خلال المرحلة الحادة ، إلا أن أعدادا منخفضة من الطفيليات تستمر بشكل مزمن طوال حياة المضيف في أنسجة مثل القلب والعضلات الهيكلية. قد تساهم عدة عوامل ، بما في ذلك تأخر ظهور الاستجابات المناعية التكيفية ووجود أشكال غير متكررة من الطفيلي ، في قدرة T. cruzi على تجنب القضاء التام من قبل الجهاز المناعي3،4،5،6. علاوة على ذلك ، فإن الأشكال النائمة غير المكررة للطفيلي تظهر قابلية منخفضة للعقاقير المثقبسية وقد تكون مسؤولة جزئيا عن فشل العلاج الذي لوحظ في كثير من الحالات 7,8.

يوفر تطوير تقنيات تصوير جديدة فرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التوزيع المكاني للطفيليات في الأنسجة المصابة وعلاقتها بالخلايا المناعية المشاركة في السيطرة عليها. هذه الخصائص حاسمة لفهم أفضل لعمليات السيطرة على الطفيليات من قبل الجهاز المناعي وتتبع الطفيليات النائمة النادرة الموجودة في الأنسجة المزمنة.

يعد الفحص المجهري الفلوري ذو الألواح الضوئية (LSFM) أحد أكثر الطرق شمولا وغير متحيزة للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة أو الأعضاء الكبيرة دون تقسيم رقيق. تستخدم المجاهر ذات الألواح الضوئية صفيحة رقيقة من الضوء لإثارة الفلوروفورات فقط في المستوى البؤري ، وتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية للعينات ، وتسجيل صور لآلاف طبقات الأنسجة باستخدام كاميرات فائقة السرعة. يتم الحصول على المستوى العالي من شفافية الأنسجة اللازمة للاختراق السليم لضوء الليزر في الأنسجة عن طريق تجانس معامل الانكسار (RI) بعد إزالة الدهون من الأنسجة وإزالة اللون ، مما يقلل من تشتت الضوء ويجعل الصور عالية الجودة9،10،11.

تم تطوير أساليب تطهير الأنسجة لتصوير الفئران الكاملة 12،13،14 ، والمواد العضوية 15،16،17 ، والأعضاء التي تعبر عن علامات الفلورسنت المراسلة18،19،20،21،22،23 ، ومؤخرا عدد محدود من الأنسجة البشرية 24 . تصنف الطرق الحالية لإزالة الأنسجة إلى ثلاث عائلات: (1) الطرق القائمة على المذيبات العضوية مثل بروتوكولات DISCO 25,26 ، (2) الطرق القائمة على الهيدروجيل ، مثل CLARITY27 ، والطرق المائية ، مثل CUBIC (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة وغير المعيقة والتحليل الحسابي) 18,19,28,29 . تحافظ بروتوكولات CUBIC على شكل العضو وسلامة الأنسجة ، مع الحفاظ على تألق البروتينات المراسلة الداخلية المعبر عنها. يسمح آخر تحديث لهذه التقنية ، CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV) ، أيضا بالكشف عن الظواهر باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت ووضع علامات الحمض النووي28.

في هذا البروتوكول ، تم استخدام خط أنابيب CUBIC للكشف عن T. cruzi الذي يعبر عن البروتينات الفلورية في أنسجة الفئران السليمة الواضحة. تم تصوير الأنسجة الشفافة بصريا LSFM ، وإعادة بناء 3D ، وتم تحديد العدد الإجمالي الدقيق للخلايا المصابة ب T. cruzi ، و amastigotes النائمة ، والخلايا التائية لكل عضو تلقائيا. أيضا ، تم اعتماد هذا البروتوكول بنجاح للحصول على علامات موحدة للأعضاء التي تم تطهيرها مع الأجسام المضادة والبقع النووية. هذه النهج ضرورية لفهم توسع ومكافحة T. cruzi في المضيفين المصابين وهي مفيدة للتقييم الكامل للعلاجات الكيميائية والمناعية لمرض شاغاس.

Protocol

أجريت هذه الدراسة بما يتفق تماما مع سياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وجمعية تقييم واعتماد المبادئ التوجيهية لاعتماد رعاية المختبرات. تمت الموافقة على بروتوكول استخدام الحيوانات (مكافحة عدوى T. cruzi في الفئران-A2021 04-011-Y1-A0) من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة جورجيا. ب 6. تم استخدام C+A2:A44g-GT(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J و C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J الفئران (الإناث،1-2 أشهر من العمر) لهذه الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. العدوى والتروية والتشريح

  1. تصيب الفئران داخل الصفاق بسلالة T. cruzi المشتقة من زراعة الأنسجة من كولومبيا (DTU TcI) أو البرازيل (DTU TcV) T. cruzi التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت tdTomato أو GFP ، على التوالي. يمكن أن تتراوح جرعة العدوى من 50000 إلى 200000 تريبوماستيجوت مخفف في 100 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: تتوفر تفاصيل محددة حول توليد طفيليات المراسلين ونماذج الفئران للعدوى في Canavaci et al. (29) وبوستامانتي وآخرون.30.
  2. القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بمعدل تدفق 3-7 لتر / دقيقة. بمجرد أن تتوقف الحيوانات عن إظهار أي رد فعل دواسة ، قم بعمل شق طولي عبر الجلد من البطن نحو القص. ثم قطع جدار الجسم من البطن والاستمرار من خلال الأضلاع على كل جانب من جوانب الصدر حتى يمكن رفع القص بعيدا ، مما يعرض القلب.
  3. كما هو موضح في الشكل 1 ، قم بعمل شق 2.5 مم في الأذن اليمنى للقلب وجمع الدم المستنزف باستخدام طرف ماصة دقيقة 1 مل.
  4. أدخل إبرة فراشة (متصلة بأحد طرفي نظام التروية) في قمة البطين الأيسر حتى تصل إلى الشريان الأورطي الصاعد. استخدم الغراء القائم على الهلام (انظر جدول المواد) لإغلاق فتحة المدخل حول الإبرة والحفاظ على الإبرة في موضعها أثناء التروية.
  5. قم بفحص الفئران30 مع 50 مل من الهيبارين-PBS البارد (الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 10 U / mL من الهيبارين) أو حتى يصبح السائل الذي يخرج من الماوس نحو صينية التجميع خاليا من الدم.
  6. بيرفيوز مع 50 مل من البرد 4٪ (ث / v) بارافورمالديهايد (PFA) (الرقم الهيدروجيني 7.4) في PBS.
    ملاحظة: من المحتمل أن يكون تثبيت أنسجة PFA أحد الخطوات الحاسمة للبروتوكول ، خاصة للحفاظ على هياكل epitope والكشف المناعي اللاحق. يتحلل PFA بمرور الوقت ، لذلك يجب إعداده طازجا. الرقم الهيدروجيني للمحلول مهم أيضا لتجنب الإفراط في التثبيت ، مما قد يؤدي إلى ضعف إزالة الأنسجة.
    تحذير: PFA سامة بشكل معتدل عن طريق ملامسة الجلد. التعرض الحاد هو أيضا مزعج للغاية للأنف والعينين والحلق. قد يسبب التعرض على المدى الطويل لمستويات منخفضة في الهواء أو الجلد تهيج الجلد مثل التهاب الجلد والحكة ، ومشاكل في الجهاز التنفسي تشبه الربو. ارتد حماية الوجه والعين ولا تتنفس الغبار أو الغاز أو الضباب أو الأبخرة أو الأبخرة.
    1. بعد تروية PFA ، قم بدمج الماوس مع 100 مل من المخزن المؤقت CUBIC-P للوصول إلى مستويات التوضيح المذكورة في الخطوة 1.5.
    2. لإعداد المخزن المؤقت CUBIC-P ، قم بإذابة 10٪ N-butyldiethanolamine و 5٪ Triton X-100 و 5٪ 1-N-Methylimidazole في ماء مقطر مزدوج أو استخدم الكوكتيلات التجارية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: الخطوات 1.6.1.-1.6.2. يوصى بها فقط للأعضاء شديدة التصبغ مثل القلب والكلى لأنها تتطلب خطوة ما قبل التطهير للحصول على مستويات متزايدة من الشفافية. بعد استخدام CUBIC-P ، قم بتشريح الأعضاء وانتقل مباشرة إلى الخطوة 2: تطهير الأنسجة.
  7. تشريح عينات الأنسجة / الأعضاء 30 ليتم تصويرها وبعد إصلاحها في 4٪ (ث / v) PFA في PBS (~ 10 مل / عضو كامل) بين عشية وضحاها (ON) في 4 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (لا يزيد عن 5 × غرام) في أنابيب مخروطية50 مل.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الحضانات من الآن فصاعدا على أنابيب موضوعة أفقيا عند 20-30 درجة مئوية محمية من الضوء.
  8. اغسل العينة في 10 مل من PBS (مع استكمالها ب 0.05٪ من أزيد الصوديوم (NaN 3) لمدة3 ساعات (ثلاث مرات) في درجة حرارة الغرفة (RT) مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    ملاحظة: يمكن تجميد الأنسجة عن طريق احتضان 10 مل من السكروز بنسبة 30٪ في PBS مع اهتزاز لطيف (5 × جم) عند 4 درجات مئوية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. بعد أن تغرق الأنسجة في قاع الأنبوب ، قم بتضمينها في مركب OCT واحتفظ بها عند -80 درجة مئوية. تذوب في RT حتى يذوب مركب OCT تماما ، ثم تغسل في PBS (~ 10 مل / عضو كامل) ON عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في أنابيب مخروطية 50 مل. انتقل إلى الخطوة 2.

2. تطهير الأنسجة

ملاحظة: تم إجراء جميع عمليات إزالة الأنسجة التي أجريت في هذا العمل باستخدام بروتوكول CUBIC I22. تم استخدام ثلاثة كوكتيلات مختلفة: CUBIC-P لإزالة الدهون وإزالة اللون السريع أثناء التروية ، CUBIC-L لإزالة الدهون وإزالة اللون ، و CUBIC-R لمطابقة RI. تم إجراء تلطيخ الحمض النووي والتلطيخ المناعي باستخدام مجموعة التلطيخ النووي CUBIC-HV 1 3D ومجموعة التلطيخ المناعي CUBIC-HV 1 3D ، على التوالي (انظر جدول المواد).

  1. اغمر الأعضاء الفردية في 10 مل من CUBIC-L المخفف بالماء بنسبة 50٪ (انظر جدول المواد) مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في RT (ON) في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. حافظ على الأنابيب مسطحة على لوحة الاهتزاز.
    ملاحظة: لتجنب تلف الأنسجة ، يتم الحفاظ على الأعضاء في نفس الأنبوب ، ويتم جمع المحاليل باستخدام نظام فراغ. لتحضير CUBIC-L ، قم بإذابة 10٪ N-butyldiethanolamine و 10٪ Triton X-100 في ماء مقطر مزدوج باستخدام الكوكتيلات التجارية (انظر جدول المواد).
    تحذير: يسبب CUBIC-L تلفا خطيرا في العين. ارتداء حماية العين والوجه. تخلص منها في محطة معتمدة للتخلص من النفايات.
  2. اغمر العينة في 10 مل من 100٪ CUBIC-L لمدة 6 أيام (تحديث المحلول في اليوم 3).
    ملاحظة: في نهاية فترة الحضانة هذه ، يجب أن تكون الأنسجة شفافة تماما تقريبا.
  3. اغسل الأعضاء الشفافة باستخدام PBS (مع 0.05٪ NaN3) لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم). انقل المناديل الورقية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل مع كل غسل لإزالة Triton X-100.
    ملاحظة: كما هو موضح في الشكل 2B، إذا كان الهدف من التجربة هو تصور بروتينات المراسل المعبر عنها داخليا من طفيليات T. cruzi المعدلة وراثيا أو الفئران (الشكل 2C-F)، تخطي الخطوات 3 و 4 و 5 واستمر مباشرة إلى الخطوة 6.

3. تلطيخ الحمض النووي

  1. قم بتخفيف صبغة الحمض النووي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) في 5 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ (المضمن في المجموعة) عند تخفيف 1/2500.
  2. اغمر الأنسجة في محلول الصبغة النووية واحتضنها عند 37 درجة مئوية مع دوران لطيف لمدة 5 أيام باستخدام أنابيب مخروطية 15 مل في وضع الوقوف.
  3. يغسل ب 15 مل من المخزن المؤقت للغسيل النووي ثلاثي الأبعاد (المضمن في المجموعة) لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) في RT مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    ملاحظة: يمكن استخدام أصباغ الحمض النووي الأخرى في هذه التركيزات وأوقات الحضانة: DAPI (المدرجة في المجموعة): 1/200 ، حضانة لمدة 5 أيام. BOBO-1: 1/400 ، حضانة لمدة 5 أيام ؛ يوديد البروبيديوم (PI) (المدرجة في المجموعة): 1/100 ، حضانة لمدة 3 أيام ؛ RedDot2: 1/250 ، حضانة لمدة 3 أيام. إذا كان الهدف المحدد من التجربة هو تصور كل من بروتينات المراسل المعبر عنها داخليا واستخدام البقع النووية ، فتخطى الخطوتين 4 و 5 واستمر مباشرة إلى الخطوة 6.

4. هضم المصفوفة خارج الخلية (ECM)

ملاحظة: يجب إجراء هضم هيالورونيداز ل ECM لتسهيل الاختراق السليم للأجسام المضادة في المناطق العميقة من الأنسجة28.

  1. اغمر الأعضاء الفردية في 15 مل من المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل في وضع مسطح محمي من الضوء.
    ملاحظة: لإعداد المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز ، قم بإذابة 10 mM من CAPSO ؛ 150 مللي متر من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 0.05٪ من NaN3 (انظر جدول المواد) في الماء المقطر المزدوج وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10.
  2. تحضير محلول الإنزيم عن طريق خلط 75 ميكرولتر من 20 ملغ / مل من مخزون الهيالورونيداز في 425 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز. لإعداد 20 ملغ / مل من مخزون الهيالورونيداز ، قم بإذابة الهيالورونيداز في 50 ملليمتر من المخزن المؤقت للكربونات ، و 150 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، و 0.01 ٪ من BSA ، و 0.05 ٪ من NaN3 (انظر جدول المواد). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10 و aliquot في أحجام 77 ميكرولتر عند -30 درجة مئوية.
  3. تخلص من المخزن المؤقت لتفاعل الهيالورونيداز باستخدام ماصة واغمر العضو في محلول الإنزيم (500 ميكرولتر في أنبوب مخروطي 15 مل) في وضع الوقوف المحمي من الضوء لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
  4. اغسل العينة في 15 مل من المخزن المؤقت لغسيل الهيالورونيداز في أنبوب مخروطي سعة 50 مل في وضع أفقي محمي من الضوء لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    1. لإعداد المخزن المؤقت لغسيل الهيالورونيداز ، قم بإذابة 50 مللي متر من المخزن المؤقت للكربونات ، و 150 ملليمتر من كلوريد الصوديوم ، و 0.1٪ (v / v) من Triton X-100 ، و 5٪ (v / v) من الميثانول ، و 0.05٪ NaN3. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10. لإعداد مخزون كلوريد الصوديوم العازل 10x من الكربونات ، قم بإذابة 2.96 جم من كربونات الصوديوم ، و 1.86 جم من كربونات هيدروجين الصوديوم ، و 8.77 جم من كلوريد الصوديوم في 100 مل من الماء المقطر المزدوج مع 0.05٪ NaN3 (انظر جدول المواد) واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10.

5. تلطيخ المناعة

  1. قم بتسمية الأوعية الدموية باستخدام الأجسام المضادة المضادة α-SMA (أكتين العضلات الصغيرة ألفا ، انظر جدول المواد) باتباع الخطوات أدناه.
    1. توليد الأولية بالإضافة إلى مجمع الأجسام المضادة الثانوية Fab شظايا مترافقة. ابدأ هذا التفاعل قبل 1.5 ساعة من إجراء التلطيخ.
      1. احسب الكمية المطلوبة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية (اخلطها بنسبة 1:0.5 بالوزن).
        ملاحظة: بالنسبة للجسم المضاد الأساسي المضاد α-SMA ، هناك حاجة إلى 3.5 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 2.5 مجم / مل ، هناك حاجة إلى 3.5 / 2.5 = 1.4 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة. بالنسبة للجسم المضاد الثانوي AlexaFluor 647 المضاد للفأر Fab ، هناك حاجة إلى 1.75 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 1.7 ملغم / مل ، هناك حاجة إلى 1.75 / 1.7 = 1 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة.
      2. امزج الأجسام المضادة الأولية والثانوية في أنبوب كهرماني سعة 2 مل واحتضنها لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. للتبادل العازل، امزج 7.5 مل من المخزن المؤقت للبقع المناعية HV1 3D 2x (المضمن في المجموعة، انظر جدول المواد) مع 7.5 مل من الماء المقطر المزدوج واغمر عينة الأنسجة لمدة 1.5 ساعة عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في أنبوب مخروطي 15 مل في وضع أفقي. ابدأ هذا التفاعل في وقت واحد كتوليد مركب الأجسام المضادة (1.5 ساعة قبل إجراء التلطيخ المناعي).
  2. أداء 3D تلطيخ المناعة باتباع الخطوات أدناه.
    1. في أنبوب مخروطي 15 مل ، قم بإعداد محلول تلطيخ الأجسام المضادة بعد الملف التكميلي 1.
    2. اجمع عينة الأنسجة من وسائط التبادل العازلة (الخطوة 5.1.2) واغمرها في محلول تلطيخ الأجسام المضادة. احتضان الأنسجة بشكل فردي لمدة 1 أسبوع عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم) للأنابيب في وضع الوقوف المحمي من الضوء. ختم الأنبوب مع فيلم البارافين لتجنب التبخر.
    3. انتقل إلى 4 درجات مئوية واحتضن ON في وضع الوقوف.
    4. قم بتبريد 1x HV1 3D مناعي غسل الغسيل العازل (المدرجة في المجموعة ، انظر جدول المواد) إلى 4 درجات مئوية واغسل العينة بمخزن مؤقت 15 مل (مرتين) لمدة 30 دقيقة لكل منها عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم). احتفظ بأنابيب مخروطية سعة 15 مل في وضع أفقي حتى الخطوة 5.2.7.
    5. قم بتخفيف الفورمالين إلى 1٪ في 1x HV1 3D مناعي غسل المخزن المؤقت وغمر العينة في 8 مل من المحلول لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    6. احتضان في محلول الفورمالين الطازج بنسبة 1٪ لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
    7. يغسل في 15 مل من PBS لمدة 2 ساعة عند 25 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف (5 × جم).
  3. عزز إشارة tdTomato باستخدام الأجسام المضادة للبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) باتباع الخطوات أدناه.
    1. اتبع نفس أوقات الحضانة ودرجات الحرارة كما في الخطوة 5.2.2. احسب كمية الأجسام المضادة الأولية والثانوية (انظر جدول المواد) واخلطها بنسبة 1:0.5 بالوزن.
      ملاحظة: بالنسبة للأجسام المضادة الأولية المضادة RFP ، هناك حاجة إلى 5 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 1.25 مجم / مل ، يلزم 5/1.25 = 4 ميكرولتر من المحلول. بالنسبة للجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 647 المضاد للأرانب Fab ، هناك حاجة إلى 2.5 ميكروغرام لتسمية القلب بأكمله أو جزء من العضلات الهيكلية ذات الأبعاد المماثلة. بالنسبة لمنتج 1.5 مجم / مل ، هناك حاجة إلى 2.5 / 1.5 = 1.7 ميكرولتر من المحلول.
    2. تحضير محلول تلطيخ الأجسام المضادة كما هو مذكور في الملف التكميلي 1.
  4. عزز إشارات GFP باستخدام الأجسام النانوية المضادة ل GFP باتباع الخطوات أدناه.
    1. اتبع نفس أوقات الحضانة ودرجات الحرارة كما هو مذكور في الخطوة 5.2.2.
      ملاحظة: الأجسام النانوية المضادة ل GFP (انظر جدول المواد) مقترنة ب Alexa Fluor 647 ، وبالتالي فإن توليد الأجسام المضادة المعقدة غير ضروري.
    2. تحضير محلول تلطيخ الأجسام المضادة كما هو مذكور في الملف التكميلي 1.

6. مطابقة RI

  1. اغمر الأعضاء الشفافة في 5 مل من محلول CUBIC-R + المخفف بالماء بنسبة 50٪ (انظر جدول المواد) في RT (ON) مع اهتزاز لطيف (5 × جم) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. حافظ على الأنابيب في وضع الوقوف خلال خطوة مطابقة المثيل المحجوز بالكامل.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام حلول CUBIC R+ المعاد تدويرها من التجارب السابقة (حتى أربع مرات) في هذه الخطوة. لإعداد محلول CUBIC-R + ، قم بإذابة 45٪ من 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine) ، و 30٪ من Nicotinamide أو N-Methylnicotinamide ، و 0.5٪ من N-butyldiethanolamine في الماء المقطر المزدوج أو استخدم المخزن المؤقت CUBIC-R + التجاري (انظر جدول المواد).
    تحذير: يسبب CUBIC-R+ تهيج الجلد وتهيج العين الخطير وتلف الأعضاء. ارتداء قفازات واقية، وضمان حماية العين والوجه. لا تتنفس الغبار أو الأبخرة أو الغاز أو الضباب أو الأبخرة. التخلص منها في محطة معتمدة للتخلص من النفايات.
  2. استبدل 50٪ CUBIC-R + ب 5 مل من 100٪ CUBIC-R + واحتضنه باهتزاز لطيف (5 × جم) في RT لمدة يومين. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى كومة من المناديل المبللة الخالية من الوبر وقم بتدوير الأنسجة بعناية لإزالة محلول CUBIC-R + من أسطح الأعضاء لمدة 5 دقائق.

7. تصاعد

  1. بعد تجفيف الأنسجة ، انقلها إلى 5 مل من محلول التركيب (RI = 1.520) (انظر جدول المواد) في لوحة زراعة خلايا من ستة آبار واحتضنها (ON) في RT. قم بتدوير الأنسجة بشكل متكرر للقضاء على فقاعات الهواء ، خاصة على أسطح الأعضاء.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأعضاء لأكثر من 6 أشهر في محلول التركيب أو CUBIC-R+.
  2. التزم الأنسجة بحامل عينة المجهر باستخدام غراء هلام قائم على سيانواكريلات.
  3. اغمر العينات في كوفيت كوارتز المجهر المملوء ب 120 مل من محلول التركيب وصورها بشكل عرضي إلى محورها الطولي. التمسك القلب مع القمة والشريان الأورطي محاذاة أفقيا.
    ملاحظة: يمكن تقسيم الأعضاء التي تم تطهيرها وتركيبها باستخدام اهتزاز وتصويرها بتكبير عال بواسطة الفحص المجهري البؤري. تضمين الأعضاء في 2 ٪ agarose وقطع أقسام من 100-500 ميكرومتر. يمكن أيضا تقسيم الأعضاء يدويا بشفرة حادة لإنتاج مقاطع الأنسجة السميكة (>1000 ميكرومتر). بعد التقسيم ، ضع الشرائح في أطباق بتري ذات قاع زجاجي 35 مم ، وقم بالتركيب باستخدام نفس محلول التركيب ، وختم بطلاء الأظافر ، وصورة باستخدام مجهر متحد البؤرة.

8. الحصول على الصور

  1. صور العينات المثبتة باستخدام مجهر ورقة الضوء (انظر جدول المواد). اضبط التكبير وحجم الخطوة بين الشرائح الفردية على 3 ميكرومتر، واستخدم ليزر ورقة الضوء اليمنى واليسرى بسماكة 5 ميكرومتر وعرض 100٪. اضبط وقت التعرض الثابت على 50-100 مللي ثانية ، واضبط طاقة الليزر من 10٪ إلى 80٪ اعتمادا على شدة إشارة التألق.
    1. للكشف المشترك عن الطفيليات المعبرة عن الطماطم والأماستيجوت النائمة الملطخة ب DiR (الشكل 2C) ، استخدم القنوات الحمراء (Ex / Em 561/620-660 nm) والأشعة تحت الحمراء (Ex / Em 785/845-55 nm) ، على التوالي. للكشف المشترك عن الخلايا التائية والطفيليات المعبرة عن الطماطم في ماوس مراسل CD8 (الشكل 2D) ، استخدم القناة الخضراء (Ex / Em 488/525-50 nm) والقناة الحمراء ، على التوالي.
    2. بالنسبة لمقايسات العدوى المشتركة (الشكل 2E) ، وكذلك للكشف المشترك عن الطفيليات التي تعبر عن GFP في الفئران مراسلة النوى (الشكل 2F) ، استخدم القنوات الخضراء والحمراء ، على التوالي. للكشف عن الطفيليات المعبرة عن الطماطم ، والصبغة النووية ، والأوعية الدموية القلبية (الشكل 3B ، C) ، استخدم القنوات الحمراء والخضراء والحمراء البعيدة (Ex / Em 640/680-730 nm) ، على التوالي.
    3. الكشف عن الأجسام المضادة المضادة RFP مع القناة الحمراء البعيدة والأجسام النانوية المضادة ل GFP باستخدام القناة الخضراء (الشكل 3D).
  2. قم بتحويل مكدسات صور TIFF المكتسبة وإعادة بناء الأعضاء ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج Imaris v9.7.2 (انظر جدول المواد).

9. إعادة بناء السطح وتحديد كميته باستخدام برنامج Imaris

  1. حدد أداة خوارزمية اكتشاف الأسطح وابدأ المعالج في برنامج تحليل الصور.
  2. قم بإجراء تحليل أولي في منطقة اهتمام ثلاثية الأبعاد (تم اختيارها عشوائيا) ثم قم بتطبيقه على إعادة بناء الجهاز ثلاثي الأبعاد بأكمله. بعد اختيار منطقة الاهتمام (ROI) ، حدد القناة المراد تحليلها ، وقم بإلغاء تحديد الزر السلس ، وحدد طرح الخلفية.
    ملاحظة: يقوم طرح الخلفية بحساب قيمة خلفية محلية فريدة لكل فوكسل ويطرحها من قيمة البيكسل الأصلية. يجب أن يصل قطر أكبر كرة تتناسب مع الجسم إلى 200 ميكرومتر للخلايا المصابة ب T. cruzi ، و 10 ميكرومتر للخلايا التائية ، و 5 ميكرومتر للطفيليات الفردية.
  3. استخدم الرسم البياني لضبط التصنيف والقائمة المنسدلة عامل التصفية لتحديد قياسات التصنيف.
    ملاحظة: استخدم الرسم البياني لضبط التصنيف: يوصى بقياسات القطع الناقص (المفلطح) والكروية.
  4. قم بوضع اللمسات الأخيرة على المعالج، واضغط على زر الإحصاءات ، واسترجع العدد الإجمالي للخلايا المصابة بالطفيليات أو الخلايا التائية كعدد المكونات غير المتصلة لكل نقطة زمنية.

النتائج

تم غسل الأنسجة الثابتة المكعبة باستخدام PBS لإزالة المثبتات ثم تم احتضانها بكوكتيلات CUBIC-L ، وهو محلول أساسي مخزن مؤقتا من الكحول الأميني الذي يستخرج الأصباغ والدهون من الأنسجة مما يؤدي إلى إزالة لون الأنسجة مع الحفاظ على بنية الأنسجة. يمكن رؤية خطوط الشبكة في الورقة من خلال الأنسجة التي تش?...

Discussion

إن غياب التصوير الشامل للأعضاء الكاملة للطفيليات والاستجابة المناعية يحد من فهم تعقيد التفاعلات بين الطفيليات المضيفة ويعوق تقييم علاجات مرض شاغاس. اعتمدت هذه الدراسة خط أنابيب CUBIC لتوضيح وتلطيخ الأعضاء والأنسجة السليمة للفئران المصابة ب T. cruzi.

تم اختبار بروتوكولات إ...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر الدكتور إيتسو سوساكي على مساعدته القيمة وتوصياته فيما يتعلق ببروتوكولات تطهير الأنسجة والتلطيخ المناعي. أيضا ، نحن ممتنون ل M. Kandasamy من CTEGD Biomedical Microscopy Core على الدعم الفني باستخدام LSFM والتصوير البؤري. كما نشكر جميع أعضاء مجموعة تارلتون للأبحاث على اقتراحاتهم المفيدة طوال هذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved