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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit la microscopie fluorescente à feuille de lumière et les méthodes automatisées assistées par logiciel pour visualiser et quantifier avec précision la prolifération et la dormance des parasites Trypanosoma cruzi et des lymphocytes T dans des organes et des tissus intacts et nettoyés. Ces techniques fournissent un moyen fiable d’évaluer les résultats du traitement et offrent de nouvelles perspectives sur les interactions parasite-hôte.

Résumé

La maladie de Chagas est une pathologie négligée qui touche des millions de personnes dans le monde, principalement en Amérique latine. L’agent de la maladie de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), est un parasite intracellulaire obligatoire avec une biologie diversifiée qui infecte plusieurs espèces de mammifères, y compris les humains, provoquant des pathologies cardiaques et digestives. Une détection fiable des infections in vivo à T. cruzi est nécessaire depuis longtemps pour comprendre la biologie complexe de la maladie de Chagas et évaluer avec précision les résultats des schémas thérapeutiques. Le protocole actuel démontre un pipeline intégré pour la quantification automatisée des cellules infectées par T. cruzi dans des organes reconstruits en 3D. La microscopie fluorescente à feuille de lumière permet de visualiser et de quantifier avec précision les parasites T. cruzi proliférants et dormants et les cellules effectrices immunitaires dans des organes ou des tissus entiers. En outre, le pipeline CUBIC-HistoVision pour obtenir un marquage uniforme des organes dégagés avec des anticorps et des colorations nucléaires a été adopté avec succès. Le nettoyage des tissus, associé à l’immunomarquage 3D, fournit une approche impartiale pour évaluer de manière exhaustive les protocoles de traitement médicamenteux, améliorer la compréhension de l’organisation cellulaire des tissus infectés par T. cruzi et devrait faire progresser les découvertes liées aux réponses immunitaires anti-T. cruzi , aux lésions tissulaires et à la réparation dans la maladie de Chagas.

Introduction

La maladie de Chagas, causée par le parasite protozoaire T. cruzi, est l’une des maladies tropicales les plus négligées au monde, causant environ 13 000 décès annuels. L’infection progresse souvent d’un stade aigu à un stade chronique produisant une pathologie cardiaque chez 30% des patients, y compris des arythmies, une insuffisance cardiaque et une mort subite 1,2. Malgré la forte réponse immunitaire de l’hôte provoquée contre le parasite pendant la phase aiguë, un faible nombre de parasites persiste de façon chronique tout au long de la vie de l’hôte dans des tissus tels que le cœur et les muscles squelettiques. Plusieurs facteurs, dont l’apparition tardive de réponses immunitaires adaptatives et la présence de formes non réplicatives du parasite, peuvent contribuer à la capacité de T. cruzi d’éviter une élimination complète par le système immunitaire 3,4,5,6. De plus, les formes dormantes non réplicatives du parasite présentent une faible sensibilité aux médicaments trypanocides et peuvent en partie être responsables de l’échec du traitement observé dans de nombreux cas 7,8.

Le développement de nouvelles techniques d’imagerie permet de mieux comprendre la distribution spatiale des parasites dans les tissus infectés et leur relation avec les cellules immunitaires impliquées dans leur contrôle. Ces caractéristiques sont cruciales pour une meilleure compréhension des processus de contrôle des parasites par le système immunitaire et le suivi des rares parasites dormants présents dans les tissus chroniques.

La microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) est l’une des méthodes les plus complètes et les plus impartiales pour l’imagerie 3D de grands tissus ou organes sans coupe mince. Les microscopes à feuille de lumière utilisent une fine feuille de lumière pour exciter uniquement les fluorophores dans le plan focal, réduire le photoblanchiment et la phototoxicité des échantillons et enregistrer des images de milliers de couches tissulaires à l’aide de caméras ultra-rapides. Le haut niveau de transparence tissulaire nécessaire à la bonne pénétration de la lumière laser dans les tissus est obtenu en homogénéisant l’indice de réfraction (IR) suite à la délipidation et à la décoloration des tissus, ce qui réduit la diffusion de la lumière et rend des images de haute qualité 9,10,11.

Des approches de nettoyage tissulaire ont été développées pour l’imagerie de souris entières 12,13,14, d’organoïdes 15,16,17, d’organes exprimant des marqueurs fluorescents rapporteurs 18,19,20,21,22,23 et, récemment, d’un nombre limité de tissus humains 24 . Les méthodes actuelles de nettoyage tissulaire sont classées en trois familles : (1) les méthodes à base de solvants organiques telles que les protocoles DISCO 25,26, (2) les méthodes à base d’hydrogel, telles que CLARITY27, et les méthodes aqueuses, telles que CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Les protocoles CUBIC maintiennent la forme des organes et l’intégrité des tissus, préservant la fluorescence des protéines rapporteures exprimées de manière endogène. La mise à jour la plus récente de cette technique, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), permet également la détection d’épitopes à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence et de marquage ADN28.

Dans le présent protocole, le pipeline CUBIC pour détecter T. cruzi exprimant des protéines fluorescentes dans des tissus de souris intacts clarifiés a été utilisé. Des tissus optiquement transparents ont été imagés LSFM, reconstruits en 3D et le nombre total précis de cellules infectées par T. cruzi , d’amastigotes dormants et de cellules T par organe a été automatiquement quantifié. En outre, ce protocole a été adopté avec succès pour obtenir un marquage uniforme des organes nettoyés avec des anticorps et des colorations nucléaires. Ces approches sont essentielles pour comprendre l’expansion et le contrôle de T. cruzi chez les hôtes infectés et sont utiles pour évaluer pleinement les chimiothérapies et immunothérapeutiques pour la maladie de Chagas.

Protocole

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les lignes directrices d’accréditation de la Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals et de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Le protocole d’utilisation des animaux (contrôle de l’infection à T. cruzi chez la souris-A2021 04-011-Y1-A0) a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J et C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J (femelles, âgées de 1 à 2 mois) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Infection, perfusion et dissection

  1. Infecter par voie intrapéritonéale des souris avec des trypomastigotes dérivés de cultures tissulaires de Colombiana (DTU TcI) ou du Brésil (DTU TcV) souche T. cruzi exprimant des protéines fluorescentes tdTomato ou GFP, respectivement. La dose d’infection pourrait varier de 50 000 à 200 000 trypomastigotes dilués dans 100 μL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    REMARQUE : Des détails précis sur la génération de parasites rapporteurs et des modèles murins d’infection sont disponibles dans Canavaci et al. 29 et Bustamante et coll.30.
  2. Euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone à un débit de 3-7 L/min. Dès que les animaux cessent de montrer un réflexe de pédale, faites une incision longitudinale à travers la peau de l’abdomen vers le sternum. Ensuite, coupez la paroi du corps de l’abdomen et continuez à travers les côtes de chaque côté du thorax jusqu’à ce que le sternum puisse être soulevé, exposant le cœur.
  3. Comme décrit à la figure 1, faites une incision de 2,5 mm dans l’oreillette droite du cœur et recueillez le sang drainant à l’aide d’un embout de micropipette de 1 mL.
  4. Insérez une aiguille papillon (reliée à une extrémité du système de perfusion) dans l’apex du ventricule gauche jusqu’à ce qu’il atteigne l’aorte ascendante. Utilisez de la colle à base de gel (voir le tableau des matériaux) pour sceller le trou d’entrée autour de l’aiguille et maintenir l’aiguille en position pendant les perfusions.
  5. Perfuser les souris 30 avec 50 mL d’héparine-PBS froid (pH 7,4,10 U/mL d’héparine) ou jusqu’à ce que le liquide qui sort de la souris vers le plateau de collecte soit exempt de sang.
  6. Perfuser avec 50 mL de paraformaldéhyde (PFA) froid à 4 % (p/v) (pH 7,4) dans du PBS.
    REMARQUE: La fixation tissulaire PFA est probablement l’une des étapes critiques du protocole, en particulier pour le maintien des structures épitopiques et la détection immunologique ultérieure. Le PFA se dégrade avec le temps, il doit donc être fraîchement préparé. Le pH de la solution est également important pour éviter une fixation excessive, qui pourrait entraîner une mauvaise élimination des tissus.
    ATTENTION : Le PFA est modérément toxique par contact cutané. L’exposition aiguë est également très irritante pour le nez, les yeux et la gorge. L’exposition à long terme à de faibles concentrations dans l’air ou la peau peut causer une irritation de la peau comme une dermatite et des démangeaisons, ainsi que des problèmes respiratoires semblables à ceux de l’asthme. Portez une protection faciale et oculaire et ne respirez pas de poussière, de gaz, de brouillard, de fumées ou de vapeurs.
    1. Après la perfusion PFA, perfuser la souris avec 100 mL de tampon CUBIC-P pour atteindre les niveaux de clarification mentionnés à l’étape 1.5.
    2. Pour préparer le tampon CUBIC-P, dissoudre 10 % de N-butyldiéthanolamine, 5 % de Triton X-100 et 5 % de 1-N-méthylimidazole dans de l’eau bidistillée ou utiliser les cocktails commerciaux (voir le tableau des matières).
      NOTA : Étapes 1.6.1.-1.6.2. ne sont recommandés que pour les organes très pigmentés tels que le cœur et les reins, car ils nécessitent une étape de pré-nettoyage pour obtenir des niveaux accrus de transparence. Après avoir utilisé CUBIC-P, disséquez les organes et passez directement à l’étape 2 : Nettoyage des tissus.
  7. Disséquer les échantillons de tissus/organes 30 à imager et les post-fixer dans 4 % (p/v) PFA dans PBS (~10 mL/organe entier) pendant la nuit (ON) à 4 °C en secouant doucement (pas plus de 5 x g) dans des tubes coniques de50 mL.
    NOTE: Toutes les incubations ci-après doivent être effectuées sur des tubes posés horizontalement à 20-30 °C à l’abri de la lumière.
  8. Laver l’échantillon dans 10 mL de PBS (complété par de l’azoture de sodium à 0,05 % (NaN3) pendant 3 h (trois fois) à température ambiante (TR) en agitant doucement (5 x g).
    REMARQUE : Les tissus peuvent être congelés en incubant dans 10 mL de saccharose à 30 % dans du PBS en agitant doucement (5 x g) à 4 °C ON dans des tubes coniques de 50 mL. Une fois les tissus coulés au fond du tube, incorporez-les dans le composé OCT et maintenez-les à -80 °C. Décongeler à TA jusqu’à ce que le composé OCT fonde complètement, puis laver au PBS (~10 mL/organe entier) ON à 4 °C en agitant doucement (5 x g) dans des tubes coniques de 50 mL. Passez à l’étape 2.

2. Nettoyage des tissus

NOTE: Tous les nettoyages tissulaires effectués dans ce travail ont été effectués en utilisant le protocole CUBIC I22. Trois cocktails différents ont été utilisés : CUBIC-P pour la délipidation et la décoloration rapide pendant les perfusions, CUBIC-L pour la délipidation et la décoloration, et CUBIC-R pour l’appariement RI. La coloration de l’ADN et les immunocolorations ont été effectuées à l’aide du kit de coloration nucléaire 3D CUBIC-HV 1 et du kit d’immunomarquage 3D CUBIC-HV 1, respectivement (voir le tableau des matériaux).

  1. Tremper les organes individuels dans 10 mL de CUBIC-L dilué à 50 % dans l’eau (voir le tableau des matières) en agitant doucement (5 x g) à TA (ON) dans des tubes coniques de 50 mL. Gardez les tubes à plat sur la plaque agitée.
    REMARQUE: Pour éviter des dommages tissulaires, les organes sont maintenus dans le même tube et les solutions sont collectées à l’aide d’un système de vide. Pour préparer CUBIC-L, dissoudre 10 % de N-butyldiéthanolamine et 10 % de Triton X-100 dans de l’eau bidistillée en utilisant les cocktails commerciaux (voir le tableau des matières).
    ATTENTION : CUBIC-L provoque de graves lésions oculaires. Portez une protection des yeux et du visage. Procéder à l’élimination dans une usine d’élimination des déchets agréée.
  2. Tremper l’échantillon dans 10 ml de 100 % CUBIC-L pendant 6 jours (rafraîchir la solution le jour 3).
    REMARQUE: À la fin de cette période d’incubation, les tissus doivent être presque complètement transparents.
  3. Laver les organes transparents avec du PBS (complété par 0,05%NaN3) pendant 2 h (trois fois) à 37 °C en secouant doucement (5 x g). Transférer les mouchoirs dans un nouveau tube conique de 50 ml à chaque lavage pour éliminer le Triton X-100.
    REMARQUE : Comme décrit à la figure 2B, si le but de l’expérience est de visualiser des protéines rapporteures exprimées de manière endogène à partir de parasites ou de souris transgéniques de T. cruzi (Figure 2C-F), sautez les étapes 3, 4 et 5 et passez directement à l’étape 6.

3. Coloration de l’ADN

  1. Diluer le colorant d’acide nucléique disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) dans 5 mL de tampon de coloration (inclus dans la trousse) à 1/2 500 de dilution.
  2. Immerger le tissu dans la solution de colorant nucléaire et incuber à 37 °C en rotation douce pendant 5 jours à l’aide de tubes coniques de 15 ml en position debout.
  3. Laver avec 15 ml de tampon de lavage anticoloration nucléaire 3D (inclus dans la trousse) pendant 2 h (trois fois) à TA en secouant doucement (5 x g).
    NOTE: D’autres colorants ADN peuvent être utilisés dans ces concentrations et temps d’incubation: DAPI (inclus dans le kit): 1/200, 5 jours d’incubation; BOBO-1: 1/400, 5 jours d’incubation; Iodure de propidium (PI) (inclus dans le kit): 1/100, 3 jours d’incubation; RedDot2 : 1/250, 3 jours d’incubation. Si le but spécifique de l’expérience est de visualiser à la fois les protéines rapporteures exprimées endogènes et d’utiliser des colorants nucléaires, sautez les étapes 4 et 5 et passez directement à l’étape 6.

4. Digestion de la matrice extracellulaire (ECM)

NOTE: La digestion hyaluronidase de l’ECM doit être effectuée pour faciliter la pénétration correcte des anticorps dans les régions profondes des tissus28.

  1. Immerger les organes individuels dans 15 mL de tampon de réaction hyaluronidase pendant 2 h à 37 °C dans un tube conique de 50 mL en position plate à l’abri de la lumière.
    NOTE: Pour préparer le tampon de réaction de la hyaluronidase, dissoudre 10 mM de CAPSO; 150 mM de chlorure de sodium (NaCl) et 0,05 % deNaN3 (voir le tableau des matières) dans de l’eau bidistillée et ajuster le pH à 10.
  2. Préparer la solution enzymatique en mélangeant 75 μL de 20 mg/mL de bouillon de hyaluronidase dans 425 μL de tampon réactionnel hyaluronidase. Pour préparer 20 mg/mL de stock de hyaluronidase, dissoudre la hyaluronidase dans 50 mM de tampon carbonaté, 150 mM de NaCl, 0,01 % de BSA et 0,05 % deNaN3 (voir le tableau des matières). Ajuster le pH à 10 et aliquote dans des volumes de 77 μL à -30 °C.
  3. Jeter le tampon réactionnel de la hyaluronidase à l’aide d’une pipette et immerger l’organe dans la solution enzymatique (500 μL dans un tube conique de 15 mL) en position debout à l’abri de la lumière pendant 24 h à 37 °C en agitant doucement (5 x g).
  4. Laver l’échantillon dans 15 mL de tampon de lavage hyaluronidase dans un tube conique de 50 mL en position horizontale à l’abri de la lumière pendant 2 h (trois fois) à 37 °C en agitant doucement (5 x g).
    1. Pour préparer le tampon de lavage hyaluronidase, dissoudre 50 mM de tampon carbonate, 150 mM de NaCl, 0,1% (v / v) de Triton X-100, 5% (v / v) de méthanol et 0,05% NaN3. Ajuster le pH à 10. Pour préparer 10x le stock tampon de NaCl de carbonate, dissoudre 2,96 g de carbonate de sodium, 1,86 g d’hydrogénocarbonate de sodium et 8,77 g de NaCl dans 100 mL d’eau bidistillée avec 0,05 % deNaN3 (voir le tableau des matériaux) et ajuster le pH à 10.

5. Immunomarquage

  1. Marquez le système vasculaire à l’aide d’anticorps anti-α-SMA (actine alpha-petite musculaire, voir le tableau des matériaux) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Générer un complexe d’anticorps secondaires de fragment Fab primaire plus conjugué. Commencez cette réaction 1,5 h avant la procédure de coloration.
      1. Calculer la quantité requise d’anticorps primaires et secondaires (mélanger dans un rapport de 1:0,5 en poids).
        REMARQUE: Pour l’anticorps primaire anti-α-SMA, 3,5 μg sont nécessaires pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour un produit à 2,5 mg/mL, 3,5/2,5 = 1,4 μL de solution d’anticorps est nécessaire. Pour l’anticorps secondaire AlexaFluor 647 anti-souris Fab fragment, 1,75 μg est nécessaire pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour 1,7 mg/mL de produit, 1,75/1,7 = 1 μL de solution d’anticorps est nécessaire.
      2. Mélanger les anticorps primaires et secondaires dans un tube ambré de 2 mL et incuber pendant 1,5 h à 37 °C.
    2. Pour l’échange de tampon, mélanger 7,5 mL de 2x tampon d’immunomarquage 3D HV1 (inclus dans la trousse, voir le tableau des matériaux) avec 7,5 mL d’eau bidistillée et immerger l’échantillon de tissu pendant 1,5 h à 32 °C en agitant doucement (5 x g) dans un tube conique de 15 mL en position horizontale. Commencez cette réaction simultanément à la génération du complexe d’anticorps (1,5 h avant la procédure d’immunomarquage).
  2. Effectuez une immunocoloration 3D en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Dans un tube conique de 15 mL, préparer la solution de coloration des anticorps après le dossier supplémentaire 1.
    2. Prélever l’échantillon de tissu dans le milieu d’échange tampon (étape 5.1.2) et l’immerger dans la solution de coloration des anticorps. Incuber les tissus individuellement pendant 1 semaine à 32 °C en secouant doucement (5 x g) les tubes en position debout à l’abri de la lumière. Scellez le tube avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation.
    3. Passer à 4 °C et incuber en position debout.
    4. Refroidir 1x tampon de lavage immunostatique 3D HV1 (inclus dans la trousse, voir le tableau des matières) à 4 °C et laver l’échantillon avec 15 ml de tampon (deux fois) pendant 30 minutes chacun à 4 °C en agitant doucement (5 x g). Conserver les tubes coniques de 15 ml en position horizontale jusqu’à l’étape 5.2.7.
    5. Diluer le formol à 1 % dans 1x tampon de lavage immunostatique HV1 3D et immerger l’échantillon dans 8 mL de la solution pendant 24 h à 4 °C en agitant doucement (5 x g).
    6. Incuber dans une solution fraîche de formol à 1% pendant 1 h à 37 °C en agitant doucement (5 x g).
    7. Laver dans 15 mL de PBS pendant 2 h à 25 °C en secouant doucement (5 x g).
  3. Boostez le signal tdTomato en utilisant des anticorps anti-Red Fluorescent Protein (RFP) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Suivez les mêmes temps et températures d’incubation qu’à l’étape 5.2.2. Calculez la quantité d’anticorps primaires et secondaires (voir le tableau des matières) et mélangez-les dans un rapport de 1:0,5 en poids.
      REMARQUE: Pour les anticorps primaires anti-RFP, 5 μg sont nécessaires pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour 1,25 mg/mL de produit, 5/1,25 = 4 μL de la solution sont nécessaires. Pour l’anticorps secondaire Alexa Fluor 647 anti-lapin Fab fragment, 2,5 μg sont nécessaires pour marquer le cœur entier ou un fragment de muscle squelettique de dimensions similaires. Pour 1,5 mg/mL de produit, 2,5/1,5 = 1,7 μL de la solution est nécessaire.
    2. Préparer la solution de coloration des anticorps comme mentionné dans le dossier supplémentaire 1.
  4. Boostez les signaux GFP à l’aide de nanocorps anti-GFP en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Suivez les mêmes temps et températures d’incubation que ceux mentionnés à l’étape 5.2.2.
      REMARQUE: Les nanocorps anti-GFP (voir le tableau des matériaux) sont conjugués avec Alexa Fluor 647, de sorte que la génération de complexe d’anticorps est inutile.
    2. Préparer la solution de coloration des anticorps comme mentionné dans le dossier supplémentaire 1.

6. Correspondance IR

  1. Tremper les organes transparents dans 5 mL de solution CUBIC-R+ diluée à 50 % dans l’eau (voir le tableau des matières) à TA (ON) en agitant doucement (5 x g) dans un tube conique de 50 mL. Gardez les tubes en position debout pendant toute l’étape d’appariement de l’IR.
    REMARQUE: Les solutions CUBIC R+ recyclées provenant d’expériences antérieures pourraient être réutilisées (jusqu’à quatre fois) à cette étape. Pour préparer la solution CUBIC-R+, dissoudre 45 % de 2,3-diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone (antipyrine), 30 % de nicotinamide ou de N-méthylnicotinamide et 0,5 % de N-butyldiéthanolamine dans de l’eau bidistillée ou utiliser le tampon CUBIC-R+ commercial (voir le tableau des matières).
    ATTENTION : CUBIC-R+ provoque une irritation de la peau, une irritation oculaire grave et des dommages aux organes. Portez des gants de protection et assurez-vous de protéger les yeux et le visage. Ne respirez pas de poussière, de fumées, de gaz, de brouillard ou de vapeurs. Éliminer dans une usine d’élimination des déchets agréée.
  2. Remplacer 50% CUBIC-R+ par 5 mL de 100% CUBIC-R+ et incuber en secouant doucement (5 x g) à TA pendant 2 jours. Ensuite, transférez les tissus sur une pile de lingettes non pelucheuses et tournez soigneusement les mouchoirs pour retirer la solution CUBIC-R+ des surfaces des organes pendant 5 minutes.

7. Montage

  1. Après avoir séché les tissus, transférez-les dans 5 mL de solution de montage (RI = 1,520) (voir le tableau des matériaux) dans une plaque de culture cellulaire à six puits et incuberez-les (ON) à TA. Retournez fréquemment les tissus pour éliminer les bulles d’air, en particulier à la surface des organes.
    REMARQUE: Les organes peuvent être conservés pendant plus de 6 mois dans une solution de montage ou CUBIC-R+.
  2. Collez les tissus au porte-échantillon du microscope en utilisant de la colle gel à base de cyanoacrylate.
  3. Immergez les échantillons dans la cuvette de quartz au microscope remplie de 120 ml de solution de montage et imagez-les transversalement à leur axe longitudinal. Adhérer au cœur avec l’apex et l’aorte alignés horizontalement.
    REMARQUE: Les organes dégagés et montés peuvent être sectionnés avec un vibratome et imagés à fort grossissement par microscopie confocale. Incorporer les organes dans de l’agarose à 2% et couper des sections de 100 à 500 μm. Les organes peuvent également être sectionnés manuellement avec une lame tranchante pour produire des sections de tissus épais (>1000 μm). Après la section, placez les tranches dans des boîtes de Petri de 35 mm à fond de verre, montez en utilisant la même solution de montage, scellez avec du vernis à ongles et imagez avec un microscope confocal.

8. Acquisition d’images

  1. Imagez les échantillons montés à l’aide d’un microscope à feuille de lumière (voir le tableau des matériaux). Réglez le grossissement et la taille des pas entre les tranches individuelles à 3 μm, et utilisez des lasers à feuille de lumière droite et gauche avec des épaisseurs de 5 μm et une largeur de 100%. Réglez la durée d’exposition constante à 50-100 ms et réglez la puissance laser de 10% à 80% en fonction de l’intensité du signal de fluorescence.
    1. Pour la co-détection des parasites exprimant la tomate td et des amastigotes dormants colorés par le DiR (Figure 2C), utilisez respectivement des canaux rouges (Ex/Em 561/620-660 nm) et infrarouges (Ex/Em 785/845-55 nm). Pour la co-détection des lymphocytes T et des parasites exprimant la tomate td chez la souris rapporteuse CD8 (Figure 2D), utiliser respectivement le canal vert (Ex/Em 488/525-50 nm) et le canal rouge.
    2. Pour les tests de co-infection (Figure 2E), ainsi que pour la co-détection des parasites exprimant la GFP chez les souris rapporteurs de noyaux (Figure 2F), utilisez les canaux vert et rouge, respectivement. Pour la détection des parasites exprimant la tomate, du colorant nucléaire et du système vasculaire cardiaque (Figure 3B,C), utilisez respectivement les canaux rouge, vert et rouge lointain (Ex/Em 640/680-730 nm).
    3. Détecter les anticorps anti-RFP avec le canal rouge lointain et les nanocorps anti-GFP à l’aide du canal vert (Figure 3D).
  2. Convertissez les piles d’images TIFF acquises et reconstruisez les organes en 3D à l’aide du logiciel Imaris v9.7.2 (voir Tableau des matériaux).

9. Reconstruction et quantification de surface avec le logiciel Imaris

  1. Sélectionnez l’outil d’algorithme de détection de surfaces et lancez l’assistant dans le logiciel d’analyse d’image.
  2. Effectuez une analyse initiale dans une région d’intérêt 3D (sélectionnée au hasard), puis appliquez-la à l’ensemble de la reconstruction d’organes 3D. Après avoir choisi une région d’intérêt (ROI), sélectionnez le canal à analyser, décochez le bouton lisse et sélectionnez soustraction d’arrière-plan.
    Remarque : La soustraction d’arrière-plan calcule une valeur d’arrière-plan locale unique pour chaque voxel et la soustrait de la valeur de pixel d’origine. Le diamètre de la plus grande sphère qui s’insère dans l’objet doit aller jusqu’à 200 μm pour les cellules infectées par T. cruzi, 10 μm pour les cellules T et 5 μm pour les parasites individuels.
  3. Utilisez l’histogramme pour ajuster la classification et la liste déroulante des filtres pour sélectionner les mesures à classer.
    REMARQUE : Utilisez l’histogramme pour ajuster la classification : des mesures d’ellipticité (oblat) et de sphéricité sont recommandées.
  4. Finalisez l’assistant, appuyez sur le bouton statistiques et récupérez le nombre total de cellules infectées par un parasite ou de cellules T en tant que nombre de composants déconnectés par point de temps.

Résultats

Les tissus fixes CUBIC ont été lavés avec du PBS pour éliminer les fixateurs, puis incubés avec des cocktails CUBIC-L, une solution tamponnée de base d’alcools aminés qui extrait les pigments et les lipides du tissu, ce qui entraîne une décoloration des tissus tout en maintenant l’architecture des tissus. Les lignes de la grille dans le papier peuvent être vues à travers les tissus indiquant une clairance appropriée des organes (Figure 2A). Après délipidati...

Discussion

L’absence d’imagerie approfondie des parasites et de la réponse immunitaire limite la compréhension de la complexité des interactions hôte-parasite et entrave l’évaluation des thérapies pour la maladie de Chagas. La présente étude a adopté le pipeline CUBIC pour clarifier et colorer les organes et tissus intacts de souris infectées par T. cruzi.

Plusieurs protocoles de nettoyage tissulaire ont été testés dans cette étude (PACT32, ECi 33, FLA...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Nous remercions le Dr Etsuo Susaki pour son aide précieuse et ses recommandations concernant les protocoles de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage. De plus, nous sommes reconnaissants à M. Kandasamy du noyau de microscopie biomédicale du CTEGD pour son soutien technique à l’aide de LSFM et de l’imagerie confocale. Nous remercions également tous les membres du Tarleton Research Group pour leurs suggestions utiles tout au long de cette étude.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Références

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