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Resumo

O presente protocolo descreve microscopia fluorescente de folha de luz e métodos automatizados assistidos por software para visualizar e quantificar precisamente parasitas Trypanosoma cruzi e células T intactos e limpos. Essas técnicas fornecem uma maneira confiável de avaliar os resultados do tratamento e oferecem novas percepções sobre as interações parasita-host.

Resumo

A doença de Chagas é uma patologia negligenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente na América Latina. O agente da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é um parasita intracelular obrigatório com uma biologia diversificada que infecta várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causando patologias cardíacas e digestivas. A detecção confiável de infecções in vivo de T. cruzi há muito tempo é necessária para entender a biologia complexa da doença de Chagas e avaliar com precisão o resultado dos regimes de tratamento. O protocolo atual demonstra um pipeline integrado para quantificação automatizada de células infectadas por T. cruzi em órgãos limpos em 3D. A microscopia fluorescente de folha de luz permite visualizar e quantificar com precisão parasitas T. cruzi e células de efeito imunológico em órgãos ou tecidos inteiros. Além disso, o gasoduto CUBIC-HistoVision para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares foi adotado com sucesso. A limpeza tecidual aliada à imunostaining 3D fornece uma abordagem imparcial para avaliar de forma abrangente os protocolos de tratamento de drogas, melhorar a compreensão da organização celular dos tecidos infectados por T. cruzi, e espera-se que avancem descobertas relacionadas às respostas imunes anti-T. cruzi , danos teciduais e reparação na doença de Chagas.

Introdução

A doença de Chagas, causada pelo parasita protozoário T. cruzi, está entre as doenças tropicais mais negligenciadas do mundo, causando aproximadamente 13.000 mortes anuais. A infecção muitas vezes progride de um estágio agudo para um estágio crônico produzindo patologia cardíaca em 30% dos pacientes, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita 1,2. Apesar da forte resposta imune hospedeira provocada contra o parasita durante a fase aguda, o baixo número de parasitas cronicamente persiste ao longo da vida do hospedeiro em tecidos como o coração e o músculo esquelético. Vários fatores, incluindo o início atrasado das respostas imunes adaptativas e a presença de formas não replicantes do parasita, podem contribuir para a capacidade de T. cruzi para evitar uma eliminação completa pelo sistema imunológico 3,4,5,6. Além disso, as formas dormentes não replicadas do parasita apresentam baixa suscetibilidade aos fármacos trypanocidas e podem, em parte, ser responsáveis pela falha de tratamento observada em muitos casos 7,8.

O desenvolvimento de novas técnicas de imagem proporciona uma oportunidade de obter uma visão sobre a distribuição espacial dos parasitas nos tecidos infectados e sua relação com as células imunes envolvidas em seu controle. Essas características são cruciais para uma melhor compreensão dos processos de controle de parasitas pelo sistema imunológico e rastreamento dos raros parasitas dormentes presentes nos tecidos crônicos.

A microscopia de fluorescência de folhas de luz (LSFM) é um dos métodos mais abrangentes e imparcial para imagens 3D de grandes tecidos ou órgãos sem secção fina. Microscópios de folha de luz utilizam uma fina folha de luz para apenas excitar os fluoroforos no plano focal, reduzir o fotobleaching e a fototoxicidade das amostras, e gravar imagens de milhares de camadas de tecido usando câmeras ultrarrápidas. O alto nível de transparência tecidual necessário para a penetração adequada da luz laser nos tecidos é obtido pela homogeneização do índice de refração (RI) após a delipidação e descoloração do tecido, o que reduz a dispersão da luz e torna imagens de alta qualidade 9,10,11.

Abordagens de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para a imagem de camundongos inteiros 12,13,14, organoides 15,16,17, órgãos expressando marcadores fluorescentes repórteres 18,19,20,21,22,23, e recentemente um número limitado de tecidos humanos24 . Os métodos atuais de limpeza tecidual são classificados em três famílias: (1) métodos orgânicos à base de solventes, como os protocolos DISCO 25,26, (2) métodos à base de hidrogel, como CLARITY27, e métodos aquosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis)18,19,28,29 . Os protocolos CÚBICOS mantêm a forma dos órgãos e a integridade dos tecidos, preservando a fluorescência das proteínas de repórteres expressas endógenamente. A atualização mais recente desta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), também permite a detecção de epítopos usando anticorpos fluorescentes e rotulagem de DNA28.

No presente protocolo, utilizou-se o pipeline CUBIC para detecção de T. cruzi expressando proteínas fluorescentes em tecidos de camundongos intactos esclarecidos. Os tecidos opticamente transparentes foram imagens LSFM, reconstruídas em 3D, e o número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes dormentes e células T por órgão foram automaticamente quantificados. Além disso, este protocolo foi adotado com sucesso para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares. Essas abordagens são essenciais para a compreensão da expansão e controle de T. cruzi em hospedeiros infectados e são úteis para avaliar plenamente a quimioterapia e a imunoterapia para a doença de Chagas.

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Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com a Política de Serviços Públicos de Saúde sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e Associação para Avaliação e Acreditação das Diretrizes de Credenciamento de Cuidados Com Animais Laboratoriais. O Protocolo de Uso animal (controle da infecção por T. cruzi em camundongos-A2021 04-011-Y1-A0) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia. O B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Osortm14(CAG-tdTomato)Hze/J e C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (fêmea, 1-2 meses) foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Infecção, perfusão e dissecção

  1. Infectar camundongos intraperitonealmente com tripolas derivados da cultura tecidual da Colombiana (DTU TcI) ou do Brasil (DTU TcV) T. cruzi que expressam proteínas fluorescentes tdTomato ou GFP, respectivamente. A dose de infecção pode variar de 50.000 a 200.000 trypomastigotes diluídos em 100 μL de 1x Salina Tamponada com Fosfato (PBS).
    NOTA: Detalhes específicos sobre a geração de parasitas repórteres e modelos de infecção de camundongos estão disponíveis em Canavaci et al. 29 e Bustamante et al.30.
  2. Eutanize os camundongos por inalação de dióxido de carbono a uma taxa de fluxo de 3-7 L/min. Assim que os animais pararem de mostrar qualquer reflexo do pedal, faça uma incisão longitudinal através da pele do abdômen em direção ao esterno. Em seguida, corte a parede do corpo do abdômen e continue através das costelas de cada lado do tórax até que o esterno possa ser levantado, expondo o coração.
  3. Como descrito na Figura 1, faça uma incisão de 2,5 mm no aurículo direito do coração e colete o sangue drenante usando uma ponta de micropipette de 1 mL.
  4. Insira uma agulha borboleta (conectada a uma extremidade do sistema de perfusão) no ápice do ventrículo esquerdo até atingir a aorta ascendente. Use cola à base de gel (ver Tabela de Materiais) para selar o orifício de entrada ao redor da agulha e manter a agulha em posição durante as perfusões.
  5. Perfunda os camundongos30 com 50 mL de Heparin-PBS frio (pH 7.4, 10 U/mL de Heparina) ou até que o fluido que sai do rato em direção à bandeja de coleta esteja livre de sangue.
  6. Perfuse com 50 mL de frio 4% (w/v) paraformaldeído (PFA) (pH 7.4) em PBS.
    NOTA: A fixação do tecido PFA é provavelmente uma das etapas críticas do protocolo, especialmente para a manutenção de estruturas de epítope e imunodetação subsequente. A PFA degrada-se com o tempo, por isso deve estar preparada recentemente. O pH da solução também é importante para evitar a super fixação, o que pode levar à má limpeza dos tecidos.
    ATENÇÃO: O PFA é moderadamente tóxico pelo contato com a pele. A exposição aguda também é altamente irritante para o nariz, olhos e garganta. A exposição a longo prazo a baixos níveis no ar ou na pele pode causar irritação na pele, como dermatite e coceira, e problemas respiratórios semelhantes à asma. Use proteção facial e ocular e não respire poeira, gás, névoa, vapores ou vapores.
    1. Seguindo a perfusão pfa, perfusam o mouse com 100 mL de buffer CUBIC-P para atingir os níveis de esclarecimento mencionados na etapa 1.5.
    2. Para preparar o buffer CUBIC-P, dissolva 10% N-butildiethanolamina, 5% Triton X-100 e 5% 1-N-Metilimidazole em água duplamente destilada ou use os coquetéis comerciais (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Passos 1.6.1.-1.6.2. são recomendados apenas para órgãos altamente pigmentados, como coração e rim, uma vez que requerem uma etapa de pré-compensação para obter níveis aumentados de transparência. Após o uso do CUBIC-P, disseca os órgãos e proceda diretamente à etapa 2: Limpeza tecidual.
  7. Disseca as amostras/órgãos de tecido30 a serem imagens e depois corrigi-las em 4% (w/v) PFA em PBS (~10 mL/órgão inteiro) durante a noite (ON) a 4 °C com agitação suave (não mais que 5 x g) em tubos cônicos de 50 mL.
    NOTA: Todas as incubações do futuro devem ser realizadas em tubos que estejam horizontalmente a 20-30 °C protegidos da luz.
  8. Lave a amostra em 10 mL de PBS (suplementada com azida de sódio de 0,05% (NaN3) por 3h (três vezes) à temperatura ambiente (RT) com agitação suave (5 x g).
    NOTA: Os tecidos podem ser congelados incubando em 10 mL de 30% de sacarose em PBS com agitação suave (5 x g) a 4 °C ON em tubos cônicos de 50 mL. Depois que os tecidos afundarem na parte inferior do tubo, incorpore-os no composto OCT e mantenha-os a -80 °C. Descongele no RT até que o composto OCT derreta completamente, depois lave em PBS (~10 mL/órgão inteiro) ON a 4 °C com agitação suave (5 x g) em tubos cônicos de 50 mL. Prossiga para a etapa 2.

2. Limpeza de tecidos

NOTA: Todas as clareiras de tecido realizadas neste trabalho foram feitas utilizando o protocolo CUBIC I22. Foram utilizados três coquetéis diferentes: CUBIC-P para delipidação e descoloração rápida durante perfusões, CUBIC-L para delipidação e descoloração, e CUBIC-R para correspondência de RI. A coloração de DNA e as imunossagens foram realizadas utilizando-se kit de coloração nuclear CUBIC-HV 1 3D e kit de imunostaining CUBIC-HV 1 3D, respectivamente (ver Tabela de Materiais).

  1. Mergulhe órgãos individuais em 10 mL de 50% cubic-l diluído pela água (ver Tabela de Materiais) com agitação suave (5 x g) em RT (ON) em tubos cônicos de 50 mL. Mantenha os tubos lisos na placa de agitação.
    NOTA: Para evitar danos teciduais, os órgãos são mantidos no mesmo tubo, e as soluções são coletadas usando um sistema de vácuo. Para preparar o CUBIC-L, dissolva 10% de N-butyldiethanolamina e 10% Triton X-100 em água duplamente destilada usando os coquetéis comerciais (ver Tabela de Materiais).
    ATENÇÃO: O CUBIC-L causa sérios danos oculares. Use proteção de olhos e rostos. Descarte em uma usina de disposição aprovada.
  2. Mergulhe a amostra em 10 mL de 100% CUBIC-L por 6 dias (refrescando a solução no dia 3).
    NOTA: Ao final deste período de incubação, os tecidos devem ser quase completamente transparentes.
  3. Lave os órgãos transparentes com PBS (suplementado com 0,05% NaN3) por 2h (três vezes) a 37 °C com agitação suave (5 x g). Transfira os tecidos para um novo tubo cônico de 50 mL a cada lavagem para remover Triton X-100.
    NOTA: Conforme descrito na Figura 2B, se o objetivo do experimento é visualizar proteínas repórteres endógenas de parasitas ou camundongos transgênicos T. cruzi (Figura 2C-F), pule as etapas 3, 4 e 5 e continue diretamente ao passo 6.

3. Coloração de DNA

  1. Diluir o corante nucleico ácido comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) em 5 mL de tampão de coloração (incluído no kit) a 1/2.500 diluição.
  2. Mergulhe o tecido na solução de corante nuclear e incubar a 37 °C com rotação suave por 5 dias usando tubos cônicos de 15 mL em posição de pé.
  3. Lave com 15 mL de tampão de lavagem de manchas nucleares 3D (incluído no kit) por 2 h (três vezes) no RT com agitação suave (5 x g).
    NOTA: Outros corantes de DNA podem ser usados nessas concentrações e tempos de incubação: DAPI (incluído no kit): 1/200, 5 dias de incubação; BOBO-1: 1/400, 5 dias de incubação; Iodeto de propidium (PI) (incluído no kit): 1/100, incubação de 3 dias; RedDot2: 1/250, 3 dias de incubação. Se o objetivo específico do experimento é visualizar tanto proteínas repórteres endógenas expressas quanto usar manchas nucleares, pule as etapas 4 e 5 e continue diretamente ao passo 6.

4. Digestão da matriz extracelular (ECM)

NOTA: A digestão de Hialuronidase do ECM deve ser realizada para facilitar a penetração adequada dos anticorpos em regiões profundas dos tecidos28.

  1. Mergulhe órgãos individuais em 15 mL de tampão de reação de hialuronidase por 2 h a 37 °C em um tubo cônico de 50 mL em posição plana protegido da luz.
    NOTA: Para preparar o tampão de reação de hialuronidase, dissolva 10 mM de CAPSO; 150 mM de Cloreto de Sódio (NaCl) e 0,05% de NaN3 (ver Tabela de Materiais) em água duplamente destilada e ajuste pH para 10.
  2. Prepare a Solução enzimática misturando 75 μL de 20 mg/mL de estoque de hialuronidase em 425 μL de tampão de reação de hialuronidase. Para preparar 20 mg/mL de estoque de hialuronidase, dissolva a hialuronidase em 50 mM de tampão de carbonato, 150 mM de NaCl, 0,01% de BSA e 0,05% de NaN3 (ver Tabela de Materiais). Ajuste o pH para 10 e aliquot em volumes de 77 μL a -30 °C.
  3. Descarte o tampão de reação de hialuronidase usando uma pipeta e mergulhe o órgão na Solução enzima (500 μL em um tubo cônico de 15 mL) em posição de pé protegida da luz por 24 h a 37 °C com agitação suave (5 x g).
  4. Lave a amostra em 15 mL de tampão de lavagem de hialuronidase em um tubo cônico de 50 mL em posição horizontal protegida da luz por 2h (três vezes) a 37 °C com agitação suave (5 x g).
    1. Para preparar o tampão de lavagem de hialuronidase, dissolva 50 mM de tampão de carbonato, 150 mM de NaCl, 0,1% (v/v) de Triton X-100, 5% (v/v) de Metanol e 0,05% NaN3. Ajuste pH para 10. Para preparar 10x calção carbonato-NaCl, dissolva 2,96 g de Carbonato de Sódio, 1,86 g de Carbonato de Hidrogênio de Sódio e 8,77 g de NaCl em 100 mL de água dupla destilada com 0,05% NaN3 (ver Tabela de Materiais) e ajuste pH para 10.

5. Imunostaining

  1. Rotular vasculatura usando anticorpos anti-α-SMA (alfa-pequeno actin muscular, ver Tabela de Materiais) seguindo os passos abaixo.
    1. Gerar complexo de anticorpos secundários de fragmentos fab primários mais conjugados. Inicie esta reação 1,5 h antes do procedimento de coloração.
      1. Calcule a quantidade necessária de anticorpos primários e secundários (misture a uma razão de 1:0,5 por peso).
        NOTA: Para o anticorpo primário anti-α-SMA, 3,5 μg são necessários para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 2,5 mg/mL, é necessário 3,5/2,5 = 1,4 μL de solução de anticorpos. Para o anticorpo secundário AlexaFluor 647 fragmento fab anti-mouse, 1,75 μg é necessário para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 1,7 mg/mL, é necessário 1,75/1,7 = 1 μL de solução de anticorpos.
      2. Misture anticorpos primários e secundários em um tubo âmbar de 2 mL e incubar por 1,5 h a 37 °C.
    2. Para troca de tampão, misture 7,5 mL de tampão de imunostaining 2x HV1 3D (incluído no kit, veja Tabela de Materiais) com 7,5 mL de água dupla destilada e mergulhe a amostra de tecido por 1,5 h a 32 °C com agitação suave (5 x g) em um tubo cônico de 15 mL em posição horizontal. Inicie essa reação simultaneamente como a geração de anticorpos complexos (1,5 h antes do procedimento de imunossuagem).
  2. Realize a imunostaining 3D seguindo as etapas abaixo.
    1. Em um tubo cônico de 15 mL, prepare a solução de coloração de anticorpos seguindo o Arquivo Suplementar 1.
    2. Colete a amostra de tecido da mídia de troca de buffer (passo 5.1.2) e mergulhe-a na solução de coloração de anticorpos. Incubar tecidos individualmente durante 1 semana a 32 °C com agitação suave (5 x g) dos tubos em posição de pé protegida da luz. Sele o tubo com filme de parafina para evitar a evaporação.
    3. Mova-se para 4 °C e incubar ON em posição de pé.
    4. Cool 1x HV1 3D imunostaining wash buffer (incluído no kit, ver Tabela de Materiais) a 4 °C e lavar a amostra com 15 mL tampão (duas vezes) por 30 min cada a 4 °C com agitação suave (5 x g). Mantenha tubos cônicos de 15 mL em posição horizontal até o passo 5.2.7.
    5. Diluir a formalina para 1% em 1x HV1 3D imunostaining wash buffer e imergir a amostra em 8 mL da solução por 24 h a 4 °C com agitação suave (5 x g).
    6. Incubar em solução fresca de 1% de formalina por 1h a 37 °C com agitação suave (5 x g).
    7. Lave em 15 mL de PBS por 2h a 25 °C com agitação suave (5 x g).
  3. Boost tdTomato sinal usando anticorpos anti-Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) seguindo as etapas abaixo.
    1. Siga os mesmos tempos de incubação e temperaturas da etapa 5.2.2. Calcule a quantidade de anticorpos primários e secundários (ver Tabela de Materiais) e misture-os a uma razão de 1:0,5 por peso.
      NOTA: Para o anticorpo primário anti-RFP, 5 μg é necessário para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 1,25 mg/mL, é necessário 5/1,25 = 4 μL da solução. Para o anticorpo secundário Alexa Fluor 647 fragmento fab anti-coelho, 2,5 μg é necessário para rotular todo o coração ou um fragmento de músculo esquelético de dimensões semelhantes. Para o produto de 1,5 mg/mL, é necessário 2,5/1,5 = 1,7 μL da solução.
    2. Prepare a solução de coloração de anticorpos conforme mencionado no Arquivo Complementar 1.
  4. Aumente os sinais GFP usando nanomá corpos anti-GFP seguindo as etapas abaixo.
    1. Siga os mesmos tempos de incubação e temperaturas mencionados na etapa 5.2.2.
      NOTA: Os nanocorpos anti-GFP (ver Tabela de Materiais) são conjugados com Alexa Fluor 647, de modo que a geração complexa de anticorpos é desnecessária.
    2. Prepare a solução de coloração de anticorpos conforme mencionado no Arquivo Complementar 1.

6. Correspondência ri

  1. Mergulhe órgãos transparentes em 5 mL de solução CUBIC-R+ diluída em água de 50% (ver Tabela de Materiais) em RT (ON) com agitação suave (5 x g) em um tubo cônico de 50 mL. Mantenha os tubos em posição de pé durante toda a etapa de correspondência do RI.
    NOTA: As soluções CCS recicladas de experimentos anteriores podem ser reutilizadas (até quatro vezes) nesta etapa. Para preparar a solução CUBIC-R+, dissolva 45% de 2,3-Dimethyl-1-fenil-5-pyrazolona (Antipirina), 30% de Nicotinamida ou N-Metilnicotinamida, e 0,5% de N-butildiethanolamina em água duplamente destilada ou usar o tampão CUBIC-R+ comercial (ver Tabela de Materiais).
    ATENÇÃO: CUBIC-R+ causa irritação na pele, irritação grave dos olhos e danos aos órgãos. Use luvas de proteção e garanta proteção dos olhos e rostos. Não respire poeira, vapores, gás, névoa ou vapores. Descarte em uma usina de disposição aprovada.
  2. Substitua 50% CUBIC-R+ por 5 mL de 100% CUBIC-R+ e incubar com agitação suave (5 x g) em RT por 2 dias. Em seguida, transfira os tecidos para uma pilha de lenços sem fiapos e gire cuidadosamente os tecidos para remover a solução CUBIC-R+ das superfícies do órgão por 5 minutos.

7. Montagem

  1. Depois de secar os tecidos, transfira-os para 5 mL de Solução de Montagem (RI = 1.520) (ver Tabela de Materiais) em uma placa de cultura celular de seis poços e incuba-os (ON) na RT. Frequentemente gire os tecidos para eliminar bolhas de ar, especialmente nas superfícies dos órgãos.
    NOTA: Os órgãos podem ser armazenados por mais de 6 meses em Solução de Montagem ou CUBIC-R+.
  2. Adere os tecidos ao suporte da amostra de microscópio usando cola de gel à base de cianoacrilato.
  3. Mergulhe as amostras no microscópio de quartzo cuvette preenchido com 120 mL de Solução de Montagem e imagem-as transversalmente ao seu eixo longitudinal. Adere ao coração com o ápice e a aorta alinhada horizontalmente.
    NOTA: Os órgãos limpos e montados podem ser seccionados com um vibratome e imageados em alta ampliação por microscopia confocal. Incorporar os órgãos em 2% de agarose e cortar seções de 100-500 μm. Os órgãos também podem ser seccionados manualmente com uma lâmina afiada para produzir seções de tecido grosso (>1000 μm). Após a secção, coloque as fatias em pratos petri de 35 mm, monte usando a mesma solução de montagem, vedação com esmalte e imagem com um microscópio confocal.

8. Aquisição de imagens

  1. Imagem as amostras montadas com um microscópio de folha de luz (ver Tabela de Materiais). Defina a ampliação e o tamanho do passo entre as fatias individuais até 3 μm, e use lasers de folha de luz direita e esquerda com espessuras de 5 μm e 100% de largura. Ajuste o tempo de exposição constante em 50-100 ms, e ajuste a potência do laser de 10% a 80% dependendo da intensidade do sinal de fluorescência.
    1. Para a co-detecção de parasitas que expressam tdTomato e amastigotes dormentes manchados de DIR (Figura 2C), use canais vermelhos (Ex/Em 561/620-660 nm) e infra-vermelhos (Ex/Em 785/845-55 nm), respectivamente. Para a co-detecção de células T e parasitas que expressam tdTomato no mouse repórter CD8 (Figura 2D), use verde (Ex/Em 488/525-50 nm) e canal vermelho, respectivamente.
    2. Para os ensaios coinfecções (Figura 2E), bem como para a co-detecção de parasitas que expressam GFP em camundongos repórteres de núcleos (Figura 2F), use os canais verde e vermelho, respectivamente. Para a detecção de parasitas que expressam tdTomato, corante nuclear e vasculatura cardíaca (Figura 3B,C), utilize os canais vermelho, verde e vermelho (Ex/Em 640/680-730 nm), respectivamente.
    3. Detecte anticorpos anti-RFP com os nanomutos de canal vermelho e anti-GFP usando o canal verde (Figura 3D).
  2. Converta as pilhas de imagens TIFF adquiridas e reconstrua os órgãos usando o software Imaris v9.7.2 (ver Tabela de Materiais).

9. Reconstrução de superfície e quantificação com software Imaris

  1. Selecione a ferramenta de algoritmo de detecção de superfícies e inicie o assistente no software de análise de imagens.
  2. Realize uma análise inicial em uma região de interesse 3D (selecionada aleatoriamente) e, em seguida, aplique-a a toda a reconstrução de órgãos 3D. Depois de escolher uma região de interesse (ROI), selecione o canal a ser analisado, desmarque o botão liso e selecione subtração de fundo.
    NOTA: A subtração de fundo calcula um valor de fundo local único para cada voxel e subtrai isso do valor original do pixel. O diâmetro da maior esfera que se encaixa no objeto deve ser de até 200 μm para células infectadas por T. cruzi, 10 μm para células T e 5 μm para parasitas individuais.
  3. Use o histograma para ajustar a classificação e a lista de queda do filtro para selecionar as medidas para classificação.
    NOTA: Use o histograma para ajustar a classificação: elíptica (oblado) e medidas de esfericidade são recomendadas.
  4. Finalize o assistente, pressione o botão de estatística e recupere o número total de células infectadas por parasitas ou células T como o número de componentes desconectados por ponto de tempo.

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Resultados

Os tecidos fixos cúbicos foram lavados com PBS para remover fixativos e, em seguida, incubados com coquetéis CUBIC-L, uma solução básica tamponada de aminocos que extraem pigmentos e lipídios do tecido resultando em descoloração do tecido, mantendo a arquitetura tecidual. As linhas de grade no papel podem ser vistas através dos tecidos indicando uma limpeza adequada dos órgãos (Figura 2A). Após a delipidação, os tecidos foram lavados e imersos em CUBIC-R+ e sol...

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Discussão

A ausência de imagens extensas e de órgãos inteiros de parasitas e a resposta imune limita a compreensão da complexidade das interações hospedeiro-parasita e impede a avaliação das terapias para a doença de Chagas. O presente estudo adotou o gasoduto CUBIC para esclarecer e manchar órgãos e tecidos intactos de camundongos infectados por T. cruzi.

Vários protocolos de limpeza de tecidos foram testados neste estudo (PACT32, ECi33

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Etsuo Susaki por sua valiosa ajuda e recomendações sobre protocolos de limpeza de tecidos e imunossuagem. Além disso, somos gratos a M. Kandasamy do CtEGD Biomedical Microscopy Core por suporte técnico usando LSFM e imagem confocal. Agradecemos também a todos os membros do Tarleton Research Group por sugestões úteis ao longo deste estudo.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Referências

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