JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, bozulmamış, temizlenmiş organ ve dokulardaki çoğalan ve uykuda olan Trypanosoma cruzi parazitlerini ve T hücrelerini görselleştirmek ve hassas bir şekilde ölçmek için ışık tabakası floresan mikroskopisi ve otomatik yazılım destekli yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknikler, tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güvenilir bir yol sağlar ve parazit-konakçı etkileşimlerine yeni bakış açıları sunar.

Özet

Chagas hastalığı, başta Latin Amerika olmak üzere dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen ihmal edilmiş bir patolojidir. Chagas hastalığı ajanı Trypanosoma cruzi (T. cruzi), insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli türünü enfekte eden, kalp ve sindirim patolojilerine neden olan çeşitli biyolojiye sahip zorunlu bir hücre içi parazittir. Chagas hastalığının karmaşık biyolojisini anlamak ve tedavi rejimlerinin sonucunu doğru bir şekilde değerlendirmek için T. cruzi in vivo enfeksiyonlarının güvenilir bir şekilde tespit edilmesi uzun zamandır gereklidir. Mevcut protokol, 3D yeniden yapılandırılmış, temizlenmiş organlarda T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin otomatik olarak ölçülmesi için entegre bir boru hattı göstermektedir. Işık tabakası floresan mikroskopisi, tüm organ veya dokularda aktif olarak çoğalan ve uykuda olan T. cruzi parazitlerinin ve bağışıklık efektör hücrelerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar. Ayrıca, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle düzgün bir şekilde etiketlenmesini sağlamak için CUBIC-HistoVision boru hattı başarıyla kabul edildi. 3D immün boyama ile birlikte doku temizleme, ilaç tedavi protokollerini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek, T. cruzi ile enfekte olmuş dokuların hücresel organizasyonunun anlaşılmasını geliştirmek için tarafsız bir yaklaşım sağlar ve Chagas hastalığında anti-T. cruzi immün yanıtları, doku hasarı ve onarımı ile ilgili keşifleri ilerletmesi beklenmektedir.

Giriş

Protozoan parazit T. cruzi'nin neden olduğu Chagas hastalığı, dünyanın en çok ihmal edilen tropikal hastalıkları arasındadır ve yılda yaklaşık 13.000 ölüme neden olmaktadır. Enfeksiyon sıklıkla akuttan kronik bir aşamaya ilerleyerek hastaların %30'unda kardiyak patoloji oluşturur ve buna aritmiler, kalp yetmezliği ve ani ölüm 1,2. Akut fazda parazite karşı ortaya çıkan güçlü konakçı bağışıklık tepkisine rağmen, konakçının yaşamı boyunca kalp ve iskelet kası gibi dokularda kronik olarak düşük sayıda parazit devam eder. Adaptif immün yanıtların gecikmiş başlangıcı ve parazitin replikasyon yapmayan formlarının varlığı da dahil olmak üzere çeşitli faktörler, T. cruzi'nin bağışıklık sistemi tarafından tamamen ortadan kaldırılmasını önleme kapasitesine katkıda bulunabilir 3,4,5,6. Ayrıca, parazitin replikasyon yapmayan uykudaki formları, tripanosidal ilaçlara karşı düşük bir duyarlılık gösterir ve kısmen birçok durumda gözlenen tedavi başarısızlığından sorumlu olabilir 7,8.

Yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi, enfekte dokulardaki parazitlerin mekansal dağılımı ve kontrollerinde yer alan bağışıklık hücreleri ile ilişkileri hakkında fikir edinme fırsatı sunmaktadır. Bu özellikler, bağışıklık sistemi tarafından parazit kontrol süreçlerinin daha iyi anlaşılması ve kronik dokularda bulunan nadir uyuyan parazitlerin izlenmesi için çok önemlidir.

Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), büyük doku veya organların ince kesitleme olmadan 3D görüntülenmesi için en kapsamlı ve tarafsız yöntemlerden biridir. Işık tabakası mikroskopları, yalnızca odak düzlemindeki floroforları uyarmak, örneklerin fotobeyazlatmasını ve fototoksisitesini azaltmak ve ultra hızlı kameralar kullanarak binlerce doku katmanının görüntülerini kaydetmek için ince bir ışık tabakası kullanır. Lazer ışığının dokulara uygun şekilde nüfuz etmesi için gerekli olan yüksek doku saydamlık seviyesi, doku delipidasyonu ve renk dejenerasyonunu takiben kırılma indisinin (RI) homojenize edilmesiyle elde edilir, bu da ışığın saçılmasını azaltır ve yüksek kaliteli görüntüler oluşturur 9,10,11.

Bütün farelerin12,13,14, organoidlerin15,16,17, muhabir floresan belirteçleri eksprese eden organların18,19,20,21,22,23 ve son zamanlarda sınırlı sayıda insan dokusunun görüntülenmesi için doku temizleme yaklaşımları geliştirilmiştir 24 . Doku temizleme için mevcut yöntemler üç aileye ayrılmıştır: (1) DISCO protokolleri 25,26 gibi organik çözücü bazlı yöntemler, (2) CLARITY27 gibi hidrojel bazlı yöntemler ve CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) gibi sulu yöntemler18,19,28,29 . CUBIC protokolleri, endojen olarak eksprese edilen muhabir proteinlerinin floresansını koruyarak organ şeklini ve doku bütünlüğünü korur. Bu tekniğin en son güncellemesi olan CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), floresan etiketli antikorlar ve DNA etiketleme28 kullanılarak epitopların tespit edilmesine de izin verir.

Bu protokolde, berraklaştırılmış bozulmamış fare dokularında floresan proteinleri eksprese eden T. cruzi'yi tespit etmek için CUBIC boru hattı kullanılmıştır. Optik olarak şeffaf dokular LSFM ile görüntülendi, 3D rekonstrükte edildi ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin, uykudaki amastigotların ve organ başına T hücrelerinin kesin toplam sayısı otomatik olarak ölçüldü. Ayrıca, bu protokol, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle tek tip etiketlenmesini sağlamak için başarıyla kabul edildi. Bu yaklaşımlar, enfekte konakçılarda T. cruzi'nin genişlemesini ve kontrolünü anlamak için gereklidir ve Chagas hastalığı için kemo- ve immüno-terapötiklerin tam olarak değerlendirilmesinde yararlıdır.

Protokol

Bu çalışma, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası ve Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği akreditasyon kılavuzlarına sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan Kullanım Protokolü (farelerde T. cruzi enfeksiyonunun kontrolü-A2021 04-011-Y1-A0) Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. B6. Bu çalışmada C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J ve C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J fareleri (dişi,1-2 aylık) kullanılmıştır. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Enfeksiyon, perfüzyon ve diseksiyon

  1. İntraperitoneal olarak fareleri, sırasıyla tdDomates veya GFP floresan proteinlerini ifade eden Colombiana (DTU TcI) veya Brezilya (DTU TcV) T. cruzi suşu doku kültürü kaynaklı tripomastigotlarla enfekte eder. Enfeksiyon dozu, 100 μL 1x Fosfat-Tamponlu Tuzlu (PBS) içinde seyreltilmiş 50.000 ila 200.000 tripomastigot arasında değişebilir.
    NOT: Muhabir parazitlerin oluşumu ve fare enfeksiyon modelleri hakkında özel ayrıntılar Canavaci ve ark. 29 ve Bustamante ve ark.30.
  2. Fareleri karbondioksit inhalasyonu ile 3-7 L / dak akış hızında ötenazileştirin. Hayvanlar herhangi bir pedal refleksi göstermeyi bırakır bırakmaz, deriden karından sternuma doğru uzunlamasına bir kesi yapın. Daha sonra vücut duvarını karından kesin ve sternum kaldırılana kadar göğüs kafesinin her iki tarafındaki kaburgalardan devam ederek kalbi açığa çıkarın.
  3. Şekil 1'de açıklandığı gibi, kalbin sağ kulak kepçesinde 2,5 mm'lik bir kesi yapın ve 1 mL'lik bir mikropipet ucu kullanarak boşalan kanı toplayın.
  4. Yükselen aort seviyesine ulaşana kadar sol ventrikülün tepesine bir kelebek iğnesi (perfüzyon sisteminin bir ucuna bağlı) yerleştirin. İğnenin etrafındaki giriş deliğini kapatmak ve perfüzyonlar sırasında iğneyi yerinde tutmak için jel bazlı yapıştırıcı kullanın (bkz.
  5. 30 fareyi 50 mL soğuk Heparin-PBS (pH 7.4,10 U / mL Heparin) ile veya fareden toplama tepsisine doğru çıkan sıvı kandan arındırıncaya kadar perfüze edin.
  6. PBS'de 50 mL soğuk% 4 (w / v) paraformaldehit (PFA) (pH 7.4) ile perfüze edin.
    NOT: PFA doku fiksasyonu, özellikle epitop yapılarını korumak ve ardından immünostiyosifik etmek için protokolün kritik adımlarından biridir. PFA zamanla bozulur, bu nedenle taze olarak hazırlanmalıdır. Çözeltinin pH'ı, dokuların zayıf bir şekilde temizlenmesine yol açabilecek aşırı fiksasyonu önlemek için de önemlidir.
    DİKKAT: PFA cilt teması nedeniyle orta derecede toksiktir. Akut maruziyet ayrıca burun, göz ve boğaz için oldukça tahriş edicidir. Havadaki veya derideki düşük seviyelere uzun süre maruz kalmak, dermatit ve kaşıntı gibi cilt tahrişine ve astım benzeri solunum problemlerine neden olabilir. Yüz ve göz koruması kullanın ve toz, gaz, sis, duman veya buhar solumayın.
    1. PFA perfüzyonunu takiben, adım 1.5'te belirtilen netleştirme seviyelerine ulaşmak için fareyi 100 mL CUBIC-P tamponu ile perfüze edin.
    2. CUBIC-P tamponu hazırlamak için,% 10 N-bütildietanolamin,% 5 Triton X-100 ve% 5 1-N-Metimidazolü çift damıtılmış suda çözün veya ticari kokteylleri kullanın (bkz.
      NOT: Adım 1.6.1.-1.6.2. Sadece kalp ve böbrek gibi yüksek pigmentli organlar için önerilir, çünkü artan şeffaflık seviyelerini elde etmek için ön temizleme adımı gerektirirler. CUBIC-P'yi kullandıktan sonra, organları diseke edin ve doğrudan adım 2: Doku temizlemeye geçin.
  7. Görüntülenecek doku örneklerini / organları 30 diseke edin ve 50 mL konik tüplerde hafif sallama (en fazla 5 x g) ile 4 ° C'de bir gecede (ON) PBS'de (~10 mL / tüm organ) % 4 (w / v) PFA'da sabitleyin.
    NOT: Bundan sonraki tüm inkübasyonlar, ışıktan korunan 20-30 °C'de yatay olarak döşenen tüpler üzerinde yapılmalıdır.
  8. Numuneyi 10 mL PBS içinde yıkayın (% 0.05 sodyum azid (NaN 3) ile desteklenmiş3 saat (üç kez) oda sıcaklığında (RT) hafifçe çalkalayarak (5 x g).
    NOT: PBS'de %30 sakarozun 10 mL'sinde inkübe edilerek 50 mL konik tüplerde 4 °C AÇIK'ta hafif sallama (5 x g) ile dokular dondurulabilir. Dokular tüpün dibine battıktan sonra, OCT bileşiğine gömün ve -80 ° C'de tutun. OCT bileşiği tamamen eriyene kadar RT'de çözün, ardından 50 mL konik tüplerde hafif sallama (5 x g) ile 4 ° C'de PBS (~ 10 mL / tüm organ) AÇIK olarak yıkayın. 2. adıma geçin.

2. Doku temizleme

NOT: Bu çalışmada yapılan tüm doku temizlikleri CUBIC protokolü I22 kullanılarak yapılmıştır. Üç farklı kokteyl kullanıldı: perfüzyonlar sırasında delipidasyon ve hızlı renk giderme için CUBIC-P, delipidasyon ve renk giderme için CUBIC-L ve RI eşleştirme için CUBIC-R. DNA boyama ve immün boyamalar sırasıyla CUBIC-HV 1 3D nükleer boyama kiti ve CUBIC-HV 1 3D immün boyama kiti kullanılarak gerçekleştirildi (bakınız Malzeme Tablosu).

  1. Tek tek organları, 50 mL konik tüplerde RT'de (ON) hafifçe sallayarak (5 x g) 10 mL'lik %50 su ile seyreltilmiş CUBIC-L'ye (Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın. Tüpleri sallanan plaka üzerinde düz tutun.
    NOT: Doku hasarını önlemek için, organlar aynı tüpte tutulur ve çözeltiler bir vakum sistemi kullanılarak toplanır. CUBIC-L'yi hazırlamak için,% 10 N-bütildietanolamin ve% 10 Triton X-100'ü ticari kokteylleri kullanarak çift damıtılmış suda çözün (bkz.
    DİKKAT: CUBIC-L ciddi göz hasarına neden olur. Göz ve yüz koruyucu kullanın. Onaylı bir atık bertaraf tesisine atın.
  2. Numuneyi 6 gün boyunca 10 mL% 100 CUBIC-L'ye daldırın (çözeltiyi 3. günde yenileyin).
    NOT: Bu kuluçka süresinin sonunda, dokular neredeyse tamamen şeffaf olmalıdır.
  3. Şeffaf organları PBS ile (% 0.05 NaN 3 ile desteklenmiş)37 ° C'de 2 saat (üç kez) hafifçe sallayarak (5 x g) yıkayın. Triton X-100'ü çıkarmak için her yıkamada dokuları yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
    NOT: Şekil 2B'de açıklandığı gibi, deneyin amacı transgenik T. cruzi parazitlerinden veya farelerinden endojen olarak eksprese edilen muhabir proteinleri görselleştirmekse (Şekil 2C-F), adım 3, 4 ve 5'i atlayın ve doğrudan adım 6'ya devam edin.

3. DNA boyama

  1. Ticari olarak temin edilebilen nükleik asit boyasını ( bakınız Malzeme Tablosu) 5 mL boyama tamponunda (kit içinde dahil) 1/2.500 seyreltmede seyreltin.
  2. Dokuyu nükleer boya çözeltisine daldırın ve ayakta dururken 15 mL konik tüpler kullanarak 5 gün boyunca nazik bir dönüşle 37 ° C'de inkübe edin.
  3. RT'de 15 mL 3D nükleer boyama yıkama tamponu (kit içinde dahil) ile RT'de 2 saat (üç kez) boyunca hafifçe sallayarak (5 x g) yıkayın.
    NOT: Diğer DNA boyaları bu konsantrasyonlarda ve inkübasyon sürelerinde kullanılabilir: DAPI (kite dahildir): 1/200, 5 günlük inkübasyon; BOBO-1: 1/400, 5 günlük inkübasyon; Propidium İyodür (PI) (kite dahil): 1/100, 3 günlük inkübasyon; RedDot2: 1/250, 3 günlük inkübasyon. Deneyin özel amacı hem endojen olarak ifade edilen muhabir proteinlerini görselleştirmek hem de nükleer lekeler kullanmaksa, adım 4 ve 5'i atlayın ve doğrudan adım 6'ya devam edin.

4. Hücre dışı matriks (ECM) sindirimi

NOT: ECM'nin hyaluronidaz sindirimi, antikorların dokuların derin bölgelerine uygun şekilde nüfuz etmesini kolaylaştırmak için yapılmalıdır28.

  1. Tek tek organları, ışıktan korunan düz pozisyonda 50 mL'lik bir konik tüp içinde 37 °C'de 2 saat boyunca 15 mL hyaluronidaz reaksiyon tamponuna batırın.
    NOT: Hyaluronidaz reaksiyon tamponu hazırlamak için, 10 mM CAPSO'yu çözün; Çift damıtılmış suda 150 mM Sodyum Klorür (NaCl) veNaN3'ün % 0.05'i ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve pH'ı 10'a ayarlayın.
  2. 75 μL 20 mg/mL hyaluronidaz stoğunu 425 μL hyaluronidaz reaksiyon tamponuna karıştırarak Enzim Çözeltisi hazırlayın. 20 mg/mL hyaluronidaz stoğu hazırlamak için, hyaluronidazi 50 mM Karbonat tamponunda, 150 mM NaCl'de, BSA'nın% 0.01'inde veNaN3'ün % 0.05'inde çözün (bkz. pH değerini 10 ve aliquot'u -30 ° C'de 77 μL hacimlerde ayarlayın.
  3. Bir pipet kullanarak hyaluronidaz reaksiyon tamponunu atın ve organı Enzim Çözeltisine (15 mL'lik bir konik tüp içinde 500 μL) 37 ° C'de 24 saat boyunca ışıktan korunan bir konumda hafifçe sallayarak (5 x g) batırın.
  4. Numuneyi 15 mL hyaluronidaz yıkama tamponunda, 50 mL'lik bir konik tüp içinde, 37 ° C'de 2 saat (üç kez) ışıktan korunan yatay bir konumda, hafif sallama (5 x g) ile yıkayın.
    1. Hyaluronidaz yıkama tamponu hazırlamak için 50 mM Karbonat tamponu, 150 mM NaCl, %0,1 (v/v) Triton X-100, %5 (v/v) Metanol ve %0,05 NaN3 çözün. PH'ı 10'a ayarlayın. 10x Karbonat tampon-NaCl stoğu hazırlamak için, 2.96 g Sodyum Karbonat, 1.86 g Sodyum Hidrojen Karbonat ve 8.77 g NaCl'yi 100 mL çift damıtılmış sudamıtılmış suda% 0.05 NaN3 ile çözün ( bkz.

5. İmmün boyama

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek anti-α-SMA (alfa-küçük kas aktini, Malzeme Tablosuna bakınız) antikorlarını kullanarak vaskülatürü etiketleyin.
    1. Primer artı konjuge Fab fragmanı sekonder antikor kompleksi oluşturur. Boyama prosedüründen 1,5 saat önce bu reaksiyona başlayın.
      1. Gerekli birincil ve ikincil antikor miktarını hesaplayın (ağırlıkça 1: 0.5 oranında karıştırın).
        NOT: Birincil antikor anti-α-SMA için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 3.5 μg gereklidir. 2.5 mg/mL ürün için 3.5/2.5 = 1.4 μL antikor çözeltisi gereklidir. İkincil antikor AlexaFluor 647 anti-fare Fab fragmanı için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 1.75 μg gereklidir. 1.7 mg/mL ürün için 1.75/1.7 = 1 μL antikor çözeltisi gereklidir.
      2. Birincil ve ikincil antikorları amber 2 mL'lik bir tüpte karıştırın ve 37 ° C'de 1.5 saat boyunca inkübe edin.
    2. Tampon değişimi için, 7,5 mL 2x HV1 3D immün boyama tamponunu (kit içinde bulunur, Malzeme Tablosuna bakınız) 7,5 mL çift damıtılmış su ile karıştırın ve doku örneğini yatay konumda 15 mL konik bir tüp içinde 32 °C'de 1,5 saat boyunca 1,5 saat boyunca daldırın. Bu reaksiyonu aynı anda antikor kompleksi oluşumu olarak başlatın (immün boyama prosedüründen 1.5 saat önce).
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek 3D immün boyama gerçekleştirin.
    1. 15 mL'lik bir konik tüpte, Ek Dosya 1'i takiben antikor boyama solüsyonunu hazırlayın.
    2. Doku örneğini tampon değişim ortamından toplayın (adım 5.1.2) ve antikor boyama çözeltisine batırın. Dokuları 32 ° C'de 1 hafta boyunca ayrı ayrı inkübe edin ve tüplerin ışıktan korunan ayakta durma pozisyonunda hafifçe sallanmasıyla (5 x g) inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek için tüpü parafin film ile kapatın.
    3. 4 ° C'ye ilerleyin ve ayakta durma pozisyonunda AÇIK olarak inkübe edin.
    4. 1x HV1 3D immün boyama yıkama tamponunu (kit dahil, Malzeme Tablosuna bakınız) 4 °C'ye kadar soğutun ve numuneyi 15 mL tamponla (iki kez) her biri 4 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak (5 x g) yıkayın. 15 mL konik tüpleri adım 5.2.7'ye kadar yatay konumda tutun.
    5. Formalini 1x HV1 3D immün boyama yıkama tamponunda %1'e kadar seyreltin ve numuneyi 4 °C'de 24 saat boyunca çözeltinin 8 mL'sine hafifçe sallayarak (5 x g) batırın.
    6. Taze% 1 formalin çözeltisinde 37 ° C'de 1 saat boyunca hafifçe sallama (5 x g) ile inkübe edin.
    7. 15 mL PBS'de 25 °C'de 2 saat boyunca hafifçe çalkalayarak (5 x g) yıkayın.
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek anti-Kırmızı Floresan Protein (RFP) antikorlarını kullanarak tdDomates sinyalini artırın.
    1. Adım 5.2.2'deki ile aynı inkübasyon sürelerini ve sıcaklıklarını izleyin. Birincil ve ikincil antikorların miktarını hesaplayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve bunları ağırlıkça 1:0,5 oranında karıştırın.
      NOT: Birincil antikor anti-RFP için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 5 μg gereklidir. 1.25 mg/mL ürün için, çözeltinin 5/1.25 = 4 μL'si gereklidir. İkincil antikor Alexa Fluor 647 anti-tavşan Fab fragmanı için, tüm kalbi veya benzer boyutlardaki bir iskelet kası parçasını etiketlemek için 2.5 μg gereklidir. 1.5 mg / mL ürün için, çözeltinin 2.5 / 1.5 = 1.7 μL'si gereklidir.
    2. Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi antikor boyama solüsyonunu hazırlayın.
  4. Aşağıdaki adımları izleyerek anti-GFP nanocisimcikleri kullanarak GFP sinyallerini artırın.
    1. Adım 5.2.2'de belirtildiği gibi aynı inkübasyon sürelerini ve sıcaklıklarını izleyin.
      NOT: Anti-GFP nanocisimleri ( bakınız Malzeme Tablosu) Alexa Fluor 647 ile konjuge edilir, bu nedenle antikor kompleksi üretimi gereksizdir.
    2. Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi antikor boyama solüsyonunu hazırlayın.

6. RI eşleştirme

  1. Şeffaf organları, RT'de (ON) 50 mL'lik bir konik tüp içinde hafifçe sallayarak (5 x g) 5 mL'lik %50 su ile seyreltilmiş CUBIC-R+ çözeltisine (bkz. Malzeme Tablosu) daldırın. Tüm RI eşleştirme adımı boyunca tüpleri ayakta tutun.
    NOT: Önceki deneylerden geri dönüştürülmüş KÜBİK R+ çözümleri bu adımda (dört kata kadar) yeniden kullanılabilir. CUBIC-R + çözeltisini hazırlamak için, 2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolonun (Antipirin),% 30'unun Nikotinamid veya N-Metilnikotinamid'in% 30'unu ve N-bütildietanolaminin% 0,5'ini çift damıtılmış suda çözün veya ticari CUBIC-R + tamponunu kullanın (bkz.
    DİKKAT: CUBIC-R+ cilt tahrişine, ciddi göz tahrişine ve organlarda hasara neden olur. Koruyucu eldiven giyin, göz ve yüz koruması sağlayın. Toz, duman, gaz, sis veya buhar solumayın. Onaylı bir atık bertaraf tesisine atın.
  2. %50 CUBIC-R+'ı 5 mL'lik %100 CUBIC-R+ ile değiştirin ve 2 gün boyunca RT'de hafif sallama (5 x g) ile inkübe edin. Daha sonra, dokuları tüy bırakmayan mendil yığınına aktarın ve CUBIC-R + çözeltisini organ yüzeylerinden 5 dakika boyunca çıkarmak için dokuları dikkatlice çevirin.

7. Montaj

  1. Dokuları kuruttuktan sonra, altı delikli bir hücre kültürü plakasında 5 mL Montaj Çözeltisine (RI = 1.520) aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de inkübe edin (AÇIK).
    NOT: Organlar Montaj Çözeltisinde veya CUBIC-R+'da 6 aydan fazla saklanabilir.
  2. Siyanoakrilat bazlı jel yapıştırıcı kullanarak dokuları mikroskop numune tutucusuna yapıştırın.
  3. Numuneleri 120 mL Montaj Çözeltisi ile doldurulmuş mikroskop kuvars küvete batırın ve enine olarak uzunlamasına eksenlerine kadar görüntüleyin. Kalbi tepe noktası ve aort yatay olarak hizalanmış olarak yapıştırın.
    NOT: Temizlenmiş ve monte edilmiş organlar bir vibratom ile kesitlenebilir ve konfokal mikroskopi ile yüksek büyütmede görüntülenebilir. Organları% 2 agaroza gömün ve 100-500 μm'lik kesitleri kesin. Organlar ayrıca kalın doku kesitleri (>1000 μm) üretmek için keskin bir bıçakla manuel olarak kesitlenebilir. Kesitlemeden sonra, dilimleri cam tabanlı 35 mm Petri tabaklara yerleştirin, aynı montaj solüsyonunu kullanarak monte edin, oje ile kapatın ve konfokal mikroskopla görüntüleyin.

8. Görüntü toplama

  1. Monte edilmiş numuneleri bir ışık tabakası mikroskobu ile görüntüleyin (bkz. Tek tek dilimler arasındaki büyütme ve adım boyutunu 3 μm'ye ayarlayın ve 5 μm kalınlıkta ve% 100 genişliğe sahip sağ ve sol ışık tabakası lazerlerini kullanın. Pozlama süresini 50-100 ms'de sabit tutun ve floresan sinyal yoğunluğuna bağlı olarak lazer gücünü% 10 ila% 80 arasında ayarlayın.
    1. TdTomato-eksprese eden parazitlerin ve DiR-boyalı uykudaki amastigotların (Şekil 2C) birlikte tespiti için sırasıyla kırmızı (Ex/Em 561/620-660 nm) ve kızıl ötesi (Ex/Em 785/845-55 nm) kanalları kullanın. CD8 muhabir faresinde (Şekil 2D) T hücrelerinin ve tdDomates eksprese eden parazitlerin birlikte tespiti için sırasıyla yeşil (Ex / Em 488/525-50 nm) ve kırmızı kanal kullanın.
    2. Koenfeksiyon tahlilleri (Şekil 2E) ve ayrıca çekirdek muhabir farelerde GFP'yi eksprese eden parazitlerin birlikte tespiti için (Şekil 2F), sırasıyla yeşil ve kırmızı kanalları kullanın. TdTomato-eksprese eden parazitlerin, nükleer boyanın ve kalp vaskülatürünün (Şekil 3B,C) tespiti için sırasıyla kırmızı, yeşil ve uzak kırmızı (Ex/Em 640/680-730 nm) kanalları kullanın.
    3. Anti-RFP antikorlarını uzak kırmızı kanal ve anti-GFP nanocisimcikleri yeşil kanal kullanarak tespit edin (Şekil 3D).
  2. Elde edilen TIFF görüntü yığınlarını dönüştürün ve Imaris v9.7.2 yazılımını kullanarak organları 3B olarak yeniden yapılandırın (bkz.

9. Imaris yazılımı ile yüzey rekonstrüksiyonu ve nicelleştirme

  1. Yüzey algılama algoritması aracını seçin ve sihirbazı görüntü analiz yazılımında başlatın.
  2. İlgilenilen bir 3B bölgede (rastgele seçilmiş) bir ilk analiz yapın ve ardından tüm 3B organ rekonstrüksiyonuna uygulayın. Bir ilgi alanı (YG) seçtikten sonra, analiz edilecek kanalı seçin, pürüzsüz düğmenin işaretini kaldırın ve arka plan çıkarma işlemini seçin.
    NOT: Arka plan çıkarma, her voksel için benzersiz bir yerel arka plan değeri hesaplar ve bunu orijinal piksel değerinden çıkarır. Nesneye uyan en büyük kürenin çapı, T. cruzi ile enfekte olmuş hücreler için 200 μm, T hücreleri için 10 μm ve bireysel parazitler için 5 μm'ye kadar olmalıdır.
  3. Sınıflandırmayı ayarlamak için histogramı ve sınıflandırma ölçülerini seçmek için filtre açılır listesini kullanın.
    NOT: Sınıflandırmayı ayarlamak için histogramı kullanın: eliptiklik (oblate) ve sferisite ölçümleri önerilir.
  4. Sihirbazı sonlandırın, istatistik düğmesine basın ve parazit bulaşmış hücrelerin veya T hücrelerinin toplam sayısını, zaman noktası başına bağlantısı kesilmiş bileşen sayısı olarak alın.

Sonuçlar

KÜBİK sabit dokular, fiksatifleri çıkarmak için PBS ile yıkandı ve daha sonra doku mimarisini korurken dokunun renginin bozulmasına neden olan pigmentleri ve lipitleri dokudan çıkaran temel tamponlu bir amino alkol çözeltisi olan CUBIC-L kokteylleri ile inkübe edildi. Kağıttaki ızgara çizgileri, organların uygun şekilde temizlendiğini gösteren dokulardan görülebilir (Şekil 2A). Delipidasyondan sonra, dokular yıkandı ve sırasıyla RI homojenizasyonu...

Tartışmalar

Parazitlerin ve immün yanıtın yaygın, tüm organ görüntülemesinin olmaması, konakçı-parazit etkileşimlerinin karmaşıklığının anlaşılmasını sınırlar ve Chagas hastalığı için tedavilerin değerlendirilmesini engeller. Bu çalışma, T. cruzi ile enfekte olmuş farelerin bozulmamış organlarını ve dokularını açıklığa kavuşturmak ve boyamak için CUBIC boru hattını benimsemiştir.

Bu çalışmada çoklu doku temizleme protokolleri test edilmiştir (P...

Açıklamalar

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Dr. Etsuo Susaki'ye doku temizleme ve immün boyama protokolleri ile ilgili değerli yardımları ve önerileri için teşekkür ederiz. Ayrıca, LSFM ve konfokal görüntüleme kullanarak teknik destek için CTEGD Biyomedikal Mikroskopi Çekirdeğinden M. Kandasamy'ye minnettarız. Ayrıca Tarleton Araştırma Grubu'nun tüm üyelerine bu çalışma boyunca yararlı öneriler için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Referanslar

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 184Trypanosoma cruziChagastemizlemeimm n boyamaCUBICk tabakas floresan mikroskopisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır