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  • Resumen
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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo describe la microscopía fluorescente de lámina de luz y los métodos automatizados asistidos por software para visualizar y cuantificar con precisión los parásitos Trypanosoma cruzi proliferantes y latentes y las células T en órganos y tejidos intactos y despejados. Estas técnicas proporcionan una forma confiable de evaluar los resultados del tratamiento y ofrecen nuevos conocimientos sobre las interacciones parásito-huésped.

Resumen

La enfermedad de Chagas es una patología desatendida que afecta a millones de personas en todo el mundo, principalmente en América Latina. El agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), es un parásito intracelular obligado con una biología diversa que infecta a varias especies de mamíferos, incluidos los humanos, causando patologías cardíacas y digestivas. La detección confiable de infecciones in vivo por T. cruzi ha sido necesaria durante mucho tiempo para comprender la compleja biología de la enfermedad de Chagas y evaluar con precisión el resultado de los regímenes de tratamiento. El protocolo actual demuestra una tubería integrada para la cuantificación automatizada de células infectadas por T. cruzi en órganos reconstruidos y despejados en 3D. La microscopía fluorescente de lámina de luz permite visualizar y cuantificar con precisión los parásitos T. cruzi que proliferan activamente y están latentes y las células efectoras inmunes en órganos o tejidos completos. Además, se adoptó con éxito la tubería CUBIC-HistoVision para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. La limpieza de tejidos junto con la inmunotinción 3D proporciona un enfoque imparcial para evaluar exhaustivamente los protocolos de tratamiento farmacológico, mejorar la comprensión de la organización celular de los tejidos infectados por T. cruzi y se espera que avance en los descubrimientos relacionados con las respuestas inmunes anti-T. cruzi, el daño tisular y la reparación en la enfermedad de Chagas.

Introducción

La enfermedad de Chagas, causada por el parásito protozoario T. cruzi, es una de las enfermedades tropicales más desatendidas del mundo, causando aproximadamente 13.000 muertes anuales. La infección a menudo progresa de una etapa aguda a una crónica produciendo patología cardíaca en el 30% de los pacientes, incluyendo arritmias, insuficiencia cardíaca y muerte súbita 1,2. A pesar de la fuerte respuesta inmune del huésped provocada contra el parásito durante la fase aguda, un bajo número de parásitos persiste crónicamente durante toda la vida del huésped en tejidos como el corazón y el músculo esquelético. Varios factores, incluyendo el inicio tardío de las respuestas inmunes adaptativas y la presencia de formas no replicantes del parásito, pueden contribuir a la capacidad de T. cruzi para evitar una eliminación completa por el sistema inmune 3,4,5,6. Además, las formas latentes no replicantes del parásito muestran una baja susceptibilidad a los fármacos tripanocidas y pueden ser en parte responsables del fracaso del tratamiento observado en muchos casos 7,8.

El desarrollo de nuevas técnicas de imagen brinda la oportunidad de obtener información sobre la distribución espacial de los parásitos en los tejidos infectados y su relación con las células inmunes involucradas en su control. Estas características son cruciales para una mejor comprensión de los procesos de control de parásitos por parte del sistema inmune y el seguimiento de los raros parásitos latentes presentes en los tejidos crónicos.

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) es uno de los métodos más completos e imparciales para obtener imágenes 3D de tejidos u órganos grandes sin sección delgada. Los microscopios de lámina de luz utilizan una fina lámina de luz para excitar solo los fluoróforos en el plano focal, reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad de las muestras, y grabar imágenes de miles de capas de tejido utilizando cámaras ultrarrápidas. El alto nivel de transparencia tisular necesario para la correcta penetración de la luz láser en los tejidos se obtiene homogeneizando el índice de refracción (IR) después de la deslipidación y decoloración tisular, lo que reduce la dispersión de la luz y produce imágenes de alta calidad 9,10,11.

Se han desarrollado enfoques de limpieza de tejidos para la obtención de imágenes de ratones enteros 12,13,14, organoides 15,16,17, órganos que expresan marcadores fluorescentes reporteros 18,19,20,21,22,23, y recientemente un número limitado de tejidos humanos 24 . Los métodos actuales para la limpieza de tejidos se clasifican en tres familias: (1) métodos basados en solventes orgánicos como los protocolos DISCO 25,26, (2) métodos basados en hidrogel, como CLARITY27, y métodos acuosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Los protocolos CUBIC mantienen la forma del órgano y la integridad del tejido, preservando la fluorescencia de las proteínas reporteras expresadas endógenamente. La actualización más reciente de esta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), también permite la detección de epítopos utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia y marcado de ADN28.

En el presente protocolo, se utilizó la tubería CUBIC para detectar T. cruzi expresando proteínas fluorescentes en tejidos de ratón intactos clarificados. Se obtuvieron imágenes de tejidos ópticamente transparentes, se reconstruyeron en 3D y se cuantificó automáticamente el número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes latentes y células T por órgano. Además, este protocolo se adoptó con éxito para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. Estos enfoques son esenciales para comprender la expansión y el control de T. cruzi en huéspedes infectados y son útiles para evaluar completamente la quimioterapia e inmunoterapéutica para la enfermedad de Chagas.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y las pautas de acreditación de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. El Protocolo de Uso de Animales (control de la infección por T. cruzi en ratones-A2021 04-011-Y1-A0) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia. B6. Para el presente estudio se utilizaron ratones C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J y C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (hembra,1-2 meses de edad). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).

1. Infección, perfusión y disección

  1. Infectar intraperitonealmente ratones con tripomastigotes derivados del cultivo tisular de la cepa T . cruzi de Colombiana (DTU TcI) o Brasil (DTU TcV) que expresan proteínas fluorescentes tdTomato o GFP, respectivamente. La dosis de infección podría variar de 50.000 a 200.000 tripomastigotes diluidos en 100 μL de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    NOTA: Los detalles específicos sobre la generación de parásitos reporteros y modelos de infección en ratones están disponibles en Canavaci et al. 29 y Bustamante et al.30.
  2. Eutanasia a los ratones por inhalación de dióxido de carbono a un caudal de 3-7 L/min. Tan pronto como los animales dejen de mostrar cualquier reflejo pedal, haga una incisión longitudinal a través de la piel desde el abdomen hacia el esternón. Luego corte la pared del cuerpo desde el abdomen y continúe a través de las costillas a cada lado del tórax hasta que el esternón pueda ser levantado, exponiendo el corazón.
  3. Como se describe en la figura 1, haga una incisión de 2,5 mm en la aurícula derecha del corazón y recoja la sangre drenante con una punta de micropipeta de 1 ml.
  4. Inserte una aguja de mariposa (conectada a un extremo del sistema de perfusión) en el ápice del ventrículo izquierdo hasta que llegue a la aorta ascendente. Use pegamento a base de gel (consulte la Tabla de materiales) para sellar el orificio de entrada alrededor de la aguja y mantener la aguja en posición durante las perfusiones.
  5. Perfundir los ratones30 con 50 ml de heparina-PBS fría (pH 7.4, 10 U/ml de heparina) o hasta que el líquido que sale del ratón hacia la bandeja de recolección esté libre de sangre.
  6. Perfundir con 50 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% (p/v) frío (pH 7.4) en PBS.
    NOTA: La fijación tisular de PFA es probablemente uno de los pasos críticos del protocolo, especialmente para mantener las estructuras de los epítopos y la posterior inmunodetección. El PFA se degrada con el tiempo, por lo que debe estar recién preparado. El pH de la solución también es importante para evitar la fijación excesiva, lo que podría conducir a una limpieza deficiente de los tejidos.
    PRECAUCIÓN: El PFA es moderadamente tóxico por contacto con la piel. La exposición aguda también es altamente irritante para la nariz, los ojos y la garganta. La exposición prolongada a niveles bajos en el aire o la piel puede causar irritación de la piel, como dermatitis y picazón, y problemas respiratorios similares al asma. Use protección para la cara y los ojos y no respire polvo, gas, niebla, vapores o vapores.
    1. Después de la perfusión de PFA, perfundir el ratón con 100 ml de tampón CUBIC-P para alcanzar los niveles de clarificación mencionados en el paso 1.5.
    2. Para preparar tampón CUBIC-P, disuelva 10% de N-butildietanolamina, Triton X-100 al 5% y 1-N-metilimidazol al 5% en agua de doble destilación o use los cócteles comerciales (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Pasos 1.6.1.-1.6.2. Se recomiendan solo para órganos altamente pigmentados como el corazón y el riñón, ya que requieren un paso previo de limpieza para obtener mayores niveles de transparencia. Después de usar CUBIC-P, diseccionar los órganos y proceder directamente al paso 2: Limpieza de tejidos.
  7. Diseccionar las muestras de tejido/órganos 30 para obtener imágenes y posfijarlas en 4% (p/v) PFA en PBS (~10 ml/órgano completo) durante la noche (ON) a 4 °C con agitación suave (no más de 5 x g) en tubos cónicos de50 ml.
    NOTA: Todas las incubaciones a partir de ahora deben realizarse en tubos colocados horizontalmente a 20-30 °C protegidos de la luz.
  8. Lavar la muestra en 10 ml de PBS (suplementado con azida sódica al 0,05% (NaN 3) durante3 h (tres veces) a temperatura ambiente (RT) con agitación suave (5 x g).
    NOTA: Los tejidos se pueden congelar incubando en 10 ml de sacarosa al 30% en PBS con agitación suave (5 x g) a 4 °C ON en tubos cónicos de 50 ml. Después de que los tejidos se hundan hasta el fondo del tubo, insértelos en el compuesto OCT y manténgalos a -80 °C. Descongelar a RT hasta que el compuesto OCT se derrita completamente, luego lavar en PBS (~10 mL/órgano entero) ON a 4 °C con agitación suave (5 x g) en tubos cónicos de 50 ml. Continúe con el paso 2.

2. Limpieza de tejidos

NOTA: Todos los aclaramientos de tejidos realizados en este trabajo se realizaron utilizando el protocolo CUBICI 22. Se utilizaron tres cócteles diferentes: CUBIC-P para la delipidación y la decoloración rápida durante las perfusiones, CUBIC-L para la delipidación y decoloración, y CUBIC-R para la coincidencia de RI. La tinción de ADN y las inmunotinciones se realizaron utilizando el kit de tinción nuclear CUBIC-HV 1 3D y el kit de inmunotinción CUBIC-HV 1 3D, respectivamente (ver Tabla de materiales).

  1. Sumerja los órganos individuales en 10 ml de CUBIC-L diluido en agua al 50% (consulte la Tabla de materiales) con agitación suave (5 x g) a RT (ON) en tubos cónicos de 50 ml. Mantenga los tubos planos sobre la placa de agitación.
    NOTA: Para evitar daños tisulares, los órganos se mantienen en el mismo tubo y las soluciones se recogen utilizando un sistema de vacío. Para preparar CUBIC-L, disuelva 10% de N-butildietanolamina y 10% de Triton X-100 en agua de doble destilación usando los cócteles comerciales (ver Tabla de materiales).
    PRECAUCIÓN: CUBIC-L causa daño ocular grave. Use protección para los ojos y la cara. Deseche en una planta de eliminación de residuos aprobada.
  2. Sumerja la muestra en 10 mL de 100% CUBIC-L durante 6 días (refrescando la solución el día 3).
    NOTA: Al final de este período de incubación, los tejidos deben ser casi completamente transparentes.
  3. Lavar los órganos transparentes con PBS (suplementado con NaN3 al 0,05%) durante 2 h (tres veces) a 37 °C con agitación suave (5 x g). Transfiera los tejidos a un nuevo tubo cónico de 50 ml con cada lavado para eliminar Triton X-100.
    NOTA: Como se describe en la Figura 2B, si el objetivo del experimento es visualizar proteínas reporteras expresadas endógenamente de parásitos transgénicos T. cruzi o ratones (Figura 2C-F), omita los pasos 3, 4 y 5 y continúe directamente al paso 6.

3. Tinción de ADN

  1. Diluir el colorante de ácido nucleico disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en 5 ml de tampón de tinción (incluido en el kit) a 1/2.500 de dilución.
  2. Sumergir el tejido en la solución de colorante nuclear e incubar a 37 °C con una rotación suave durante 5 días utilizando tubos cónicos de 15 ml en posición de pie.
  3. Lavar con 15 ml de tampón de lavado de tinción nuclear 3D (incluido en el kit) durante 2 h (tres veces) a RT con agitación suave (5 x g).
    NOTA: Se pueden usar otros colorantes de ADN en estas concentraciones y tiempos de incubación: DAPI (incluido en el kit): 1/200, 5 días de incubación; BOBO-1: 1/400, 5 días de incubación; Yoduro de propidio (PI) (incluido en el kit): 1/100, 3 días de incubación; RedDot2: 1/250, 3 días de incubación. Si el objetivo específico del experimento es visualizar ambas proteínas reporteras expresadas endógenamente y usar tinciones nucleares, omita los pasos 4 y 5 y continúe directamente al paso 6.

4. Digestión de la matriz extracelular (ECM)

NOTA: La digestión de la hialuronidasa de la ECM debe realizarse para facilitar la penetración adecuada de los anticuerpos en las regiones profundas de los tejidos28.

  1. Sumergir órganos individuales en 15 ml de tampón de reacción de hialuronidasa durante 2 h a 37 °C en un tubo cónico de 50 ml en posición plana protegido de la luz.
    NOTA: Para preparar el tampón de reacción de la hialuronidasa, disolver 10 mM de CAPSO; 150 mM de cloruro de sodio (NaCl), y 0,05% de NaN3 (ver Tabla de materiales) en agua de doble destilación y ajustar el pH a 10.
  2. Prepare la solución enzimática mezclando 75 μL de 20 mg/ml de stock de hialuronidasa en 425 μL de tampón de reacción de hialuronidasa. Para preparar 20 mg/ml de cepa de hialuronidasa, disuelva la hialuronidasa en 50 mM de tampón carbonato, 150 mM de NaCl, 0,01% de BSA y 0,05% de NaN3 (ver Tabla de materiales). Ajustar el pH a 10 y alícuota en volúmenes de 77 μL a -30 °C.
  3. Desechar el tampón de reacción de la hialuronidasa con una pipeta y sumergir el órgano en la solución enzimática (500 μL en un tubo cónico de 15 ml) en posición de pie protegida de la luz durante 24 h a 37 °C con agitación suave (5 x g).
  4. Lavar la muestra en 15 ml de tampón de lavado hialuronidasa en un tubo cónico de 50 ml en posición horizontal protegido de la luz durante 2 h (tres veces) a 37 °C con agitación suave (5 x g).
    1. Para preparar tampón de lavado de hialuronidasa, disuelva 50 mM de tampón de carbonato, 150 mM de NaCl, 0.1% (v / v) de Triton X-100, 5% (v / v) de metanol y 0.05% NaN3. Ajuste el pH a 10. Para preparar 10x stock tampón de carbonato-NaCl, disuelva 2,96 g de carbonato de sodio, 1,86 g de carbonato de hidrógeno de sodio y 8,77 g de NaCl en 100 ml de agua doble destilada con 0,05% de NaN3 (consulte la Tabla de materiales) y ajuste el pH a 10.

5. Inmunotinción

  1. Etiquete la vasculatura con anticuerpos anti-α-SMA (actina de músculo alfa-pequeño, consulte la Tabla de materiales) siguiendo los pasos a continuación.
    1. Generar complejo de anticuerpos secundarios de fragmentos Fab primarios más conjugados. Comience esta reacción 1,5 h antes del procedimiento de tinción.
      1. Calcule la cantidad requerida de anticuerpos primarios y secundarios (mezcle en una proporción de 1:0.5 por peso).
        NOTA: Para el anticuerpo primario anti-α-SMA, se necesitan 3,5 μg para marcar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 2,5 mg/ml, se necesitan 3,5/2,5 = 1,4 μL de solución de anticuerpos. Para el anticuerpo secundario AlexaFluor 647 anti-ratón Fab fragmento, se necesitan 1,75 μg para etiquetar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 1,7 mg/ml, se necesitan 1,75/1,7 = 1 μL de solución de anticuerpos.
      2. Mezclar anticuerpos primarios y secundarios en un tubo ámbar de 2 ml e incubar durante 1,5 h a 37 °C.
    2. Para el intercambio de tampón, mezcle 7,5 ml de tampón de inmunotinción HV1 3D 2x (incluido en el kit, consulte la Tabla de materiales) con 7,5 ml de agua doble destilada y sumerja la muestra de tejido durante 1,5 h a 32 °C con agitación suave (5 x g) en un tubo cónico de 15 ml en posición horizontal. Iniciar esta reacción simultáneamente como la generación de complejo de anticuerpos (1,5 h antes del procedimiento de inmunotinción).
  2. Realice la inmunotinción 3D siguiendo los pasos a continuación.
    1. En un tubo cónico de 15 ml, preparar la solución de tinción de anticuerpos siguiendo el archivo complementario 1.
    2. Recoger la muestra de tejido del medio de intercambio tampón (paso 5.1.2) y sumergirla en la solución de tinción de anticuerpos. Incubar los tejidos individualmente durante 1 semana a 32 °C con una agitación suave (5 x g) de los tubos en posición de pie protegidos de la luz. Selle el tubo con película de parafina para evitar la evaporación.
    3. Desplazar a 4 °C e incubar ON de pie.
    4. Enfriar 1x tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D (incluido en el kit, ver Tabla de materiales) a 4 °C y lavar la muestra con tampón de 15 ml (dos veces) durante 30 min cada una a 4 °C con agitación suave (5 x g). Conservar los tubos cónicos de 15 ml en posición horizontal hasta el paso 5.2.7.
    5. Diluir la formalina al 1% en 1x tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D y sumergir la muestra en 8 ml de la solución durante 24 h a 4 °C con agitación suave (5 x g).
    6. Incubar en solución fresca de formalina al 1% durante 1 h a 37 °C con agitación suave (5 x g).
    7. Lavar en 15 mL de PBS durante 2 h a 25 °C con agitación suave (5 x g).
  3. Aumente la señal de tdTomato utilizando anticuerpos anti-proteína fluorescente roja (RFP) siguiendo los pasos a continuación.
    1. Siga los mismos tiempos de incubación y temperaturas que en el paso 5.2.2. Calcule la cantidad de anticuerpos primarios y secundarios (consulte la Tabla de materiales) y mézclelos en una proporción de 1:0.5 en peso.
      NOTA: Para el anticuerpo primario anti-RFP, se necesitan 5 μg para etiquetar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 1,25 mg/ml, se requieren 5/1,25 = 4 μL de la solución. Para el anticuerpo secundario Alexa Fluor 647 anti-conejo Fab fragmento, se necesitan 2,5 μg para etiquetar todo el corazón o un fragmento de músculo esquelético de dimensiones similares. Para un producto de 1,5 mg/ml, se necesitan 2,5/1,5 = 1,7 μL de la solución.
    2. Prepare la solución de tinción de anticuerpos como se menciona en el Archivo complementario 1.
  4. Aumente las señales de GFP utilizando nanocuerpos anti-GFP siguiendo los pasos a continuación.
    1. Siga los mismos tiempos de incubación y temperaturas que se mencionan en el paso 5.2.2.
      NOTA: Los nanocuerpos anti-GFP (consulte la Tabla de materiales) se conjugan con Alexa Fluor 647, por lo que la generación de complejos de anticuerpos es innecesaria.
    2. Prepare la solución de tinción de anticuerpos como se menciona en el Archivo complementario 1.

6. Coincidencia de RI

  1. Sumerja los órganos transparentes en 5 ml de solución CUBIC-R+ diluida en agua al 50% (consulte la Tabla de materiales) en RT (ON) con agitación suave (5 x g) en un tubo cónico de 50 ml. Mantenga los tubos de pie durante todo el paso de emparejamiento de RI.
    NOTA: Las soluciones CUBIC R+ recicladas de experimentos anteriores podrían reutilizarse (hasta cuatro veces) en este paso. Para preparar la solución CUBIC-R+, disuelva el 45% de 2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolona (Antipirina), el 30% de nicotinamida o N-metilnicotinamida y el 0,5% de N-butildietanolamina en agua de doble destilación o use el tampón CUBIC-R+ comercial (ver Tabla de materiales).
    PRECAUCIÓN: CUBIC-R+ causa irritación de la piel, irritación ocular grave y daño a los órganos. Use guantes protectores y asegúrese de proteger los ojos y la cara. No respire polvo, humos, gases, niebla o vapores. Desechar en una planta de eliminación de residuos aprobada.
  2. Reemplace 50% CUBIC-R+ con 5 mL de 100% CUBIC-R+ e incubar con agitación suave (5 x g) a RT durante 2 días. Luego, transfiera los tejidos a una pila de toallitas sin pelusa y gire cuidadosamente los tejidos para eliminar la solución CUBIC-R + de las superficies de los órganos durante 5 minutos.

7. Montaje

  1. Después de secar los tejidos, transfiéralos a 5 ml de solución de montaje (RI = 1.520) (ver Tabla de materiales) en una placa de cultivo celular de seis pocillos e incubarlos (ON) en RT. Gire con frecuencia los tejidos para eliminar las burbujas de aire, especialmente en las superficies de los órganos.
    NOTA: Los órganos se pueden almacenar durante más de 6 meses en solución de montaje o CUBIC-R +.
  2. Adhiera los tejidos al soporte de la muestra del microscopio usando pegamento de gel a base de cianoacrilato.
  3. Sumerja las muestras en la cubeta de cuarzo del microscopio llena de 120 ml de solución de montaje y obtenga imágenes transversales a su eje longitudinal. Adhiera el corazón con el ápice y la aorta alineados horizontalmente.
    NOTA: Los órganos despejados y montados se pueden seccionar con un vibratomo y obtener imágenes a gran aumento mediante microscopía confocal. Incrustar los órganos en agarosa al 2% y cortar secciones de 100-500 μm. Los órganos también se pueden seccionar manualmente con una cuchilla afilada para producir secciones de tejido grueso (>1000 μm). Después de seccionar, coloque las rodajas en placas de Petri de 35 mm con fondo de vidrio, monte con la misma solución de montaje, selle con esmalte de uñas e imagine con un microscopio confocal.

8. Adquisición de imágenes

  1. Imagen de las muestras montadas con un microscopio de hoja de luz (consulte la Tabla de materiales). Establezca la ampliación y el tamaño de paso entre cortes individuales a 3 μm, y use láseres de lámina de luz derecha e izquierda con espesores de 5 μm y 100% de ancho. Ajuste la constante de tiempo de exposición a 50-100 ms y ajuste la potencia del láser del 10% al 80% dependiendo de la intensidad de la señal de fluorescencia.
    1. Para la codetección de parásitos que expresan tdTomate y amastigotes latentes teñidos con DiR (Figura 2C), utilice canales rojo (Ex/Em 561/620-660 nm) e infrarrojo (Ex/Em 785/845-55 nm), respectivamente. Para la co-detección de linfocitos T y parásitos que expresan tdTomato-en ratón reportero CD8 (Figura 2D), use verde (Ex/Em 488/525-50 nm) y canal rojo, respectivamente.
    2. Para los ensayos de coinfecciones (Figura 2E), así como para la co-detección de parásitos que expresan GFP en núcleos ratones reporteros (Figura 2F), utilice los canales verde y rojo, respectivamente. Para la detección de parásitos que expresan tdTomato, colorante nuclear y vasculatura cardíaca (Figura 3B, C), use los canales rojo, verde y rojo lejano (Ex / Em 640 / 680-730 nm), respectivamente.
    3. Detectar anticuerpos anti-RFP con el canal rojo lejano y nanocuerpos anti-GFP utilizando el canal verde (Figura 3D).
  2. Convierta las pilas de imágenes TIFF adquiridas y reconstruya en 3D los órganos utilizando el software Imaris v9.7.2 (consulte la Tabla de materiales).

9. Reconstrucción y cuantificación de superficies con el software Imaris

  1. Seleccione la herramienta de algoritmo de detección de superficies e inicie el asistente en el software de análisis de imágenes.
  2. Realice un análisis inicial en una región 3D de interés (seleccionada al azar) y luego aplíquelo a toda la reconstrucción del órgano 3D. Después de elegir una región de interés (ROI), seleccione el canal a analizar, desmarque el botón suave y seleccione la resta de fondo.
    NOTA: La sustracción de fondo calcula un valor de fondo local único para cada vóxel y lo resta del valor de píxel original. El diámetro de la esfera más grande que cabe en el objeto debe ser de hasta 200 μm para las células infectadas por T. cruzi, 10 μm para las células T y 5 μm para los parásitos individuales.
  3. Utilice el histograma para ajustar la clasificación y la lista desplegable de filtros para seleccionar las medidas para la clasificación.
    NOTA: Utilice el histograma para ajustar la clasificación: se recomiendan mediciones de elipticidad (achatación) y esfericidad.
  4. Finalice el asistente, presione el botón de estadísticas y recupere el número total de células infectadas por parásitos o células T como el número de componentes desconectados por punto de tiempo.

Resultados

Los tejidos fijos CUBIC se lavaron con PBS para eliminar los fijadores y luego se incubaron con cócteles CUBIC-L, una solución tamponada básica de aminoácidos alcoholes que extraen pigmentos y lípidos del tejido, lo que resulta en la decoloración del tejido mientras se mantiene la arquitectura del tejido. Las líneas de cuadrícula en el papel se pueden ver a través de los tejidos que indican una limpieza adecuada de los órganos (Figura 2A). Después de la deslipidac...

Discusión

La ausencia de imágenes extensas de los parásitos y la respuesta inmune en todo el órgano limita la comprensión de la complejidad de las interacciones huésped-parásito e impide la evaluación de las terapias para la enfermedad de Chagas. El presente estudio adoptó la tubería CUBIC para aclarar y teñir órganos y tejidos intactos de ratones infectados con T. cruzi.

En este estudio se probaron múltiples protocolos de limpieza de tejidos (PACT32, ECi 33,...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Etsuo Susaki por su valiosa ayuda y recomendaciones con respecto a los protocolos de limpieza de tejidos e inmunotinción. Además, agradecemos a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core por el apoyo técnico que utiliza LSFM e imágenes confocales. También agradecemos a todos los miembros del Grupo de Investigación Tarleton por sus útiles sugerencias a lo largo de este estudio.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Referencias

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