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요약

본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

초록

샤 가스 병은 주로 라틴 아메리카에서 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 무시 된 병리학입니다. 샤가스병 치료제인 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)는 인간을 포함한 여러 포유류 종을 감염시켜 심장 및 소화기 병리를 유발하는 다양한 생물학을 가진 절대 세포 내 기생충입니다. 샤가스병의 복잡한 생물학을 이해하고 치료 요법의 결과를 정확하게 평가하기 위해서는 T. cruzi in vivo 감염의 신뢰할 수 있는 검출이 오랫동안 요구되어 왔습니다. 현재 프로토콜은 3D 재구성 및 제거 된 장기에서 T. cruzi 감염 세포의 자동 정량화를위한 통합 파이프 라인을 보여줍니다. 라이트 시트 형광 현미경을 사용하면 전체 장기 또는 조직에서 활발하게 증식하고 휴면 상태인 T. cruzi 기생충과 면역 이펙터 세포를 정확하게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 또한 항체 및 핵 염색으로 제거 된 장기의 균일 한 표지를 얻기위한 CUBIC-HistoVision 파이프 라인이 성공적으로 채택되었습니다. 3D 면역염색과 결합된 조직 투명화는 약물 치료 프로토콜을 종합적으로 평가하고 T. cruzi 감염 조직의 세포 조직에 대한 이해를 향상시키는 편견 없는 접근 방식을 제공하며 샤가스병의 항-T. 크루즈 면역 반응, 조직 손상 및 복구와 관련된 발견을 발전시킬 것으로 기대됩니다.

서문

원생동물 기생충 T. cruzi에 의해 발생하는 샤가스병은 세계에서 가장 방치된 열대성 질병 중 하나이며 연간 약 13,000명이 사망합니다. 감염은 종종 부정맥, 심부전 및 갑작스런 사망을 포함하여 환자의 30 %에서 심장 병리를 일으키는 급성에서 만성 단계로 진행됩니다 1,2. 급성기 동안 기생충에 대해 유도 된 강력한 숙주 면역 반응에도 불구하고, 적은 수의 기생충이 심장 및 골격근과 같은 조직에서 숙주의 평생 동안 만성적으로 지속됩니다. 적응 면역 반응의 지연된 발병 및 비 복제 형태의 기생충의 존재를 포함한 몇 가지 요인은 면역계 3,4,5,6에 의한 완전한 제거를 피하기 위해 T. cruzi의 능력에 기여할 수 있습니다. 또한, 복제되지 않는 휴면 형태의 기생충은 트리파노시드 약물에 대한 낮은 감수성을 나타내며 많은 경우 7,8에서 관찰되는 치료 실패의 원인이 될 수 있습니다.

새로운 이미징 기술의 개발은 감염된 조직에서 기생충의 공간적 분포와 통제에 관여하는 면역 세포와의 관계에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 특성은 면역 체계에 의한 기생충 제어 과정을 더 잘 이해하고 만성 조직에 존재하는 희귀 휴면 기생충을 추적하는 데 중요합니다.

라이트 시트 형광 현미경(LSFM)은 얇은 절편 없이 큰 조직 또는 장기의 3D 이미징을 위한 가장 포괄적이고 편견 없는 방법 중 하나입니다. 라이트 시트 현미경은 얇은 빛의 시트를 사용하여 초점면의 형광단만 여기시키고, 샘플의 광퇴색 및 광독성을 줄이며, 초고속 카메라를 사용하여 수천 개의 조직층의 이미지를 기록합니다. 조직에서 레이저 광의 적절한 침투에 필요한 높은 수준의 조직 투명성은 조직 지질 화 및 탈색 후 굴절률 (RI)을 균질화하여 얻어지며, 이는 빛의 산란을 줄이고 고품질 이미지를 렌더링합니다 9,10,11.

조직 투명화 접근법은 전체 마우스12,13,14, 오가노이드15,16,17, 리포터 형광 마커를 발현하는 기관 18,19,20,21,22,23, 및 최근에는 제한된 수의 인간 조직(24)의 이미징을 위해 개발되었습니다. . 조직 청소를 위한 현재의 방법은 세 가지 제품군으로 분류됩니다: (1) DISCO 프로토콜25,26과 같은 유기 용매 기반 방법, (2) CLARITY 27과 같은 하이드로겔 기반 방법 및 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 이미징 칵테일 및 전산 분석)18,19,28,29와 같은 수성 방법 . CUBIC 프로토콜은 장기 모양과 조직 무결성을 유지하여 내인성으로 발현된 리포터 단백질의 형광을 보존합니다. 이 기술의 가장 최근의 업데이트인 CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV)은 또한 형광-표지된 항체 및 DNA 표지28을 사용하여 에피토프의 검출을 허용한다.

본 프로토콜에서, 정제된 무손상 마우스 조직에서 형광 단백질을 발현하는 T. cruzi 를 검출하기 위한 CUBIC 파이프라인을 사용하였다. 광학적으로 투명한 조직을 LSFM 이미지화하고 3D로 재구성했으며 장기 당 T. cruzi 감염 세포, 휴면 무명 및 T 세포의 정확한 총 수를 자동으로 정량화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 항체 및 핵 얼룩이 있는 투명화된 장기의 균일한 표지를 얻기 위해 성공적으로 채택되었습니다. 이러한 접근법은 감염된 숙주에서 T. cruzi 의 확장 및 제어를 이해하는 데 필수적이며 샤 가스 병에 대한 화학 및 면역 치료제를 완전히 평가하는 데 유용합니다.

프로토콜

이 연구는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 실험실 동물 관리 인증 지침의 평가 및 인증 협회에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 동물 사용 프로토콜(마우스의 T. cruzi 감염 통제-A2021 04-011-Y1-A0)은 조지아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 나6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 및 C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 마우스(암컷,1-2개월)를 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다(재료 표 참조).

1. 감염, 관류 및 해부

  1. 각각 tdTomato 또는 GFP 형광 단백질을 발현하는 콜롬비아나(DTU TcI) 또는 브라질(DTU TcV) T. 크루지 균주의 조직 배양 유래 트리포마스티고테로 마우스를 복강 내 감염시킵니다. 감염 용량은 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) 100μL에 희석 된 50,000에서 200,000 트리포 마스 티고 테의 범위 일 수 있습니다.
    참고: 리포터 기생충 생성 및 마우스 감염 모델에 대한 구체적인 세부 정보는 Canavaci et al. 29 및 부스타만테 외.30.
  2. 3-7 L/min의 유속으로 이산화탄소 흡입에 의해 마우스를 안락사시킨다. 동물이 페달 반사를 보이지 않 자마자 복부에서 흉골쪽으로 피부를 통해 세로 절개를하십시오. 그런 다음 복부에서 체벽을 자르고 흉골을 들어 올려 심장을 노출시킬 때까지 흉부 양쪽의 갈비뼈를 통해 계속하십시오.
  3. 그림 1에 설명된 대로 심장의 오른쪽 귀에 2.5mm 절개를 하고 1mL 마이크로피펫 팁을 사용하여 배수 혈액을 수집합니다.
  4. 나비 바늘 (관류 시스템의 한쪽 끝에 연결됨)이 오름차순 대동맥에 도달 할 때까지 좌심실의 정점에 삽입하십시오. 젤 기반 접착제 ( 재료 표 참조)를 사용하여 바늘 주위의 입구 구멍을 밀봉하고 관류 중에 바늘을 제자리에 유지하십시오.
  5. 마우스30 을 차가운 헤파린-PBS 50mL(헤파린 pH 7.4, 10U/mL)로 관류하거나 마우스에서 수집 트레이를 향해 나오는 액체에 혈액이 없어질 때까지 관류합니다.
  6. PBS에서 50mL의 차가운 4%(w/v) 파라포름알데히드(PFA)(pH 7.4)와 관류합니다.
    참고: PFA 조직 고정은 특히 에피토프 구조 및 후속 면역검출을 유지하기 위한 프로토콜의 중요한 단계 중 하나일 가능성이 높습니다. PFA는 시간이 지남에 따라 분해되므로 새로 준비해야합니다. 용액의 pH는 또한 조직의 불량한 청소로 이어질 수있는 과도한 고정을 피하기 위해 중요합니다.
    주의: PFA는 피부 접촉에 의해 중간 정도의 독성이 있습니다. 급성 노출은 또한 코, 눈, 목에 매우 자극적입니다. 공기 또는 피부의 낮은 수준에 장기간 노출되면 피부염 및 가려움증과 같은 피부 자극과 천식과 유사한 호흡기 문제가 발생할 수 있습니다. 얼굴과 눈 보호구를 착용하고 먼지, 가스, 미스트, 연기 또는 증기를 흡입하지 마십시오.
    1. PFA 관류 후 100mL의 CUBIC-P 완충액으로 마우스를 관류하여 1.5단계에서 언급한 정화 수준에 도달합니다.
    2. CUBIC-P 완충액을 준비하려면 이중 증류수에 10 % N- 부틸 디 에탄올 아민, 5 % 트리톤 X-100 및 5 % 1-N- 메틸이 미다 졸을 용해 시키거나 상업용 칵테일을 사용하십시오 ( 재료 표 참조).
      참고: 단계 1.6.1.-1.6.2. 심장 및 신장과 같이 색소가 많은 장기에만 권장되는데, 이는 투명성을 높이기 위해 사전 제거 단계가 필요하기 때문입니다. CUBIC-P를 사용한 후 장기를 해부하고 2단계: 조직 청소로 바로 진행합니다.
  7. 이미징할 조직 샘플/장기30 개를 해부하고 50mL 원뿔형 튜브에서 부드럽게 흔들면서(5 x g 이하) 4°C에서 밤새 PBS(~10mL/전체 장기)에서 4%(w/v) PFA로 사후 고정합니다.
    알림: 이후의 모든 배양은 빛으로부터 보호되는 20-30 ° C에서 수평으로 놓인 튜브에서 수행해야합니다.
  8. 샘플을 10mL의 PBS(0.05% 아지드화나트륨(NaN 3)가 보충됨)에서 3시간(3회) 동안 부드럽게 흔들어(5 x g)하여 세척합니다.
    참고: 조직은 50mL 원뿔형 튜브에서 4°C에서 부드럽게 흔들어(5 x g) PBS의 30% 자당 10mL에 배양하여 냉동할 수 있습니다. 조직이 튜브 바닥으로 가라앉은 후 OCT 화합물에 삽입하고 -80°C에서 유지합니다. OCT 화합물이 완전히 녹을 때까지 RT에서 해동 한 다음 10mL 원추형 튜브에서 부드럽게 흔들어 (5 x g) 4 ° C에서 PBS (~ 50mL / 전체 장기)로 세척합니다. 2단계로 진행합니다.

2. 조직 청소

참고: 이 작업에서 수행된 모든 조직 청소는 CUBIC 프로토콜 I22를 사용하여 수행되었습니다. 관류 중 지질 및 신속한 탈색을 위한 CUBIC-P, 지질 및 탈색을 위한 CUBIC-L, RI 매칭을 위한 CUBIC-R의 세 가지 칵테일이 사용되었습니다. DNA 염색 및 면역염색은 각각 CUBIC-HV1 3D 핵염색 키트 및 CUBIC-HV1 3D 면역염색 키트를 사용하여 수행하였다( 재료 표 참조).

  1. 50mL 원뿔형 튜브의 RT(ON)에서 부드럽게 흔들어(5 x g) 하여 50% 물로 희석한 CUBIC-L(재료 표 참조) 10mL에 개별 장기를 담그십시오. 튜브를 흔들리는 판에 평평하게 유지하십시오.
    알림: 조직 손상을 방지하기 위해 장기는 동일한 튜브에 유지되고 용액은 진공 시스템을 사용하여 수집됩니다. CUBIC-L을 준비하려면 상업용 칵테일을 사용하여 이중 증류수에 10 % N- 부틸 디 에탄올 아민과 10 % Triton X-100을 녹입니다 ( 재료 표 참조).
    주의: CUBIC-L은 눈에 심각한 손상을 일으킵니다. 눈과 얼굴 보호구를 착용하십시오. 승인된 폐기물 처리장에 폐기하십시오.
  2. 샘플을 100% CUBIC-L 10mL에 6일 동안 담그십시오(3일째에 용액 새로 고침).
    알림: 이 잠복기가 끝나면 조직은 거의 완전히 투명해야 합니다.
  3. 투명한 장기를 PBS(0.05%NaN3 보충)로 37°C에서 2시간(3회) 동안 부드럽게 흔들어(5 x g) 세척합니다. 세척할 때마다 조직을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮겨 Triton X-100을 제거합니다.
    참고: 도 2B에 기술된 바와 같이, 실험의 목적이 형질전환 T. cruzi 기생충 또는 마우스로부터 내인성으로 발현된 리포터 단백질을 시각화하는 것이라면(도 2C-F), 단계 3, 4 및 5단계를 건너뛰고 바로 단계 6으로 계속한다.

3. DNA 염색

  1. 시판되는 핵산 염료( 재료 표 참조)를 5mL의 염색 완충액(키트에 포함됨)에 1/2,500 희석으로 희석합니다.
  2. 조직을 핵 염료 용액에 담그고 서 있는 위치에서 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 5일 동안 부드럽게 회전하면서 37°C에서 배양합니다.
  3. RT에서 15mL의 3D 핵 염색 세척 완충액(키트에 포함됨)으로 2시간(3회) 동안 부드럽게 흔들어줍니다(5 x g).
    참고: 다른 DNA 염료는 이러한 농도 및 배양 시간에 사용될 수 있습니다: DAPI (키트에 포함): 1/200, 5일 배양; BOBO-1 : 1/400, 5 일 배양; 요오드화프로피듐(PI)(키트에 포함): 1/100, 3일 배양; RedDot2: 1/250, 3일 배양. 실험의 특정 목적이 내인성으로 발현된 리포터 단백질을 모두 시각화하고 핵 염색을 사용하는 것이라면 4단계와 5단계를 건너뛰고 6단계로 바로 진행합니다.

4. 세포외 기질(ECM) 소화

참고: ECM의 히알루로니다제 소화는 항체가 조직28의 깊은 영역으로 적절하게 침투하는 것을 촉진하기 위해 수행되어야 합니다.

  1. 빛으로부터 보호되는 평평한 위치의 50mL 원뿔형 튜브에 37°C에서 2시간 동안 히알루로니다제 반응 완충액 15mL에 개별 장기를 담급니다.
    참고: 히알루로니다제 반응 완충액을 준비하려면 10mM의 CAPSO를 용해하십시오. 이중 증류수에서 150mM의 염화나트륨 (NaCl) 및 0.05 %의 NaN3 ( 재료 표 참조)를 넣고 pH를 10으로 조정하십시오.
  2. 히알루로니다제 반응 완충액 425μL에 히알루로니다아제 스톡 20mg/mL 75μL를 혼합하여 효소 용액을 준비합니다. 20mg/mL의 히알루로니다아제 스톡을 준비하려면 50mM의 탄산염 완충액, 150mM의 NaCl, 0.01%의 BSA 및 0.05%의NaN3 에 히알루로니다아제를 용해시킵니다( 재료 표 참조). pH를 10으로 조정하고 -30 °C에서 77 μL의 부피로 분취량을 조정합니다.
  3. 피펫을 사용하여 히알루로니다제 반응 완충액을 버리고 37°C에서 24시간 동안 빛으로부터 보호되는 서 있는 위치에서 효소 용액(15mL 원뿔형 튜브에 500μL)에 장기를 담그고 부드럽게 흔들어줍니다(5 x g).
  4. 50mL 원뿔형 튜브에 있는 히알루로니다제 세척 완충액 15mL에 샘플을 37°C에서 2시간(3회) 동안 빛으로부터 보호되는 수평 위치에서 부드럽게 흔들면서(5 x g) 세척합니다.
    1. 히알루로니다제 세척 완충액을 준비하려면 50mM의 탄산염 완충액, 150mM의 NaCl, 0.1%(v/v)의 트리톤 X-100, 5%(v/v)의 메탄올 및 0.05%의NaN3을 용해합니다. pH를 10으로 조정합니다. 10x 탄산염 완충액-NaCl 스톡을 제조하기 위해 2.96g의 탄산나트륨, 1.86g의 탄산수소나트륨 및 8.77g의 NaCl을 0.05%NaN3 ( 재료 표 참조)과 함께 이중 증류수 100mL에 용해시키고 pH를 10으로 조정합니다.

5. 면역 염색

  1. 아래 단계에 따라 항-α-SMA(알파-소근육 액틴, 재료 표 참조) 항체를 사용하여 혈관구조에 라벨을 붙입니다.
    1. 1차 및 접합된 Fab 단편 2차 항체 복합체를 생성한다. 염색 절차 1.5 시간 전에이 반응을 시작하십시오.
      1. 1 차 및 2 차 항체의 필요한 양을 계산하십시오 (1 : 0.5 중량 비율로 혼합).
        참고: 1차 항체 항-α-SMA의 경우 심장 전체 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하려면 3.5μg이 필요합니다. 2.5 mg/mL 제품의 경우 3.5/2.5 = 1.4 μL의 항체 용액이 필요합니다. 2차 항체 AlexaFluor 647 항-마우스 Fab 단편의 경우, 전체 심장 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하기 위해 1.75μg이 필요하다. 1.7 mg/mL 제품의 경우 1.75/1.7 = 1 μL의 항체 용액이 필요합니다.
      2. 호박색 2mL 튜브에 1차 항체와 2차 항체를 혼합하고 37°C에서 1.5시간 동안 배양합니다.
    2. 완충액 교환을 위해 7.5mL의 2x HV1 3D 면역염색 완충액(키트에 포함, 재료 표 참조)을 7.5mL의 이중 증류수와 혼합하고 조직 샘플을 수평 위치의 15mL 원뿔형 튜브에 부드럽게 흔들어(5 x g) 32°C에서 1.5시간 동안 담근다. 항체 복합체의 생성과 동시에 이 반응을 시작한다(면역염색 절차 1.5시간 전).
  2. 아래 단계에 따라 3D 면역염색을 수행합니다.
    1. 15mL 원뿔형 튜브에서 보충 파일 1에 따라 항체 염색 용액을 준비합니다.
    2. 완충액 교환 배지로부터 조직 샘플을 수집하고(단계 5.1.2) 항체 염색 용액에 침지시킨다. 빛으로부터 보호되는 서 있는 위치에서 튜브를 부드럽게 흔들면서(5 x g) 32°C에서 1주일 동안 개별적으로 조직을 배양합니다. 증발을 피하기 위해 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하십시오.
    3. 4°C로 이동하고 서 있는 자세에서 ON을 배양합니다.
    4. 1x HV1 3D 면역염색 세척 완충액(키트에 포함, 재료 표 참조)을 4°C로 냉각하고 샘플을 15mL 완충액(2회)으로 4°C에서 각각 30분 동안 부드럽게 흔들어(5 x g)하여 세척합니다. 15 단계까지 5.2.7mL 원추형 튜브를 수평 위치에 유지하십시오.
    5. 포르말린을 1x HV1 3D 면역염색 세척 완충액 중 1%로 희석하고, 샘플을 용액 8mL에 4°C에서 24시간 동안 부드럽게 흔들면서 침지시킨다(5 x g).
    6. 신선한 1% 포르말린 용액에서 37°C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다(5 x g).
    7. 15mL의 PBS에서 25°C에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다(5 x g).
  3. 아래 단계에 따라 항 적색 형광 단백질 (RFP) 항체를 사용하여 tdTomato 신호를 증폭하십시오.
    1. 5.2.2단계와 동일한 배양 시간과 온도를 따릅니다. 1차 및 2차 항체의 양을 계산하고( 재료 표 참조) 1:0.5 중량비로 혼합합니다.
      참고: 1차 항체 항-RFP의 경우 심장 전체 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하려면 5μg이 필요합니다. 1.25 mg/mL 제품의 경우 5/1.25 = 4 μL의 용액이 필요합니다. 2차 항체 Alexa Fluor 647 항-토끼 Fab 단편의 경우, 전체 심장 또는 유사한 치수의 골격근 단편을 표지하기 위해 2.5μg이 필요하다. 1.5 mg/mL 제품의 경우 2.5/1.5 = 1.7 μL의 용액이 필요합니다.
    2. 보충 파일 1에 언급된 대로 항체 염색 용액을 준비합니다.
  4. 아래 단계에 따라 항 GFP 나노바디를 사용하여 GFP 신호를 증폭합니다.
    1. 5.2.2단계에서 언급한 것과 동일한 배양 시간과 온도를 따릅니다.
      참고: 항-GFP 나노바디( 재료 표 참조)는 Alexa Fluor 647과 접합되므로 항체 복합체 생성이 필요하지 않습니다.
    2. 보충 파일 1에 언급된 대로 항체 염색 용액을 준비합니다.

6. RI 매칭

  1. 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 RT(ON)에서 50% 물로 희석한 CUBIC-R+ 용액( 재료 표 참조) 5mL에 투명 장기를 담그고 부드럽게 흔들어줍니다(5 x g). 전체 RI 매칭 단계 동안 튜브를 서 있는 위치에 두십시오.
    알림: 이전 실험의 재활용 CUBIC R+ 용액은 이 단계에서 재사용할 수 있습니다(최대 4회). CUBIC-R+ 용액을 준비하려면 이중 증류수에 2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론(안티피린) 45%, 니코틴아미드 또는 N-메틸니코틴아미드 30%, N-부틸디에탄올아민 0.5%를 용해하거나 상용 CUBIC-R+ 완충액을 사용합니다( 재료 표 참조).
    주의: CUBIC-R+는 피부 자극, 심한 눈 자극 및 장기 손상을 유발합니다. 보호 장갑을 착용하고 눈과 얼굴을 보호하십시오. 먼지, 연기, 가스, 미스트 또는 증기를 흡입하지 마십시오. 승인된 폐기물 처리장에 폐기하십시오.
  2. 50% CUBIC-R+를 100% CUBIC-R+ 5mL로 교체하고 RT에서 2일 동안 부드럽게 흔들어(5 x g) 배양합니다. 그런 다음 보풀이 없는 물티슈 더미에 티슈를 옮기고 조심스럽게 티슈를 돌려 장기 표면에서 CUBIC-R+ 용액을 5분 동안 제거합니다.

7. 장착

  1. 조직을 건조시킨 후 6웰 세포 배양 플레이트에 5mL의 장착 용액(RI = 1.520)( 재료 표 참조)으로 옮기고 RT에서 배양(ON)합니다. 특히 장기 표면의 기포를 제거하기 위해 조직을 자주 돌립니다.
    알림: 장기는 장착 용액 또는 CUBIC-R+에 6개월 이상 보관할 수 있습니다.
  2. 시아노아크릴레이트계 겔 접착제를 사용하여 조직을 현미경 샘플 홀더에 부착합니다.
  3. 120mL의 마운팅 용액으로 채워진 현미경 석영 큐벳에 샘플을 담그고 세로 축에 가로로 이미지를 만듭니다. 정점과 대동맥이 수평으로 정렬 된 상태에서 심장을 부착하십시오.
    참고: 투명하고 장착된 장기는 비브라톰으로 절단하고 컨포칼 현미경으로 고배율로 이미지화할 수 있습니다. 장기를 2 % 아가 로스에 넣고 100-500 μm의 절편을 자릅니다. 날카로운 칼날로 장기를 수동으로 절단하여 두꺼운 조직 절편(>1000μm)을 생성할 수도 있습니다. 절단 후 슬라이스를 유리 바닥 35mm 페트리 접시에 넣고 동일한 장착 용액을 사용하여 장착하고 매니큐어로 밀봉하고 컨포칼 현미경으로 이미지를 만듭니다.

8. 이미지 획득

  1. 라이트 시트 현미경으로 장착된 샘플을 이미지화합니다( 재료 표 참조). 개별 슬라이스 사이의 배율 및 스텝 크기를 3μm로 설정하고 두께가 5μm이고 너비가 100%인 좌우 라이트 시트 레이저를 사용합니다. 노출 시간 상수를 50-100ms로 설정하고 형광 신호 강도에 따라 레이저 출력을 10%에서 80%까지 조정합니다.
    1. td토마토 발현 기생충과 DiR 염색 휴면 무식증(그림 2C)의 공동 검출을 위해 각각 빨간색(Ex/Em 561/620-660nm) 및 적외선(Ex/Em 785/845-55nm) 채널을 사용합니다. CD8 리포터 마우스에서 T 세포 및 td토마토 발현 기생충의 공동 검출을 위해(그림 2D), 각각 녹색(Ex/Em 488/525-50 nm) 및 적색 채널을 사용하십시오.
    2. 공동 감염 분석(그림 2E)과 핵 리포터 마우스(그림 2F)에서 GFP를 발현하는 기생충의 공동 검출을 위해 각각 녹색 및 빨간색 채널을 사용합니다. td토마토 발현 기생충, 핵염료 및 심장 혈관구조(그림 3B,C)를 검출하려면 각각 적색, 녹색 및 원적색(Ex/Em 640/680-730nm) 채널을 사용하십시오.
    3. 원적색 채널이 있는 항-RFP 항체와 녹색 채널을 사용하여 항-GFP 나노바디를 검출합니다(그림 3D).
  2. 획득한 TIFF 이미지 스택을 변환하고 Imaris v9.7.2 소프트웨어를 사용하여 장기를 3D 재구성합니다( 재료 표 참조).

9. Imaris 소프트웨어를 사용한 표면 재구성 및 정량화

  1. 표면 감지 알고리즘 도구를 선택하고 이미지 분석 소프트웨어에서 마법사를 시작합니다.
  2. 관심 있는 3D 영역(무작위로 선택)에서 초기 분석을 수행한 다음 전체 3D 장기 재구성에 적용합니다. 관심 영역(ROI)을 선택한 후 분석할 채널을 선택하고 부드럽게 버튼을 선택 취소한 다음 배경 빼기를 선택합니다.
    참고: 배경 빼기는 모든 복셀에 대해 고유한 로컬 배경 값을 계산하고 원래 픽셀 값에서 뺍니다. 물체에 맞는 가장 큰 구의 직경은 T. cruzi 감염 세포의 경우 최대 200μm, T 세포의 경우 10μm, 개별 기생충의 경우 5μm여야 합니다.
  3. 히스토그램을 사용하여 분류를 조정하고 필터 드롭다운 목록을 사용하여 분류할 측정값을 선택합니다.
    참고: 히스토그램을 사용하여 분류를 조정합니다: 타원도(편평한) 및 구형도 측정이 권장됩니다.
  4. 마법사를 완료하고 통계 버튼을 누른 다음 기생충에 감염된 세포 또는 T 세포의 총 수를 시점 당 분리 된 구성 요소 수로 검색합니다.

결과

CUBIC 고정 조직을 PBS로 세척하여 고정액을 제거한 다음 조직에서 색소와 지질을 추출하는 아미노 알코올의 기본 완충 용액인 CUBIC-L 칵테일과 함께 배양하여 조직 구조를 유지하면서 조직을 탈색시켰습니다. 종이의 격자 선은 장기의 적절한 청소를 나타내는 조직을 통해 볼 수 있습니다 (그림 2A). 탈지화 후, 조직을 세척하고, RI 균질화 및 이미징을 위한 CUBIC-R+ 및...

토론

기생충과 면역 반응에 대한 광범위한 전체 장기 영상의 부재는 숙주-기생충 상호 작용의 복잡성에 대한 이해를 제한하고 샤가스병에 대한 치료법의 평가를 방해합니다. 본 연구는 T. cruzi에 감염된 마우스의 손상되지 않은 장기와 조직을 명확히하고 염색하기 위해 CUBIC 파이프 라인을 채택했습니다.

이 연구에서 여러 조직 투명화 프로토콜이 테스트되었습니다 (PACT

공개

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

조직 투명화 및 면역염색 프로토콜에 관한 귀중한 도움과 권장 사항에 대해 Etsuo Susaki 박사에게 감사드립니다. 또한 LSFM 및 컨포칼 이미징을 사용한 기술 지원에 대해 CTEGD Biomedical Microscopy Core의 M. Kandasamy에게 감사드립니다. 또한이 연구 전반에 걸쳐 유용한 제안을 해주신 Tarleton Research Group의 모든 구성원에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

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