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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la microscopia fluorescente a foglio luminoso e metodi automatizzati assistiti da software per visualizzare e quantificare con precisione i parassiti proliferanti e dormienti del Trypanosoma cruzi e le cellule T in organi e tessuti intatti e cancellati. Queste tecniche forniscono un modo affidabile per valutare i risultati del trattamento e offrono nuove informazioni sulle interazioni parassita-ospite.

Abstract

La malattia di Chagas è una patologia trascurata che colpisce milioni di persone in tutto il mondo, principalmente in America Latina. L'agente della malattia di Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), è un parassita intracellulare obbligato con una biologia diversificata che infetta diverse specie di mammiferi, compresi gli esseri umani, causando patologie cardiache e digestive. Il rilevamento affidabile delle infezioni in vivo da T. cruzi è stato a lungo necessario per comprendere la complessa biologia della malattia di Chagas e valutare accuratamente l'esito dei regimi di trattamento. L'attuale protocollo dimostra una pipeline integrata per la quantificazione automatizzata delle cellule infette da T. cruzi in organi ricostruiti in 3D e cancellati. La microscopia fluorescente a foglio luminoso consente di visualizzare e quantificare con precisione i parassiti T. cruzi attivamente proliferanti e dormienti e le cellule effettrici immunitarie in interi organi o tessuti. Inoltre, è stata adottata con successo la pipeline CUBIC-HistoVision per ottenere un'etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. La pulizia dei tessuti accoppiata con l'immunocolorazione 3D fornisce un approccio imparziale per valutare in modo completo i protocolli di trattamento farmacologico, migliorare la comprensione dell'organizzazione cellulare dei tessuti infetti da T. cruzi e si prevede che farà avanzare le scoperte relative alle risposte immunitarie anti-T. cruzi, al danno tissutale e alla riparazione nella malattia di Chagas.

Introduzione

La malattia di Chagas, causata dal parassita protozoo T. cruzi, è tra le malattie tropicali più trascurate al mondo, causando circa 13.000 morti all'anno. L'infezione spesso progredisce da uno stadio acuto a uno cronico producendo patologia cardiaca nel 30% dei pazienti, tra cui aritmie, insufficienza cardiaca e morte improvvisa 1,2. Nonostante la forte risposta immunitaria dell'ospite suscitata contro il parassita durante la fase acuta, un basso numero di parassiti persiste cronicamente per tutta la vita dell'ospite in tessuti come il cuore e il muscolo scheletrico. Diversi fattori, tra cui l'insorgenza ritardata delle risposte immunitarie adattative e la presenza di forme non replicanti del parassita, possono contribuire alla capacità di T. cruzi di evitare una completa eliminazione da parte del sistema immunitario 3,4,5,6. Inoltre, le forme dormienti non replicanti del parassita mostrano una bassa suscettibilità ai farmaci tripanocidi e possono in parte essere responsabili del fallimento del trattamento osservato in molti casi 7,8.

Lo sviluppo di nuove tecniche di imaging offre l'opportunità di ottenere informazioni sulla distribuzione spaziale dei parassiti nei tessuti infetti e sulla loro relazione con le cellule immunitarie coinvolte nel loro controllo. Queste caratteristiche sono cruciali per una migliore comprensione dei processi di controllo dei parassiti da parte del sistema immunitario e per tracciare i rari parassiti dormienti presenti nei tessuti cronici.

La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) è uno dei metodi più completi e imparziali per l'imaging 3D di tessuti o organi di grandi dimensioni senza sezionamento sottile. I microscopi a foglio di luce utilizzano un sottile foglio di luce per eccitare solo i fluorofori nel piano focale, ridurre il fotosbiancamento e la fototossicità dei campioni e registrare immagini di migliaia di strati di tessuto utilizzando telecamere ultraveloci. L'elevato livello di trasparenza tissutale necessario per la corretta penetrazione della luce laser nei tessuti si ottiene omogeneizzando l'indice di rifrazione (RI) dopo la delipidazione e la decolorazione dei tessuti, che riduce la dispersione della luce e rende immagini di alta qualità 9,10,11.

Sono stati sviluppati approcci di pulizia dei tessuti per l'imaging di topi interi 12,13,14, organoidi 15,16,17, organi che esprimono marcatori fluorescenti reporter 18,19,20,21,22,23 e recentemente un numero limitato di tessuti umani 24 . Gli attuali metodi per la pulizia dei tessuti sono classificati in tre famiglie: (1) metodi a base di solventi organici come i protocolli DISCO 25,26, (2) metodi a base di idrogel, come CLARITY27, e metodi acquosi, come CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . I protocolli CUBIC mantengono la forma degli organi e l'integrità dei tessuti, preservando la fluorescenza delle proteine reporter espresse endogenamente. L'aggiornamento più recente di questa tecnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), consente anche la rilevazione di epitopi utilizzando anticorpi marcati con fluorescenza e marcatura del DNA28.

Nel presente protocollo, è stata utilizzata la pipeline CUBIC per rilevare T. cruzi che esprimono proteine fluorescenti in tessuti murini chiariti intatti. I tessuti otticamente trasparenti sono stati ripresi con LSFM, ricostruiti in 3D e il numero totale preciso di cellule infette da T. cruzi , amastigoti dormienti e cellule T per organo è stato quantificato automaticamente. Inoltre, questo protocollo è stato adottato con successo per ottenere un'etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. Questi approcci sono essenziali per comprendere l'espansione e il controllo di T. cruzi negli ospiti infetti e sono utili per valutare pienamente la chemioterapia e l'immunoterapia per la malattia di Chagas.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio e l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento delle linee guida di accreditamento per la cura degli animali da laboratorio. Il protocollo sull'uso degli animali (controllo dell'infezione da T. cruzi nei topi-A2021 04-011-Y1-A0) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia. B6. Per il presente studio sono stati utilizzati topi C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J e C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (femmina,1-2 mesi di età). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Infezione, perfusione e dissezione

  1. Topi infettati per via intraperitoneale con tripomastigoti derivati da colture tissutali di Colombiana (DTU TcI) o Brasile (DTU TcV) ceppo di T. cruzi che esprimono rispettivamente proteine fluorescenti tdTomato o GFP. La dose di infezione potrebbe variare da 50.000 a 200.000 tripomastigoti diluiti in 100 μL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    NOTA: Dettagli specifici sulla generazione di parassiti reporter e modelli murini di infezione sono disponibili in Canavaci et al. 29 e Bustamante et al.30.
  2. Eutanasia dei topi per inalazione di anidride carbonica ad una portata di 3-7 L/min. Non appena gli animali smettono di mostrare qualsiasi riflesso del pedale, fare un'incisione longitudinale attraverso la pelle dall'addome verso lo sterno. Quindi tagliare la parete del corpo dall'addome e continuare attraverso le costole su ciascun lato del torace fino a quando lo sterno può essere sollevato, esponendo il cuore.
  3. Come descritto nella Figura 1, praticare un'incisione di 2,5 mm nel padiglione auricolare destro del cuore e raccogliere il sangue drenante utilizzando una punta di micropipetta da 1 ml.
  4. Inserire un ago a farfalla (collegato a un'estremità del sistema di perfusione) nell'apice del ventricolo sinistro fino a raggiungere l'aorta ascendente. Utilizzare colla a base di gel (vedere la tabella dei materiali) per sigillare il foro di ingresso attorno all'ago e mantenere l'ago in posizione durante le perfusioni.
  5. Perfondere i topi30 con 50 ml di eparina-PBS fredda (pH 7,4, 10 U/ml di eparina) o fino a quando il fluido che esce dal mouse verso il vassoio di raccolta è libero da sangue.
  6. Perfondere con 50 mL di paraformaldeide (PFA) fredda al 4% (p/v) (pH 7,4) in PBS.
    NOTA: La fissazione del tessuto PFA è probabilmente uno dei passaggi critici del protocollo, in particolare per il mantenimento delle strutture epitopiche e la successiva immunorilevazione. Il PFA si degrada nel tempo, quindi deve essere preparato al momento. Il pH della soluzione è anche importante per evitare una fissazione eccessiva, che potrebbe portare a una scarsa pulizia dei tessuti.
    ATTENZIONE: Il PFA è moderatamente tossico per contatto con la pelle. L'esposizione acuta è anche altamente irritante per il naso, gli occhi e la gola. L'esposizione a lungo termine a bassi livelli nell'aria o nella pelle può causare irritazione cutanea come dermatiti e prurito e problemi respiratori simili all'asma. Indossare protezioni per viso e occhi e non respirare polvere, gas, nebbia, fumi o vapori.
    1. Dopo la perfusione PFA, perfondere il topo con 100 mL di tampone CUBIC-P per raggiungere i livelli di chiarificazione menzionati al punto 1.5.
    2. Per preparare il tampone CUBIC-P, sciogliere il 10% di N-butildietanolammina, il 5% di Triton X-100 e il 5% di 1-N-metilimidazolo in acqua bidistillata o utilizzare i cocktail commerciali (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: passaggi 1.6.1.-1.6.2. sono raccomandati solo per organi altamente pigmentati come il cuore e i reni poiché richiedono una fase di pre-compensazione per ottenere maggiori livelli di trasparenza. Dopo aver usato CUBIC-P, sezionare gli organi e procedere direttamente al passaggio 2: Pulizia dei tessuti.
  7. Sezionare i campioni di tessuto/organi30 da visualizzare e post-fissarli in 4% (p/v) di PFA in PBS (~10 mL/intero organo) durante la notte (ON) a 4 °C con agitazione delicata (non più di 5 x g) in tubi conici da 50 ml.
    NOTA: Tutte le incubazioni da qui in poi devono essere eseguite su tubi posti orizzontalmente a 20-30 °C al riparo dalla luce.
  8. Lavare il campione in 10 mL di PBS (integrato con azoturo di sodio allo 0,05% (NaN 3) per3 ore (tre volte) a temperatura ambiente (RT) con agitazione delicata (5 x g).
    NOTA: I tessuti possono essere congelati incubando in 10 ml di saccarosio al 30% in PBS con agitazione delicata (5 x g) a 4 °C ON in tubi conici da 50 ml. Dopo che i tessuti sono affondati sul fondo del tubo, incorporarli nel composto OCT e mantenerli a -80 °C. Scongelare a RT fino a quando il composto OCT si scioglie completamente, quindi lavare in PBS (~10 mL/organo intero) ON a 4 °C con agitazione delicata (5 x g) in tubi conici da 50 ml. Procedere al passaggio 2.

2. Pulizia dei tessuti

NOTA: Tutte le pulizie dei tessuti eseguite in questo lavoro sono state eseguite utilizzando il protocollo CUBIC I22. Sono stati utilizzati tre diversi cocktail: CUBIC-P per la delipidazione e la rapida decolorazione durante le perfusioni, CUBIC-L per la delipidazione e la decolorazione e CUBIC-R per l'abbinamento RI. La colorazione del DNA e l'immunocolorazione sono state eseguite utilizzando rispettivamente il kit di colorazione nucleare 3D CUBIC-HV 1 e il kit di immunocolorazione 3D CUBIC-HV 1 (vedi Tabella dei materiali).

  1. Immergere i singoli organi in 10 mL di CUBIC-L diluito al 50% in acqua (vedi Tabella dei materiali) agitando delicatamente (5 x g) a RT (ON) in tubi conici da 50 ml. Tenere i tubi piatti sulla piastra di agitazione.
    NOTA: Per evitare danni ai tessuti, gli organi vengono mantenuti nello stesso tubo e le soluzioni vengono raccolte utilizzando un sistema di vuoto. Per preparare CUBIC-L, sciogliere il 10% di N-butildietanolammina e il 10% di Triton X-100 in acqua bidistillata utilizzando i cocktail commerciali (vedi Tabella dei materiali).
    ATTENZIONE: CUBIC-L provoca gravi lesioni oculari. Indossare protezioni per occhi e viso. Smaltire in un impianto di smaltimento dei rifiuti riconosciuto.
  2. Immergere il campione in 10 ml di 100% CUBIC-L per 6 giorni (rinfrescando la soluzione il giorno 3).
    NOTA: Al termine di questo periodo di incubazione, i tessuti devono essere quasi completamente trasparenti.
  3. Lavare gli organi trasparenti con PBS (integrato con 0,05% NaN3) per 2 ore (tre volte) a 37 °C con agitazione delicata (5 x g). Trasferire i fazzoletti in un nuovo tubo conico da 50 mL ad ogni lavaggio per rimuovere Triton X-100.
    NOTA: Come descritto nella Figura 2B, se l'obiettivo dell'esperimento è quello di visualizzare proteine reporter espresse endogenamente da parassiti o topi transgenici di T. cruzi (Figura 2C-F), saltare i passaggi 3, 4 e 5 e continuare direttamente con il punto 6.

3. Colorazione del DNA

  1. Diluire il colorante di acidi nucleici disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) in 5 ml di tampone colorante (incluso nel kit) a 1/2.500 di diluizione.
  2. Immergere il tessuto nella soluzione di colorante nucleare e incubare a 37 °C con una leggera rotazione per 5 giorni utilizzando tubi conici da 15 mL in posizione eretta.
  3. Lavare con 15 ml di tampone di lavaggio 3D per macchie nucleari (incluso nel kit) per 2 ore (tre volte) a RT con agitazione delicata (5 x g).
    NOTA: Altri coloranti di DNA possono essere utilizzati in queste concentrazioni e tempi di incubazione: DAPI (incluso nel kit): 1/200, 5 giorni di incubazione; BOBO-1: 1/400, 5 giorni di incubazione; Ioduro di propidio (PI) (incluso nel kit): 1/100, 3 giorni di incubazione; RedDot2: 1/250, 3 giorni di incubazione. Se lo scopo specifico dell'esperimento è quello di visualizzare sia le proteine reporter espresse endogenamente che utilizzare coloranti nucleari, saltare i passaggi 4 e 5 e continuare direttamente al punto 6.

4. Digestione della matrice extracellulare (ECM)

NOTA: La digestione della ialuronidasi della ECM deve essere eseguita per facilitare la corretta penetrazione degli anticorpi nelle regioni profonde dei tessuti28.

  1. Immergere i singoli organi in 15 mL di tampone di reazione ialuronidasi per 2 ore a 37 °C in un tubo conico da 50 mL in posizione piana al riparo dalla luce.
    NOTA: Per preparare il tampone di reazione della ialuronidasi, sciogliere 10 mM di CAPSO; 150 mM di cloruro di sodio (NaCl) e 0,05% di NaN3 (vedi tabella dei materiali) in acqua bidistillata e regolare il pH a 10.
  2. Preparare la soluzione enzimatica mescolando 75 μL di 20 mg/ml di stock di ialuronidasi in 425 μL di tampone di reazione ialuronidasi. Per preparare 20 mg/mL di stock di ialuronidasi, sciogliere la ialuronidasi in 50 mM di tampone carbonatico, 150 mM di NaCl, 0,01% di BSA e 0,05% di NaN3 (vedere Tabella dei materiali). Regolare il pH a 10 e aliquote in volumi di 77 μL a -30 °C.
  3. Eliminare il tampone di reazione della ialuronidasi con una pipetta e immergere l'organo nella soluzione enzimatica (500 μL in un tubo conico da 15 ml) in posizione eretta al riparo dalla luce per 24 ore a 37 °C con agitazione delicata (5 x g).
  4. Lavare il campione in 15 mL di tampone di lavaggio ialuronidasi in un tubo conico da 50 mL in posizione orizzontale al riparo dalla luce per 2 ore (tre volte) a 37 °C con agitazione delicata (5 x g).
    1. Per preparare il tampone di lavaggio ialuronidasi, sciogliere 50 mM di tampone carbonato, 150 mM di NaCl, 0,1% (v/v) di Triton X-100, 5% (v/v) di metanolo e 0,05% NaN3. Regolare il pH a 10. Per preparare 10 volte il brodo tampone di carbonato-NaCl, sciogliere 2,96 g di carbonato di sodio, 1,86 g di carbonato acido di sodio e 8,77 g di NaCl in 100 ml di acqua bidistillata con lo 0,05% di NaN3 (vedere la tabella dei materiali) e regolare il pH a 10.

5. Immunocolorazione

  1. Etichettare la vascolarizzazione utilizzando anticorpi anti-α-SMA (actina alfa-piccolo muscolo, vedere la tabella dei materiali) seguendo i passaggi seguenti.
    1. Generare complesso anticorpale secondario primario più coniugato Fab frammento. Inizia questa reazione 1,5 ore prima della procedura di colorazione.
      1. Calcolare la quantità richiesta di anticorpi primari e secondari (mescolare con un rapporto 1:0,5 in peso).
        NOTA: Per l'anticorpo primario anti-α-SMA, sono necessari 3,5 μg per marcare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per il prodotto da 2,5 mg/ml, sono necessari 3,5/2,5 = 1,4 μL di soluzione anticorpale. Per l'anticorpo secondario AlexaFluor 647 anti-topo Fab fragment, sono necessari 1,75 μg per etichettare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per il prodotto da 1,7 mg/ml, è necessario 1,75/1,7 = 1 μL di soluzione anticorpale.
      2. Mescolare gli anticorpi primari e secondari in una provetta ambrata da 2 mL e incubare per 1,5 ore a 37 °C.
    2. Per lo scambio di tampone, miscelare 7,5 mL di 2x tampone immunocolorante 3D HV1 (incluso nel kit, vedere Tabella dei materiali) con 7,5 mL di acqua bidistillata e immergere il campione di tessuto per 1,5 ore a 32 °C con un leggero scuotimento (5 x g) in un tubo conico da 15 mL in posizione orizzontale. Iniziare questa reazione simultaneamente come generazione di complesso anticorpale (1,5 ore prima della procedura di immunocolorazione).
  2. Eseguire l'immunocolorazione 3D seguendo i passaggi seguenti.
    1. In una provetta conica da 15 ml, preparare la soluzione anticorpale colorante seguendo il file supplementare 1.
    2. Prelevare il campione di tessuto dal mezzo di scambio tampone (punto 5.1.2) e immergerlo nella soluzione anticorpale. Incubare i tessuti singolarmente per 1 settimana a 32 °C agitando delicatamente (5 x g) le provette in posizione eretta al riparo dalla luce. Sigillare il tubo con pellicola di paraffina per evitare l'evaporazione.
    3. Passare a 4 °C e incubare ON in posizione eretta.
    4. Raffreddare 1x tampone immunocolorante 3D HV1 (incluso nel kit, vedere la tabella dei materiali) a 4 °C e lavare il campione con tampone da 15 ml (due volte) per 30 minuti ciascuno a 4 °C con agitazione delicata (5 x g). Tenere 15 mL di tubi conici in posizione orizzontale fino al punto 5.2.7.
    5. Diluire la formalina all'1% in 1x tampone di lavaggio immunocolorante HV1 3D e immergere il campione in 8 mL della soluzione per 24 ore a 4 °C agitando delicatamente (5 x g).
    6. Incubare in soluzione fresca di formalina all'1% per 1 h a 37 °C agitando delicatamente (5 x g).
    7. Lavare in 15 mL di PBS per 2 ore a 25 °C agitando delicatamente (5 x g).
  3. Aumentare il segnale tdTomato utilizzando anticorpi anti-Red Fluorescent Protein (RFP) seguendo i passaggi seguenti.
    1. Seguire gli stessi tempi di incubazione e le stesse temperature del punto 5.2.2. Calcolare la quantità di anticorpi primari e secondari (vedere la tabella dei materiali) e mescolarli in un rapporto 1:0,5 in peso.
      NOTA: Per l'anticorpo primario anti-RFP, sono necessari 5 μg per etichettare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per 1,25 mg/mL di prodotto, sono necessari 5/1,25 = 4 μL della soluzione. Per l'anticorpo secondario Alexa Fluor 647 anti-coniglio Fab frammento, sono necessari 2,5 μg per etichettare l'intero cuore o un frammento di muscolo scheletrico di dimensioni simili. Per il prodotto da 1,5 mg/ml, sono necessari 2,5/1,5 = 1,7 μL della soluzione.
    2. Preparare la soluzione anticorpale come indicato nel file supplementare 1.
  4. Potenzia i segnali GFP utilizzando nanocorpi anti-GFP seguendo i passaggi seguenti.
    1. Seguire gli stessi tempi di incubazione e le stesse temperature indicati al punto 5.2.2.
      NOTA: I nanocorpi anti-GFP (vedi Tabella dei materiali) sono coniugati con Alexa Fluor 647, quindi la generazione del complesso anticorpale non è necessaria.
    2. Preparare la soluzione anticorpale come indicato nel file supplementare 1.

6. Corrispondenza RI

  1. Immergere organi trasparenti in 5 mL di soluzione CUBIC-R+ diluita in acqua al 50% (vedere Tabella dei materiali) a RT (ON) agitando delicatamente (5 x g) in un tubo conico da 50 ml. Mantenere i tubi in posizione eretta durante l'intera fase di corrispondenza del RI.
    NOTA: Le soluzioni riciclate di CUBIC R+ provenienti da esperimenti precedenti potrebbero essere riutilizzate (fino a quattro volte) in questa fase. Per preparare la soluzione CUBIC-R+, sciogliere il 45% di 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolone (antipirina), il 30% di nicotinamide o N-metilnicotinamide e lo 0,5% di N-butildietanolammina in acqua bidistillata o utilizzare il tampone commerciale CUBIC-R+ (vedere Tabella dei materiali).
    ATTENZIONE: CUBIC-R+ provoca irritazione cutanea, grave irritazione oculare e danni agli organi. Indossare guanti protettivi e garantire la protezione degli occhi e del viso. Non respirare polvere, fumi, gas, nebbia o vapori. Smaltire in un impianto di smaltimento dei rifiuti riconosciuto.
  2. Sostituire il 50% di CUBIC-R+ con 5 mL di 100% di CUBIC-R+ e incubare con un leggero agitamento (5 x g) a RT per 2 giorni. Quindi, trasferire i tessuti su una pila di salviette prive di lanugine e ruotare con attenzione i tessuti per rimuovere la soluzione CUBIC-R+ dalle superfici degli organi per 5 minuti.

7. Montaggio

  1. Dopo aver asciugato i tessuti, trasferirli in 5 ml di soluzione di montaggio (RI = 1,520) (vedere Tabella dei materiali) in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti e incubarli (ON) a RT. Girare frequentemente i tessuti per eliminare le bolle d'aria, specialmente sulle superfici degli organi.
    NOTA: Gli organi possono essere conservati per più di 6 mesi in Mounting Solution o CUBIC-R+.
  2. Far aderire i tessuti al supporto del campione del microscopio utilizzando colla gel a base di cianoacrilato.
  3. Immergere i campioni nella cuvetta di quarzo del microscopio riempita con 120 ml di soluzione di montaggio e visualizzarli trasversalmente al loro asse longitudinale. Aderire al cuore con l'apice e l'aorta allineati orizzontalmente.
    NOTA: Gli organi chiariti e montati possono essere sezionati con una vibratoma e ripresi ad alto ingrandimento mediante microscopia confocale. Incorporare gli organi in agarosio al 2% e tagliare sezioni di 100-500 μm. Gli organi possono anche essere sezionati manualmente con una lama affilata per produrre sezioni di tessuto spesso (>1000 μm). Dopo il sezionamento, posizionare le fette in piastre di Petri da 35 mm con fondo di vetro, montare utilizzando la stessa soluzione di montaggio, sigillare con smalto per unghie e immagine con un microscopio confocale.

8. Acquisizione di immagini

  1. Immagina i campioni montati con un microscopio a foglio luminoso (vedi Tabella dei materiali). Impostare l'ingrandimento e la dimensione del passo tra le singole fette a 3 μm e utilizzare laser a foglio luminoso destro e sinistro con spessori di 5 μm e larghezza del 100%. Impostare la costante del tempo di esposizione a 50-100 ms e regolare la potenza del laser dal 10% all'80% a seconda dell'intensità del segnale di fluorescenza.
    1. Per la co-rilevazione di parassiti che esprimono il pomodoro e amastigoti dormienti colorati con DiR (Figura 2C), utilizzare rispettivamente canali rossi (Ex/Em 561/620-660 nm) e infrarossi (Ex/Em 785/845-55 nm). Per la co-rilevazione di cellule T e parassiti che esprimono tdTomato-espressi nel topo reporter CD8 (Figura 2D), utilizzare rispettivamente il canale verde (Ex/Em 488/525-50 nm) e il canale rosso.
    2. Per i saggi di coinfezione (Figura 2E), così come per la co-rilevazione di parassiti che esprimono GFP in topi reporter nuclei (Figura 2F), utilizzare rispettivamente i canali verde e rosso. Per la rilevazione di tdParassiti che esprimono il pomodoro, colorante nucleare e vascolarizzazione cardiaca (Figura 3B, C), utilizzare rispettivamente i canali rosso, verde e rosso lontano (Ex/Em 640/680-730 nm).
    3. Rilevare gli anticorpi anti-RFP con il canale rosso lontano e i nanocorpi anti-GFP utilizzando il canale verde (Figura 3D).
  2. Convertire gli stack di immagini TIFF acquisiti e ricostruire in 3D gli organi utilizzando il software Imaris v9.7.2 (vedi Tabella dei materiali).

9. Ricostruzione e quantificazione delle superfici con il software Imaris

  1. Selezionare lo strumento dell'algoritmo di rilevamento delle superfici e avviare la procedura guidata nel software di analisi delle immagini.
  2. Eseguire un'analisi iniziale in una regione 3D di interesse (selezionata casualmente) e quindi applicarla all'intera ricostruzione dell'organo 3D. Dopo aver scelto una regione di interesse (ROI), selezionare il canale da analizzare, deselezionare il pulsante Arrotonda e selezionare la sottrazione in background.
    NOTA: la sottrazione dello sfondo calcola un valore di sfondo locale univoco per ogni voxel e lo sottrae dal valore pixel originale. Il diametro della sfera più grande che si inserisce nell'oggetto deve essere fino a 200 μm per le cellule infette da T. cruzi, 10 μm per le cellule T e 5 μm per i singoli parassiti.
  3. Utilizzare l'istogramma per regolare la classificazione e l'elenco a discesa del filtro per selezionare le misure per la classificazione.
    NOTA: Utilizzare l'istogramma per regolare la classificazione: si raccomandano misure di ellitticità (oblate) e sfericità.
  4. Finalizzare la procedura guidata, premere il pulsante delle statistiche e recuperare il numero totale di cellule infette da parassiti o cellule T come numero di componenti disconnessi per punto temporale.

Risultati

I tessuti fissi CUBIC sono stati lavati con PBS per rimuovere i fissativi e quindi incubati con cocktail CUBIC-L, una soluzione tamponata di base di amminoalcoli che estraggono pigmenti e lipidi dal tessuto con conseguente decolorazione del tessuto mantenendo l'architettura tissutale. Le linee della griglia nella carta possono essere viste attraverso i tessuti che indicano un'appropriata pulizia degli organi (Figura 2A). Dopo la delipidazione, i tessuti sono stati lavati e i...

Discussione

L'assenza di un'ampia imaging dell'intero organo dei parassiti e della risposta immunitaria limita la comprensione della complessità delle interazioni ospite-parassita e impedisce la valutazione delle terapie per la malattia di Chagas. Il presente studio ha adottato la pipeline CUBIC per chiarire e colorare organi e tessuti intatti di topi infetti da T. cruzi.

In questo studio sono stati testati più protocolli di pulizia dei tessuti (PACT32, ECi 33, FLASH

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Ringraziamo il Dr. Etsuo Susaki per il loro prezioso aiuto e le raccomandazioni riguardanti i protocolli di pulizia dei tessuti e immunocolorazione. Inoltre, siamo grati a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core per il supporto tecnico utilizzando LSFM e imaging confocale. Ringraziamo anche tutti i membri del Tarleton Research Group per gli utili suggerimenti durante questo studio.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Riferimenti

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).

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