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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte softwaregestützte Methoden zur Visualisierung und genauen Quantifizierung proliferierender und ruhender Trypanosoma-cruzi-Parasiten und T-Zellen in intakten, gereinigten Organen und Geweben. Diese Techniken bieten eine zuverlässige Möglichkeit, Behandlungsergebnisse zu bewerten und neue Einblicke in Parasiten-Wirt-Interaktionen zu bieten.

Zusammenfassung

Die Chagas-Krankheit ist eine vernachlässigte Pathologie, die Millionen von Menschen weltweit betrifft, hauptsächlich in Lateinamerika. Der Erreger der Chagas-Krankheit, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ist ein obligater intrazellulärer Parasit mit einer vielfältigen Biologie, der mehrere Säugetierarten, einschließlich des Menschen, infiziert und Herz- und Verdauungspathologien verursacht. Der zuverlässige Nachweis von T. cruzi-In-vivo-Infektionen ist seit langem erforderlich, um die komplexe Biologie der Chagas-Krankheit zu verstehen und das Ergebnis von Behandlungsschemata genau zu bewerten. Das aktuelle Protokoll demonstriert eine integrierte Pipeline zur automatisierten Quantifizierung von T. cruzi-infizierten Zellen in 3D-rekonstruierten, geklärten Organen. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die genaue Visualisierung und Quantifizierung von aktiv proliferierenden und ruhenden T. cruzi-Parasiten und Immuneffektorzellen in ganzen Organen oder Geweben. Auch die CUBIC-HistoVision-Pipeline zur einheitlichen Markierung von befreiten Organen mit Antikörpern und nuklearen Färbungen wurde erfolgreich übernommen. Die Gewebereinigung in Verbindung mit der 3D-Immunfärbung bietet einen unvoreingenommenen Ansatz zur umfassenden Bewertung von Arzneimittelbehandlungsprotokollen, zur Verbesserung des Verständnisses der zellulären Organisation von T. cruzi-infizierten Geweben und soll Entdeckungen im Zusammenhang mit Anti-T-Cruzi-Immunantworten, Gewebeschäden und Reparaturen bei der Chagas-Krankheit vorantreiben.

Einleitung

Die Chagas-Krankheit, verursacht durch den Protozoenparasiten T. cruzi, gehört zu den am meisten vernachlässigten Tropenkrankheiten der Welt und verursacht jährlich etwa 13.000 Todesfälle. Die Infektion schreitet häufig von einem akuten zu einem chronischen Stadium fort, was bei 30% der Patienten zu einer Herzpathologie führt, einschließlich Arrhythmien, Herzinsuffizienz und plötzlichem Tod 1,2. Trotz der starken Immunantwort des Wirts gegen den Parasiten während der akuten Phase bleiben während des gesamten Lebens des Wirts eine geringe Anzahl von Parasiten in Geweben wie Herz und Skelettmuskulatur chronisch bestehen. Mehrere Faktoren, einschließlich des verzögerten Einsetzens adaptiver Immunantworten und des Vorhandenseins nicht replizierender Formen des Parasiten, können dazu beitragen, dass T. cruzi eine vollständige Eliminierung durch das Immunsystem vermeidenkann 3,4,5,6. Darüber hinaus zeigen nicht-replizierende ruhende Formen des Parasiten eine geringe Anfälligkeit für trypanocide Medikamente und können teilweise für das in vielen Fällen beobachtete Behandlungsversagen verantwortlich sein 7,8.

Die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren bietet die Möglichkeit, Einblicke in die räumliche Verteilung der Parasiten in den infizierten Geweben und ihre Beziehung zu den an ihrer Bekämpfung beteiligten Immunzellen zu gewinnen. Diese Eigenschaften sind entscheidend für ein besseres Verständnis der Prozesse der Parasitenkontrolle durch das Immunsystem und die Verfolgung der seltenen schlafenden Parasiten, die in chronischen Geweben vorhanden sind.

Die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist eine der umfassendsten und unvoreingenommensten Methoden zur 3D-Bildgebung großer Gewebe oder Organe ohne Dünnschnitt. Lichtblattmikroskope verwenden eine dünne Lichtschicht, um nur die Fluorophore in der Fokusebene anzuregen, Photobleiche und Phototoxizität von Proben zu reduzieren und Bilder von Tausenden von Gewebeschichten mit ultraschnellen Kameras aufzunehmen. Die hohe Gewebetransparenz, die für das ordnungsgemäße Eindringen des Laserlichts in Gewebe erforderlich ist, wird durch Homogenisierung des Brechungsindex (RI) nach Gewebeentfettung und -entfärbung erreicht, wodurch die Lichtstreuung reduziert und qualitativ hochwertige Bilder erzeugtwerden 9,10,11.

Gewebereinigungsansätze wurden für die Bildgebung ganzer Mäuse 12,13,14, Organoide 15,16,17, Organe, die Reporterfluoreszenzmarker exprimieren, 18,19,20,21,22,23 und kürzlich einer begrenzten Anzahl menschlicher Gewebe entwickelt 24 . Die derzeitigen Methoden zur Gewebereinigung werden in drei Familien eingeteilt: (1) organische lösungsmittelbasierte Methoden wie die DISCO-Protokolle 25,26, (2) Hydrogel-basierte Methoden wie CLARITY27 und wässrige Methoden wie CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-Protokolle erhalten Organform und Gewebeintegrität und bewahren die Fluoreszenz endogen exprimierter Reporterproteine. Die neueste Aktualisierung dieser Technik, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), erlaubt auch den Nachweis von Epitopen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper und DNA-Markierung28.

Im vorliegenden Protokoll wurde die CUBIC-Pipeline zum Nachweis von T. cruzi exprimierenden fluoreszierenden Proteinen in geklärten intakten Mausgeweben verwendet. Optisch transparente Gewebe wurden LSFM abgebildet, 3D rekonstruiert und die genaue Gesamtzahl der T. cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen pro Organ automatisch quantifiziert. Dieses Protokoll wurde auch erfolgreich übernommen, um eine einheitliche Kennzeichnung von gereinigten Organen mit Antikörpern und nukleären Färbungen zu erhalten. Diese Ansätze sind essentiell für das Verständnis der Expansion und Kontrolle von T. cruzi in infizierten Wirten und sind nützlich für die vollständige Bewertung von Chemo- und Immuntherapeutika für die Chagas-Krankheit.

Protokoll

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und den Akkreditierungsrichtlinien der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt. Das Animal Use Protocol (Control of T. cruzi infection in mice-A2021 04-011-Y1-A0) wurde vom University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J und C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J Mäuse (weiblich,1-2 Monate alt) wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Infektion, Perfusion und Dissektion

  1. Intraperitoneal infizieren Mäuse mit Gewebekultur-abgeleiteten Trypomastigoten des Colombiana (DTU TcI) oder Brasilien (DTU TcV) T. cruzi-Stammes , der tdTomato- bzw. GFP-fluoreszierende Proteine exprimiert. Die Infektionsdosis könnte zwischen 50.000 und 200.000 Trypomastigoten liegen, verdünnt in 100 μL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    HINWEIS: Spezifische Details über die Erzeugung von Reporterparasiten und Mausmodellen der Infektion sind in Canavaci et al. 29 und Bustamante et al.30.
  2. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Kohlendioxidinhalation mit einer Flussrate von 3-7 L / min. Sobald die Tiere keinen Pedalreflex mehr zeigen, machen Sie einen Längsschnitt durch die Haut vom Bauch in Richtung Brustbein. Dann schneiden Sie die Körperwand aus dem Bauch und fahren Sie durch die Rippen auf jeder Seite des Thorax, bis das Brustbein weggehoben werden kann und das Herz freigelegt wird.
  3. Wie in Abbildung 1 beschrieben, machen Sie einen 2,5-mm-Schnitt in der rechten Ohrmuschel des Herzens und sammeln Sie das abfließende Blut mit einer 1-ml-Mikropipettenspitze.
  4. Führen Sie eine Schmetterlingsnadel (verbunden mit einem Ende des Perfusionssystems) in die Spitze des linken Ventrikels ein, bis sie die aufsteigende Aorta erreicht. Verwenden Sie Klebstoff auf Gelbasis (siehe Materialtabelle), um das Einlassloch um die Nadel zu versiegeln und die Nadel während der Perfusionen in Position zu halten.
  5. Durchbluten Sie die Mäuse30 mit 50 ml kaltem Heparin-PBS (pH 7,4, 10 U/ml Heparin) oder bis die Flüssigkeit, die aus der Maus in Richtung der Auffangschale kommt, frei von Blut ist.
  6. Perfusion mit 50 ml kaltem 4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) (pH 7,4) in PBS.
    HINWEIS: Die PFA-Gewebefixierung ist wahrscheinlich einer der kritischen Schritte des Protokolls, insbesondere für die Aufrechterhaltung von Epitopstrukturen und die anschließende Immundetektion. PFA baut sich im Laufe der Zeit ab, daher muss es frisch zubereitet werden. Der pH-Wert der Lösung ist auch wichtig, um eine Überfixierung zu vermeiden, die zu einer schlechten Reinigung des Gewebes führen könnte.
    ACHTUNG: PFA ist bei Hautkontakt mäßig toxisch. Akute Exposition ist auch stark reizend für Nase, Augen und Rachen. Langfristige Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen in der Luft oder der Haut kann Hautreizungen wie Dermatitis und Juckreiz sowie asthmaähnliche Atemwegsprobleme verursachen. Tragen Sie Gesichts- und Augenschutz und atmen Sie keinen Staub, Gas, Nebel, Dämpfe oder Dämpfe ein.
    1. Nach der PFA-Perfusion wird die Maus mit 100 ml CUBIC-P-Puffer durchblutet, um die in Schritt 1.5 genannten Klärungswerte zu erreichen.
    2. Zur Herstellung des CUBIC-P-Puffers werden 10% N-Butyldiethanolamin, 5% Triton X-100 und 5% 1-N-Methylimidazol in doppelt destilliertem Wasser gelöst oder die handelsüblichen Cocktails verwendet (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Schritte 1.6.1.-1.6.2. werden nur für hochpigmentierte Organe wie Herz und Niere empfohlen, da sie einen Vorab-Clearing-Schritt erfordern, um ein erhöhtes Maß an Transparenz zu erhalten. Nach der Anwendung von CUBIC-P sezieren Sie die Organe und fahren Sie direkt mit Schritt 2 fort: Gewebereinigung.
  7. Sezieren Sie die zu fotografierenden Gewebeproben/Organe 30 und fixieren Sie sie nachträglich in 4% (w/v) PFA in PBS (~10 ml/ganzes Organ) über Nacht (ON) bei 4 °C mit leichtem Schütteln (nicht mehr als 5 x g) in50 ml konischen Röhrchen.
    HINWEIS: Alle Inkubationen von nun an müssen an Rohren durchgeführt werden, die horizontal bei 20-30 °C vor Licht geschützt liegen.
  8. Die Probe wird in 10 ml PBS (ergänzt mit 0,05% Natriumazid (NaN3) für 3 h (dreimal) bei Raumtemperatur (RT) mit leichtem Schütteln (5 x g) gewaschen.
    HINWEIS: Gewebe können eingefroren werden, indem in 10 ml 30% Saccharose in PBS mit leichtem Schütteln (5 x g) bei 4 °C ON in 50 ml konischen Röhrchen inkubiert wird. Nachdem das Gewebe auf den Boden des Röhrchens gesunken ist, betten Sie es in die OCT-Verbindung ein und halten Sie es bei -80 ° C. Bei RT auftauen, bis die OCT-Verbindung vollständig geschmolzen ist, dann PBS (~ 10 ml / ganzes Organ) bei 4 ° C mit leichtem Schütteln (5 x g) in 50 ml konischen Röhrchen waschen. Fahren Sie mit Schritt 2 fort.

2. Gewebereinigung

HINWEIS: Alle in dieser Arbeit durchgeführten Gewebereinigungen wurden unter Verwendung des CUBIC-Protokolls I22 durchgeführt. Drei verschiedene Cocktails wurden verwendet: CUBIC-P für die Delipidierung und schnelle Entfärbung während der Perfusionen, CUBIC-L für die Delipidierung und Entfärbung und CUBIC-R für das RI-Matching. DNA-Färbungen und Immunfärbungen wurden mit CUBIC-HV 1 3D-Kernfärbungskit bzw. CUBIC-HV 1 3D-Immunfärbungskit durchgeführt (siehe Materialtabelle).

  1. Tauchen Sie einzelne Organe in 10 mL 50% wasserverdünntes CUBIC-L (siehe Materialtabelle) mit leichtem Schütteln (5 x g) bei RT (ON) in 50 mL konische Röhrchen. Halten Sie die Röhrchen flach auf der Schüttelplatte.
    HINWEIS: Um Gewebeschäden zu vermeiden, werden Organe im selben Röhrchen gehalten und Lösungen werden mit einem Vakuumsystem gesammelt. Zur Herstellung von CUBIC-L werden 10% N-Butyldiethanolamin und 10% Triton X-100 in doppelt destilliertem Wasser unter Verwendung der handelsüblichen Cocktails gelöst (siehe Materialtabelle).
    ACHTUNG: CUBIC-L verursacht schwere Augenschäden. Tragen Sie Augen- und Gesichtsschutz. Entsorgung in einer zugelassenen Abfallentsorgungsanlage.
  2. Tauchen Sie die Probe 6 Tage lang in 10 ml 100% CUBIC-L (Auffrischen der Lösung am 3. Tag).
    HINWEIS: Am Ende dieser Inkubationszeit müssen die Gewebe fast vollständig transparent sein.
  3. Die transparenten Organe mit PBS (ergänzt mit 0,05% NaN3) für 2 h (dreimal) bei 37 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) waschen. Übertragen Sie das Gewebe bei jeder Wäsche in ein neues 50-ml-konisches Röhrchen, um Triton X-100 zu entfernen.
    HINWEIS: Wie in Abbildung 2B beschrieben, überspringen Sie die Schritte 3, 4 und 5 und fahren Sie direkt mit Schritt 6 fort, wenn das Ziel des Experiments darin besteht, endogen exprimierte Reporterproteine von transgenen T. cruzi-Parasiten oder Mäusen sichtbar zu machen (Abbildung 2C-F).

3. DNA-Färbung

  1. Verdünnen Sie den handelsüblichen Nukleinsäurefarbstoff (siehe Materialtabelle) in 5 ml Färbepuffer (im Kit enthalten) bei einer Verdünnung von 1/2.500.
  2. Tauchen Sie das Gewebe in die Kernfarbstofflösung und inkubieren Sie bei 37 °C in sanfter Rotation für 5 Tage mit 15 ml konischen Röhrchen im Stehen.
  3. Waschen Sie mit 15 ml 3D-Kernfärbungspuffer (im Kit enthalten) für 2 h (dreimal) bei RT mit leichtem Schütteln (5 x g).
    HINWEIS: Andere DNA-Farbstoffe können in diesen Konzentrationen und Inkubationszeiten verwendet werden: DAPI (im Kit enthalten): 1/200, 5 Tage Inkubation; BOBO-1: 1/400, 5 Tage Inkubation; Propidiumiodid (PI) (im Kit enthalten): 1/100, 3 Tage Inkubation; RedDot2: 1/250, 3 Tage Inkubation. Wenn das spezifische Ziel des Experiments darin besteht, sowohl endogen exprimierte Reporterproteine sichtbar zu machen als auch Kernfärbungen zu verwenden, überspringen Sie die Schritte 4 und 5 und fahren Sie direkt mit Schritt 6 fort.

4. Verdauung der extrazellulären Matrix (ECM)

HINWEIS: Die Hyaluronidase-Verdauung der ECM muss durchgeführt werden, um das ordnungsgemäße Eindringen der Antikörper in tiefe Regionen des Gewebeszu erleichtern 28.

  1. Einzelne Organe in 15 mL Hyaluronidase-Reaktionspuffer für 2 h bei 37 °C in ein 50 mL konisches Röhrchen in flacher, lichtgeschützter Position tauchen.
    HINWEIS: Um Hyaluronidase-Reaktionspuffer herzustellen, lösen Sie 10 mM CAPSO auf; 150 mM Natriumchlorid (NaCl) und 0,05%NaN3 (siehe Materialtabelle) in doppelt destilliertem Wasser und pH-Wert auf 10 einstellen.
  2. Enzymlösung wird hergestellt, indem 75 μL 20 mg/ml Hyaluronidase-Brühe in 425 μL Hyaluronidase-Reaktionspuffer gemischt werden. Um 20 mg/ml Hyaluronidase-Brühe herzustellen, wird Hyaluronidase in 50 mM Karbonatpuffer, 150 mM NaCl, 0,01% BSA und 0,05%NaN3 gelöst (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den pH-Wert auf 10 und aliquot in Volumina von 77 μL bei -30 °C ein.
  3. Verwerfen Sie den Hyaluronidase-Reaktionspuffer mit einer Pipette und tauchen Sie das Organ in die Enzymlösung (500 μL in einem 15 ml konischen Röhrchen) in einer stehenden Position geschützt vor Licht für 24 h bei 37 °C mit leichtem Schütteln (5 x g).
  4. Waschen Sie die Probe in 15 mL Hyaluronidase-Waschpuffer in einem 50-ml-konischen Röhrchen in einer horizontalen, lichtgeschützten Position für 2 h (dreimal) bei 37 °C mit leichtem Schütteln (5 x g).
    1. Zur Herstellung des Hyaluronidase-Waschpuffers werden 50 mM Karbonatpuffer, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 5 % (v/v) Methanol und 0,05 %NaN3 gelöst. Stellen Sie den pH-Wert auf 10 ein. Um 10x Carbonat-Puffer-NaCl-Schaft herzustellen, lösen Sie 2,96 g Natriumcarbonat, 1,86 g Natriumhydrogencarbonat und 8,77 g NaCl in 100 ml doppelt destilliertem Wasser mit 0,05% NaN3 (siehe Tabelle der Materialien) und stellen Sie den pH-Wert auf 10 ein.

5. Immunfärbung

  1. Beschriften Sie das Gefäßsystem mit Anti-α-SMA-Antikörpern (alpha-small muscle actin, siehe Tabelle der Materialien) nach den folgenden Schritten.
    1. Erzeugen Sie einen primären plus konjugierten sekundären Fab-Fragment-Antikörperkomplex. Starten Sie diese Reaktion 1,5 h vor dem Färbevorgang.
      1. Berechnen Sie die erforderliche Menge an primären und sekundären Antikörpern (Mischung im Verhältnis 1:0,5 nach Gewicht).
        HINWEIS: Für den primären Antikörper Anti-α-SMA werden 3,5 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment der Skelettmuskulatur ähnlicher Größe zu markieren. Für 2,5 mg/ml Produkt werden 3,5/2,5 = 1,4 μL Antikörperlösung benötigt. Für den sekundären Antikörper AlexaFluor 647 Anti-Maus-Fab-Fragment werden 1,75 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment des Skelettmuskels ähnlicher Größe zu markieren. Für 1,7 mg/ml Produkt werden 1,75/1,7 = 1 μL Antikörperlösung benötigt.
      2. Primäre und sekundäre Antikörper in einem bernsteinfarbenen 2-ml-Röhrchen mischen und 1,5 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Für den Pufferaustausch mischen Sie 7,5 ml 2x HV1 3D-Immunfärbungspuffer (im Kit enthalten, siehe Materialtabelle) mit 7,5 ml doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie die Gewebeprobe für 1,5 h bei 32 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) in ein 15-ml-konisches Röhrchen in horizontaler Position. Starten Sie diese Reaktion gleichzeitig mit der Erzeugung des Antikörperkomplexes (1,5 h vor dem Immunfärbungsverfahren).
  2. Führen Sie eine 3D-Immunfärbung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. In einem konischen 15-ml-Röhrchen wird die Antikörperfärbelösung gemäß Zusatzdossier 1 hergestellt.
    2. Entnehmen Sie die Gewebeprobe aus dem Pufferaustauschmedium (Schritt 5.1.2) und tauchen Sie sie in die Antikörperfärbelösung. Gewebe einzeln für 1 Woche bei 32 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) der Röhrchen im Stehen vor Licht schützen. Verschließen Sie das Röhrchen mit Paraffinfolie, um Verdunstung zu vermeiden.
    3. Auf 4 °C bewegen und ON im Stehen inkubieren.
    4. 1x HV1 3D Immunfärbungs-Waschpuffer (im Kit enthalten, siehe Materialtabelle) auf 4 °C abkühlen lassen und die Probe mit 15 mL Puffer (zweimal) jeweils 30 min bei 4 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) waschen. Halten Sie 15 ml konische Röhrchen bis Schritt 5.2.7 in horizontaler Position.
    5. Formalin in 1x HV1 3D-Immunfärbungs-Waschpuffer auf 1% verdünnen und die Probe 24 h bei 4 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) in 8 ml der Lösung eintauchen.
    6. In frischer 1%iger Formalinlösung 1 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) inkubieren.
    7. In 15 mL PBS für 2 h bei 25 °C unter leichtem Schütteln (5 x g) waschen.
  3. Verstärken Sie das tdTomato-Signal mit Anti-Red Fluorescent Protein (RFP)-Antikörpern, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Befolgen Sie die gleichen Inkubationszeiten und Temperaturen wie in Schritt 5.2.2. Berechnen Sie die Menge an primären und sekundären Antikörpern (siehe Materialtabelle) und mischen Sie sie im Verhältnis 1:0,5 nach Gewicht.
      HINWEIS: Für primäre Antikörper-Anti-RFP werden 5 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment der Skelettmuskulatur ähnlicher Abmessungen zu markieren. Für 1,25 mg/ml Produkt sind 5/1,25 = 4 μL der Lösung erforderlich. Für den sekundären Antikörper Alexa Fluor 647 Anti-Kaninchen-Fab-Fragment werden 2,5 μg benötigt, um das gesamte Herz oder ein Fragment der Skelettmuskulatur ähnlicher Größe zu markieren. Für 1,5 mg/ml Produkt werden 2,5/1,5 = 1,7 μL der Lösung benötigt.
    2. Bereiten Sie die Antikörperfärbelösung wie in Zusatzdatei 1 beschrieben vor.
  4. Verstärken Sie GFP-Signale mit Anti-GFP-Nanokörpern, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Befolgen Sie die gleichen Inkubationszeiten und Temperaturen wie in Schritt 5.2.2 beschrieben.
      HINWEIS: Anti-GFP-Nanobodies (siehe Materialtabelle) werden mit Alexa Fluor 647 konjugiert, so dass die Erzeugung von Antikörperkomplexen nicht erforderlich ist.
    2. Bereiten Sie die Antikörperfärbelösung wie in Zusatzdatei 1 beschrieben vor.

6. RI-Abgleich

  1. Tauchen Sie transparente Organe in 5 ml 50% wasserverdünnte CUBIC-R+ Lösung (siehe Materialtabelle) bei RT (ON) mit leichtem Schütteln (5 x g) in ein 50 ml konisches Röhrchen. Halten Sie die Rohre während des gesamten RI-Matching-Schritts in stehender Position.
    HINWEIS: Recycelte CUBIC R+ Lösungen aus früheren Experimenten konnten in diesem Schritt (bis zu viermal) wiederverwendet werden. Zur Herstellung der CUBIC-R+-Lösung werden 45 % 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon (Antipyrin), 30 % Nicotinamid oder N-Methylnicotinamid und 0,5 % N-Butyldiethanolamin in doppelt destilliertem Wasser gelöst oder der handelsübliche CUBIC-R+-Puffer verwendet (siehe Materialtabelle).
    ACHTUNG: CUBIC-R+ verursacht Hautreizungen, schwere Augenreizungen und Organschäden. Tragen Sie Schutzhandschuhe und sorgen Sie für Augen- und Gesichtsschutz. Atmen Sie keinen Staub, Dämpfe, Gas, Nebel oder Dämpfe ein. Entsorgung in einer zugelassenen Entsorgungsanlage.
  2. 50% CUBIC-R+ durch 5 ml 100% CUBIC-R+ ersetzen und 2 Tage lang mit leichtem Schütteln (5 x g) bei RT inkubieren. Übertragen Sie dann das Gewebe auf einen Stapel fusselfreier Tücher und drehen Sie das Gewebe vorsichtig, um die CUBIC-R+-Lösung für 5 Minuten von den Organoberflächen zu entfernen.

7. Montage

  1. Nach dem Trocknen der Gewebe werden sie in 5 ml Montagelösung (RI = 1,520) (siehe Materialtabelle) in eine Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen überführt und bei RT inkubiert (ON). Drehen Sie häufig das Gewebe, um Luftblasen zu beseitigen, insbesondere auf den Oberflächen der Organe.
    HINWEIS: Organe können länger als 6 Monate in Mounting Solution oder CUBIC-R+ gelagert werden.
  2. Kleben Sie die Gewebe mit Cyanacrylat-basiertem Gelkleber auf den Probenhalter des Mikroskops.
  3. Tauchen Sie die Proben in die mit 120 mL Montagelösung gefüllte Quarzküvette des Mikroskops und bilden Sie sie quer zu ihrer Längsachse ab. Kleben Sie das Herz mit der Spitze und der Aorta horizontal ausgerichtet.
    HINWEIS: Gereinigte und montierte Organe können mit einem Vibratom geschnitten und bei hoher Vergrößerung durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden. Die Organe in 2% Agarose einbetten und Abschnitte von 100-500 μm schneiden. Organe können auch manuell mit einer scharfen Klinge geschnitten werden, um dicke Gewebeschnitte (>1000 μm) zu erzeugen. Nach dem Schneiden die Scheiben in 35 mm große Petrischalen mit Glasboden geben, mit derselben Montagelösung montieren, mit Nagellack versiegeln und mit einem konfokalen Mikroskop abbilden.

8. Bildaufnahme

  1. Bilden Sie die montierten Proben mit einem Lichtblattmikroskop ab (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Vergrößerung und Schrittweite zwischen den einzelnen Scheiben auf 3 μm ein und verwenden Sie rechte und linke Lichtblattlaser mit 5 μm Dicke und 100% Breite. Stellen Sie die Belichtungszeitkonstante auf 50-100 ms ein und stellen Sie die Laserleistung je nach Intensität des Fluoreszenzsignals von 10% bis 80% ein.
    1. Für die Kodetektion von tdTomato-exprimierenden Parasiten und DiR-gefärbten ruhenden Amastigoten (Abbildung 2C) verwenden Sie rote (Ex/Em 561/620-660 nm) bzw. Infrarotkanäle (Ex/Em 785/845-55 nm). Für die Kodetektion von T-Zellen und tdTomato-exprimierenden Parasiten in CD8-Reportermaus (Abbildung 2D) verwenden Sie grünen (Ex/Em 488/525-50 nm) bzw. roten Kanal.
    2. Für die Koinfektionstests (Abbildung 2E) sowie für die Kodetektion von Parasiten, die GFP in Nuclei-Reportermäusen exprimieren (Abbildung 2F), verwenden Sie den grünen bzw. roten Kanal. Für den Nachweis von tdTomato-exprimierenden Parasiten, Kernfarbstoff und Herzgefäßen (Abbildung 3B,C) verwenden Sie die roten, grünen und tiefroten Kanäle (Ex/Em 640/680-730 nm).
    3. Nachweis von Anti-RFP-Antikörpern mit dem Dunkelroten Kanal und Anti-GFP-Nanobodies mit dem grünen Kanal (Abbildung 3D).
  2. Konvertieren Sie die aufgenommenen TIFF-Bildstapel und rekonstruieren Sie die Organe in 3D mit der Software Imaris v9.7.2 (siehe Materialtabelle).

9. Oberflächenrekonstruktion und Quantifizierung mit Imaris Software

  1. Wählen Sie das Oberflächenerkennungsalgorithmus-Tool aus und starten Sie den Assistenten in der Bildanalysesoftware.
  2. Führen Sie eine erste Analyse in einer 3D-Region von Interesse durch (zufällig ausgewählt) und wenden Sie sie dann auf die gesamte 3D-Organrekonstruktion an. Nachdem Sie eine Region von Interesse (ROI) ausgewählt haben, wählen Sie den zu analysierenden Kanal aus, deaktivieren Sie die Schaltfläche "Glätten" und wählen Sie Hintergrundsubtraktion.
    HINWEIS: Die Hintergrundsubtraktion berechnet für jedes Voxel einen eindeutigen lokalen Hintergrundwert und subtrahiert diesen vom ursprünglichen Pixelwert. Der Durchmesser der größten Kugel, die in das Objekt passt, muss bis zu 200 μm für T. cruzi-infizierte Zellen, 10 μm für T-Zellen und 5 μm für einzelne Parasiten betragen.
  3. Verwenden Sie das Histogramm , um die Klassifizierung anzupassen, und die Filter-Dropdown-Liste, um die Messungen für die Klassifizierung auszuwählen.
    HINWEIS: Verwenden Sie das Histogramm, um die Klassifizierung anzupassen: Elliptizitäts- (abgeflachte) und Sphärizitätsmessungen werden empfohlen.
  4. Schließen Sie den Assistenten ab, drücken Sie die Schaltfläche Statistik und rufen Sie die Gesamtzahl der mit Parasiten infizierten Zellen oder T-Zellen als Anzahl der getrennten Komponenten pro Zeitpunkt ab.

Ergebnisse

CUBIC fixierte Gewebe wurden mit PBS gewaschen, um Fixiermittel zu entfernen, und dann mit CUBIC-L-Cocktails inkubiert, einer basischen gepufferten Lösung von Aminoalkoholen, die Pigmente und Lipide aus dem Gewebe extrahieren, was zu einer Entfärbung des Gewebes unter Beibehaltung der Gewebearchitektur führt. Gitterlinien im Papier sind durch die Gewebe hindurch zu sehen, was auf eine entsprechende Reinigung der Organe hinweist (Abbildung 2A). Nach der Delipidierung wurde...

Diskussion

Das Fehlen einer umfassenden Ganzorgan-Bildgebung von Parasiten und der Immunantwort schränkt das Verständnis der Komplexität der Wirt-Parasit-Interaktionen ein und behindert die Bewertung von Therapien für die Chagas-Krankheit. Die vorliegende Studie übernahm die CUBIC-Pipeline, um intakte Organe und Gewebe von T. cruzi-infizierten Mäusen zu klären und zu färben.

In dieser Studie wurden mehrere Gewebereinigungsprotokolle getestet (PACT32, ECi 33, FLASH...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.

Danksagungen

Wir danken Dr. Etsuo Susaki für ihre wertvolle Hilfe und Empfehlungen zu Protokollen zur Gewebereinigung und Immunfärbung. Außerdem danken wir M. Kandasamy vom CTEGD Biomedical Microscopy Core für die technische Unterstützung mit LSFM und konfokaler Bildgebung. Wir danken auch allen Mitgliedern der Tarleton Research Group für hilfreiche Vorschläge während dieser Studie.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Referenzen

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