Imagem 3D quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células T em órgãos esclarecidos intactos

Resumo

O presente protocolo descreve microscopia fluorescente de folha de luz e métodos automatizados assistidos por software para visualizar e quantificar precisamente parasitas Trypanosoma cruzi e células T intactos e limpos. Essas técnicas fornecem uma maneira confiável de avaliar os resultados do tratamento e oferecem novas percepções sobre as interações parasita-host.

Resumo

A doença de Chagas é uma patologia negligenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente na América Latina. O agente da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é um parasita intracelular obrigatório com uma biologia diversificada que infecta várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causando patologias cardíacas e digestivas. A detecção confiável de infecções in vivo de T. cruzi há muito tempo é necessária para entender a biologia complexa da doença de Chagas e avaliar com precisão o resultado dos regimes de tratamento. O protocolo atual demonstra um pipeline integrado para quantificação automatizada de células infectadas por T. cruzi em órgãos limpos em 3D. A microscopia fluorescente de folha de luz permite visualizar e quantificar com precisão parasitas T. cruzi e células de efeito imunológico em órgãos ou tecidos inteiros. Além disso, o gasoduto CUBIC-HistoVision para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares foi adotado com sucesso. A limpeza tecidual aliada à imunostaining 3D fornece uma abordagem imparcial para avaliar de forma abrangente os protocolos de tratamento de drogas, melhorar a compreensão da organização celular dos tecidos infectados por T. cruzi, e espera-se que avancem descobertas relacionadas às respostas imunes anti-T. cruzi , danos teciduais e reparação na doença de Chagas.

Introdução

A doença de Chagas, causada pelo parasita protozoário T. cruzi, está entre as doenças tropicais mais negligenciadas do mundo, causando aproximadamente 13.000 mortes anuais. A infecção muitas vezes progride de um estágio agudo para um estágio crônico produzindo patologia cardíaca em 30% dos pacientes, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita ^1,2. Apesar da forte resposta imune hospedeira provocada contra o parasita durante a fase aguda, o baixo número de parasitas cronicamente persiste ao longo da vida do hospedeiro em tecidos como o coração e o músculo esquelético. Vários fatores, in....

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com a Política de Serviços Públicos de Saúde sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e Associação para Avaliação e Acreditação das Diretrizes de Credenciamento de Cuidados Com Animais Laboratoriais. O Protocolo de Uso animal (controle da infecção por T. cruzi em camundongos-A2021 04-011-Y1-A0) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia. O B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Osor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J e C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (fêmea, 1-2 meses) foram utilizados para o presente estudo....

Resultados

Os tecidos fixos cúbicos foram lavados com PBS para remover fixativos e, em seguida, incubados com coquetéis CUBIC-L, uma solução básica tamponada de aminocos que extraem pigmentos e lipídios do tecido resultando em descoloração do tecido, mantendo a arquitetura tecidual. As linhas de grade no papel podem ser vistas através dos tecidos indicando uma limpeza adequada dos órgãos (Figura 2A). Após a delipidação, os tecidos foram lavados e imersos em CUBIC-R+ e sol.......

Discussão

A ausência de imagens extensas e de órgãos inteiros de parasitas e a resposta imune limita a compreensão da complexidade das interações hospedeiro-parasita e impede a avaliação das terapias para a doença de Chagas. O presente estudo adotou o gasoduto CUBIC para esclarecer e manchar órgãos e tecidos intactos de camundongos infectados por T. cruzi.

Vários protocolos de limpeza de tecidos foram testados neste estudo (PACT³², ECi³³

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methylimidazole	Millipore Sigma	616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine	TCI	D1876
6-wells cell culture plates	ThermoFisher Scientific	140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment	Jackson Immuno Research Laboratories	315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment	Jackson Immuno Research Laboratories	111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647	Chromotek	gb2AF647-50
anti-RFP	Rockland	600-401-379
anti-α-SMA	Sigma	A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #007914	Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #007914	Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide	ThermoFisher Scientific	B3582
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #032080	Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO	Sigma	#C2278
Cleaning wipes Kimwipes	Kimberly-Clark	T8788
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit	TCI	C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit	TCI	C3698
CUBIC-L	TCI	T3740
CUBIC-P	TCI	T3782
CUBIC-R+	TCI	T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue	Scotch	571605
DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium	Biotium	#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL	Corning	CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL	Corning	CLS430290
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128
Heparin	ThermoFisher Scientific	J16920.BBR
Hyaluronidase	Sigma	#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64	BitPlane	v9.2.0
Imaris software	BitPlane	v9.3
ImSpector software	LaVision BioTec, Miltenyi Biotec	v6.7
Intravenous injection needle 23-G	Sartori, Minisart Syringe filter	16534
Kimwipes			lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope	Miltenyi Biotec	ULtramicroscope II imaging system
Methanol	ThermoFisher Scientific	041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL	Axygen	T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser	Fisher Scientific, Fisherbrand	03-692-172
Mounting Solution	TCI	M3294
N-butyldiethanolamine	TCI	B0725
Nicotinamide	TCI	N0078
N-Methylnicotinamide	TCI	M0374
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain	Biotium	#40061
Sacrifice Perfusion System	Leica	10030-380
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Serological pipettes	Costar Sterile	4488
Shaking incubator	TAITEC	BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)	ThermoFisher Scientific	447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)	ThermoFisher Scientific	L13098.36
Sodium Chloride (NaCl)	ThermoFisher Scientific	447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	ThermoFisher Scientific	014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7020
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787