JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור ושיטות אוטומטיות בסיוע תוכנה כדי להמחיש ולכמת במדויק טפילי טריפנוזומה קרוזי ותאי T מתרבים ורדומים באיברים ורקמות שלמים ומנוקים. טכניקות אלה מספקות דרך אמינה להעריך את תוצאות הטיפול ומציעות תובנות חדשות על אינטראקציות בין טפיל לפונדקאי.

Abstract

מחלת צ'אגאס היא פתולוגיה מוזנחת המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם, בעיקר באמריקה הלטינית. סוכן מחלת צ'אגאס, טריפנוסומה קרוזי (T. cruzi), הוא טפיל תוך תאי חובה עם ביולוגיה מגוונת שמדביקה כמה מיני יונקים, כולל בני אדם, וגורמת לפתולוגיות לב ועיכול. זיהוי אמין של זיהומים מסוג T. cruzi in vivo נחוץ זה מכבר כדי להבין את הביולוגיה המורכבת של מחלת צ'אגאס ולהעריך במדויק את התוצאות של משטרי טיפול. הפרוטוקול הנוכחי מדגים צינור משולב לכימות אוטומטי של תאים נגועים ב-T. cruzi באיברים משוחזרים ומסולקים בתלת-ממד. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור מאפשרת הדמיה וכימות מדויקים של טפילי T. cruzi פעילים ורדומים ותאי השפעה חיסונית באיברים או רקמות שלמות. כמו כן, צינור CUBIC-HistoVision כדי לקבל תיוג אחיד של איברים מנוקים עם נוגדנים וכתמים גרעיניים אומץ בהצלחה. ניקוי רקמות בשילוב עם אימונוסטינינג תלת-ממדי מספק גישה בלתי משוחדת להערכה מקיפה של פרוטוקולי טיפול תרופתיים, משפר את הבנת הארגון התאי של רקמות נגועות ב-T. cruzi, וצפוי לקדם תגליות הקשורות לאנטי-T. תגובות חיסוניות של קרוזי , נזק לרקמות ותיקון במחלת צ'אגאס.

Introduction

מחלת צ'אגאס, הנגרמת על ידי הטפיל הפרוטוזואני T. cruzi, היא בין המחלות הטרופיות המוזנחות ביותר בעולם, וגורמת לכ-13,000 מקרי מוות בשנה. הזיהום מתקדם לעתים קרובות משלב אקוטי לכרוני ומייצר פתולוגיה לבבית אצל 30% מהחולים, כולל הפרעות קצב, אי ספיקת לב ומוות פתאומי 1,2. למרות התגובה החיסונית החזקה של הפונדקאי המתעוררת נגד הטפיל בשלב החריף, מספר נמוך של טפילים נמשך באופן כרוני לאורך כל חייו של הפונדקאי ברקמות כמו הלב ושרירי השלד. מספר גורמים, כולל התפרצות מאוחרת של תגובות חיסוניות נרכשות ונוכחות של צורות לא משוכפלות של הטפיל, עשויים לתרום ליכולת של T. cruzi למנוע חיסול מוחלט על ידי מערכת החיסון 3,4,5,6. יתר על כן, צורות רדומות שאינן משתכפלות של הטפיל מציגות רגישות נמוכה לתרופות טריפנוצידליות ועשויות להיות אחראיות בחלקן לכישלון הטיפול שנצפה במקרים רבים 7,8.

פיתוח טכניקות הדמיה חדשות מספק הזדמנות לקבל תובנה לגבי ההתפלגות המרחבית של הטפילים ברקמות הנגועות והקשר שלהם עם תאי החיסון המעורבים בשליטה שלהם. מאפיינים אלה חיוניים להבנה טובה יותר של תהליכי הדברת הטפילים על ידי מערכת החיסון ולמעקב אחר הטפילים הרדומים הנדירים הנמצאים ברקמות כרוניות.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM) היא אחת השיטות המקיפות והבלתי משוחדות ביותר להדמיה תלת-ממדית של רקמות או איברים גדולים ללא חתך דק. מיקרוסקופים בעלי יריעות אור מנצלים יריעה דקה של אור רק כדי לעורר את הפלואורופורים במישור המוקד, להפחית את הפוטו-לבניה והפוטוטוקסיות של דגימות, ולהקליט תמונות של אלפי שכבות רקמה באמצעות מצלמות אולטרה-מהירות. הרמה הגבוהה של שקיפות הרקמה הדרושה לחדירה נכונה של אור הלייזר לרקמות מתקבלת על ידי הומוגניזציה של מקדם השבירה (RI) לאחר דליפיזציה ודה-צביעה של הרקמות, מה שמפחית את פיזור האור ומעניק תמונות באיכות גבוהה ל-9,10,11.

גישות לניקוי רקמות פותחו להדמיה של עכברים שלמים 12,13,14, אורגנואידים 15,16,17, איברים המבטאים סמנים פלואורסצנטיים מדווחים 18,19,20,21,22,23, ולאחרונה מספר מוגבל של רקמות אנושיות 24 . השיטות הנוכחיות לניקוי רקמות מסווגות לשלוש משפחות: (1) שיטות מבוססות ממסים אורגניים כגון פרוטוקולי DISCO 25,26, (2) שיטות מבוססות הידרוג'ל, כגון CLARITY27, ושיטות מימיות, כגון CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף וניתוח חישובי)18,19,28,29 . פרוטוקולים מעוקבים שומרים על צורת האיברים ושלמות הרקמות, ושומרים על הפלואורסצנטיות של חלבוני דיווח המבוטאים באופן אנדוגני. העדכון האחרון של טכניקה זו, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), מאפשר גם זיהוי של אפיטופים באמצעות נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים ותיוג DNA28.

בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש בצינור CUBIC לאיתור T. cruzi המבטא חלבונים פלואורסצנטיים ברקמות עכבר שלמות שהובהרו. רקמות שקופות אופטית צולמו על ידי LSFM, שוחזרו בתלת-ממד, והמספר הכולל המדויק של תאים נגועים ב-T. cruzi , אמסטיגוטים רדומים ותאי T לכל איבר כומתו באופן אוטומטי. כמו כן, פרוטוקול זה אומץ בהצלחה כדי לקבל תיוג אחיד של איברים מנוקים עם נוגדנים וכתמים גרעיניים. גישות אלה חיוניות להבנת ההתרחבות והבקרה של T. cruzi בפונדקאים נגועים והן שימושיות להערכה מלאה של טיפולים כימותרפיים ואימונו-תרפויטיים למחלת צ'אגאס.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם קפדנית למדיניות שירות בריאות הציבור בנושא טיפול הומני ושימוש בחיות מעבדה והאגודה להערכה והסמכה של הנחיות הסמכה לטיפול בחיות מעבדה. פרוטוקול השימוש בבעלי חיים (שליטה בזיהום T. cruzi בעכברים-A2021 04-011-Y1-A0) אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ורג'יה. ב6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J ו-C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J עכברים (נקבה,1-2 חודשים) שימשו במחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. זיהום, זלוף ונתיחה

  1. מדביקים באופן תוך-צפקי עכברים בטריפומסטיגוטים שמקורם בתרבית רקמה של קולומביאנה (DTU TcI) או ברזיל (DTU TcV) זן T. cruzi המבטא חלבונים פלואורסצנטיים מסוג tdTomato או GFP, בהתאמה. מינון הזיהום יכול לנוע בין 50,000 ל-200,000 טריפומסטיגוטים מדוללים ב-100 μL של 1x תמיסת מלח עם פוספט (PBS).
    הערה: פרטים ספציפיים על הדור של טפילים מדווחים ומודלים עכברים של זיהום זמינים ב- Canavaci et al. 29 ובוסטמנטה ואח'.
  2. הרדמת העכברים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני בקצב זרימה של 3-7 ליטר לדקה. ברגע שהחיות מפסיקות להראות רפלקס דוושה, בצעו חתך אורכי דרך העור מהבטן לכיוון עצם החזה. לאחר מכן חותכים את קיר הגוף מהבטן וממשיכים דרך הצלעות בכל צד של בית החזה עד שניתן להרים את עצם החזה, לחשוף את הלב.
  3. כפי שמתואר באיור 1, בצעו חתך של 2.5 מ"מ באאוריקל הימני של הלב ואספו את הדם המתנקז באמצעות קצה מיקרופיפטה של 1 מ"ל.
  4. מחדירים מחט פרפר (המחוברת לקצה אחד של מערכת הזליפה) לתוך קצה החדר השמאלי עד שהיא מגיעה לאבי העורקים העולה. השתמשו בדבק על בסיס ג'ל (ראו טבלת חומרים) כדי לאטום את חור הכניסה סביב המחט ולשמור על המחט במקומה במהלך הזליפים.
  5. יש לפזר את העכברים 30 עם 50 מ"ל של הפרין-PBS קר (pH 7.4,10 U/mL של הפרין) או עד שהנוזל שיוצא מהעכבר לכיוון מגש האיסוף נקי מדם.
  6. עם 50 מ"ל של קור 4% (w/v) פרפורמלדהיד (PFA) (pH 7.4) ב-PBS.
    הערה: קיבוע רקמות PFA הוא ככל הנראה אחד השלבים הקריטיים של הפרוטוקול, במיוחד לשמירה על מבני אפיטופ ועל זיהוי חיסוני לאחר מכן. PFA מתכלה עם הזמן, ולכן זה חייב להיות מוכן טרי. ה- pH של התמיסה חשוב גם כדי למנוע קיבוע יתר, אשר עלול להוביל לניקוי לקוי של רקמות.
    אזהרה: PFA רעיל במידה בינונית על ידי מגע עם העור. חשיפה חריפה גם מגרה מאוד את האף, העיניים והגרון. חשיפה ארוכת טווח לרמות נמוכות באוויר או בעור עלולה לגרום לגירוי בעור כגון דרמטיטיס וגירוד, ולבעיות נשימה דמויות אסתמה. יש ללבוש הגנה על הפנים והעיניים ולא לנשום אבק, גז, ערפל, אדים או אדים.
    1. לאחר הזלפת ה-PFA, יש להשתמש בעכבר עם 100 מ"ל של חיץ CUBIC-P כדי להגיע לרמות ההבהרה שהוזכרו בשלב 1.5.
    2. כדי להכין חיץ CUBIC-P, יש להמיס 10% N-בוטילדיאתנולמין, 5% טריטון X-100 ו-5% 1-N-מתילימידאזול במים מזוקקים כפולים או להשתמש בקוקטיילים המסחריים (ראו טבלת חומרים).
      הערה: שלבים 1.6.1.-1.6.2. מומלצים רק לאיברים בעלי פיגמנטים גבוהים כמו הלב והכליות מכיוון שהם דורשים שלב ניקוי מקדים כדי להשיג רמות מוגברות של שקיפות. לאחר השימוש ב- CUBIC-P, לנתח את האיברים ולהמשיך ישירות לשלב 2: ניקוי רקמות.
  7. נתחו את דגימות הרקמה/איברים 30 להדמיה ולאחר מכן תקנו אותן ב-4% (w/v) PFA ב-PBS (~10 מ"ל/איבר שלם) למשך הלילה (ON) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (לא יותר מ-5 x גרם) בצינורות חרוטיים של50 מ"ל.
    הערה: כל הדגירה מכאן ואילך חייבת להתבצע על צינורות המונחים אופקית ב 20-30 מעלות צלזיוס מוגנים מפני אור.
  8. יש לשטוף את הדגימה ב-10 מ"ל של PBS (בתוספת 0.05% נתרן אזיד (NaN 3) למשך3 שעות (שלוש פעמים) בטמפרטורת החדר (RT) עם ניעור עדין (5 x גרם).
    הערה: ניתן להקפיא רקמות על ידי דגירה ב-10 מ"ל של 30% סוכרוז ב-PBS עם ניעור עדין (5 x גרם) ב-4 מעלות צלזיוס בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. לאחר שהרקמות שוקעות לתחתית הצינור, הטמע אותן בתרכובת OCT ושמור אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הפשירו ב-RT עד שתרכובת ה-OCT נמסה לחלוטין, ואז שטפו ב-PBS (~10 מ"ל/איבר שלם) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין (5 x גרם) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. המשך לשלב 2.

2. ניקוי רקמות

הערה: כל ניקוי הרקמות שבוצעו בעבודה זו נעשה באמצעות פרוטוקול CUBIC I22. שלושה קוקטיילים שונים שימשו: CUBIC-P עבור delipidation ו decolorization מהיר במהלך perfusions, CUBIC-L עבור delipidation ו decolorization, ו CUBIC-R עבור התאמת RI. צביעת דנ"א וכתמי חיסון בוצעו באמצעות ערכת צביעה גרעינית תלת-ממדית CUBIC-HV 1 וערכת אימונוסטינינג תלת-ממדית CUBIC-HV 1, בהתאמה (ראו טבלת חומרים).

  1. יש לטבול איברים בודדים ב-10 מ"ל של 50% מעוקב מדולל במים (ראו טבלת חומרים) עם ניעור עדין (5 x גרם) ב-RT (ON) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. שמור צינורות שטוחים על הצלחת הרועדת.
    הערה: כדי למנוע נזק לרקמות, איברים נשמרים באותה צינור, ותמיסות נאספות באמצעות מערכת ואקום. להכנת CUBIC-L, יש להמיס 10% N-בוטילדיאתנולמין ו-10% טריטון X-100 במים מזוקקים פעמיים באמצעות הקוקטיילים המסחריים (ראו טבלת חומרים).
    אזהרה: CUBIC-L גורם נזק חמור לעיניים. יש ללבוש הגנה על העיניים והפנים. יש להשליך למתקן מאושר לסילוק פסולת.
  2. יש לטבול דגימה ב-10 מ"ל של 100% CUBIC-L למשך 6 ימים (לרענן את התמיסה ביום השלישי).
    הערה: בתום תקופת הדגירה הזו, הרקמות חייבות להיות שקופות כמעט לחלוטין.
  3. שטפו את האיברים השקופים עם PBS (בתוספת 0.05% NaN3) במשך שעתיים (שלוש פעמים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול עדין (5 x גרם). העבירו רקמות לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל עם כל שטיפה כדי להסיר את Triton X-100.
    הערה: כפי שמתואר באיור 2B, אם מטרת הניסוי היא לדמיין חלבוני דיווח בעלי ביטוי אנדוגני מטפילי T. cruzi מהונדסים או מעכברים (איור 2C-F), דלג על שלבים 3, 4 ו-5 והמשך ישירות לשלב 6.

3. מכתים דנ"א

  1. דלל את צבע חומצות הגרעין הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) ב-5 מ"ל של חיץ צביעה (כלול בערכה) בדילול של 1/2,500.
  2. לטבול רקמות בתמיסת הצבע הגרעינית ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין במשך 5 ימים באמצעות צינורות חרוטיים של 15 מ"ל במצב עמידה.
  3. יש לכבס עם 15 מ"ל של חיץ כביסה מכתים גרעיני תלת-ממדי (כלול בערכה) למשך שעתיים (שלוש פעמים) ב-RT עם ניעור עדין (5 x גרם).
    הערה: ניתן להשתמש בצבעי DNA אחרים בריכוזים ובזמני הדגירה הבאים: DAPI (כלול בערכה): 1/200, דגירה של 5 ימים; BOBO-1: 1/400, 5 ימי דגירה; Propidium Iodide (PI) (כלול בערכה): 1/100, דגירה של 3 ימים; RedDot2: 1/250, דגירה של 3 ימים. אם המטרה הספציפית של הניסוי היא לדמיין את שני חלבוני הכתב המבוטאים באופן אנדוגני ולהשתמש בכתמים גרעיניים, דלג על שלבים 4 ו-5 והמשך ישירות לשלב 6.

4. עיכול מטריצה חוץ-תאית (ECM)

הערה: יש לבצע עיכול היאלורונידאז של ה- ECM כדי להקל על חדירה נכונה של הנוגדנים לאזורים עמוקים של הרקמות28.

  1. לטבול איברים בודדים ב-15 מ"ל של חיץ תגובה היאלורונידאז למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס בצינור חרוטי של 50 מ"ל במצב שטוח המוגן מפני אור.
    הערה: כדי להכין חיץ תגובה hyaluronidase, להמיס 10 mM של CAPSO; 150 mM של נתרן כלורי (NaCl), ו-0.05% של NaN3 (ראו טבלת חומרים) במים מזוקקים כפולים והתאמת ה-pH ל-10.
  2. הכן תמיסת אנזימים על-ידי ערבוב של 75 μL של 20 מ"ג/מ"ל של מלאי היאלורונידאז לתוך 425 μL של מאגר התגובה hyaluronidase. כדי להכין 20 מ"ג/מ"ל של ציר היאלורונידאז, יש להמיס היאלורונידז ב-50 מ"מ של חיץ קרבונט, 150 מ"מ של NaCl, 0.01% של BSA ו-0.05% של NaN3 (ראו טבלת חומרים). כוונן את ה- pH ל- 10 ואת ה- aliquot בנפחים של 77 μL ב- -30 °C.
  3. יש להשליך את מאגר התגובה hyaluronidase באמצעות פיפטה ולטבול את האיבר בתמיסת האנזים (500 μL בצינור חרוטי של 15 מ"ל) במצב עמידה מוגן מפני אור למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (5 x גרם).
  4. שטפו את הדגימה ב-15 מ"ל של חיץ כביסה היאלורונידאז בצינור חרוטי של 50 מ"ל במצב אופקי מוגן מפני אור למשך שעתיים (שלוש פעמים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (5 x גרם).
    1. כדי להכין מאגר שטיפה היאלורונידאז, יש להמיס 50 מ"מ של חיץ קרבונט, 150 מ"מ של NaCl, 0.1% (v/v) של טריטון X-100, 5% (v/v) של מתנול ו-0.05% NaN3. התאם את ה-pH ל-10. כדי להכין מלאי של 10x Carbonate buffer-NaCl, יש להמיס 2.96 גרם נתרן פחמתי, 1.86 גרם נתרן מימן פחמתי ו-8.77 גרם של NaCl ב-100 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים עם 0.05% NaN3 (ראו טבלת חומרים) ולהתאים את ה-pH ל-10.

5. אימונוסטינינג

  1. תייג כלי דם באמצעות נוגדנים נגד α-SMA (אקטין שריר אלפא-קטן, ראה טבלת חומרים) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. צור קומפלקס נוגדנים משני של מקטע Fab ראשוני פלוס. התחל תגובה זו 1.5 שעות לפני הליך ההכתמה.
      1. חישוב הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים ומשניים (לערבב ביחס של 1:0.5 לפי משקל).
        הערה: עבור הנוגדן העיקרי anti-α-SMA, יש צורך ב-3.5 מיקרוגרם כדי לסמן את הלב כולו או שבר של שרירי שלד בממדים דומים. עבור מוצר של 2.5 מ"ג/מ"ל, יש צורך בתמיסת נוגדנים של 3.5/2.5 = 1.4 מיקרון. עבור נוגדן משני AlexaFluor 647 נגד העכבר שבר Fab, 1.75 מיקרוגרם נדרש כדי לתייג את כל הלב או שבר של שריר השלד של ממדים דומים. עבור מוצר של 1.7 מ"ג/מ"ל, יש צורך בתמיסת נוגדנים של 1.75/1.7 = 1 μL.
      2. מערבבים נוגדנים ראשוניים ומשניים בצינור ענבר 2 מ"ל ודוגרים במשך 1.5 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. להחלפת חיץ, יש לערבב 7.5 מ"ל של חיץ חיסוני תלת-ממדי 2x HV1 (כלול בערכה, ראו טבלת חומרים) עם 7.5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים ולטבול את דגימת הרקמה למשך שעה וחצי ב-32 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות (5 x גרם) בצינור חרוטי של 15 מ"ל במצב אופקי. התחל תגובה זו בו זמנית כמו הדור של קומפלקס נוגדנים (1.5 שעות לפני הליך immunostaining).
  2. בצע אימונוסטיינינג בתלת-ממד לפי השלבים הבאים.
    1. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, הכינו את תמיסת צביעת הנוגדנים בעקבות קובץ משלים 1.
    2. אסוף את דגימת הרקמה ממדיית חילופי החיץ (שלב 5.1.2) וטבל אותה בתמיסת צביעת הנוגדנים. לדגור רקמות בנפרד במשך שבוע אחד בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין (5 x גרם) של הצינורות במצב עמידה מוגן מפני אור. אטמו את הצינור עם סרט פרפין כדי למנוע אידוי.
    3. מעבר ל-4 מעלות צלזיוס ודגירת ON במצב עמידה.
    4. יש לקרר את מאגר הכביסה החיסוני 1x HV1 3D (הכלול בערכה, ראו טבלת חומרים) ל-4°C ולשטוף את הדגימה עם חיץ של 15 מ"ל (פעמיים) למשך 30 דקות כל אחד ב-4°C עם רעידות עדינות (5 x גרם). שמור על צינורות חרוטיים של 15 מ"ל במצב אופקי עד לשלב 5.2.7.
    5. יש לדלל את הפורמלין ל-1% במאגר הכביסה התלת-ממדי HV1 3D ולטבול את הדגימה ב-8 מ"ל של התמיסה למשך 24 שעות ב-4°C עם רעידות עדינות (5 x גרם).
    6. יש לדגום בתמיסת פורמלין טרייה של 1% למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C עם רעידות עדינות (5 x גרם).
    7. יש לשטוף ב-15 מ"ל PBS למשך שעתיים ב-25°C עם רעידות עדינות (5 x גרם).
  3. הגבירו את אות tdTomato באמצעות נוגדנים נגד חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) בהתאם לשלבים הבאים.
    1. עקוב אחר אותם זמני דגירה וטמפרטורות כמו בשלב 5.2.2. חשב את כמות הנוגדנים הראשוניים והמשניים (ראה טבלת חומרים) וערבב אותם ביחס של 1:0.5 לפי משקל.
      הערה: עבור נוגדנים ראשוניים נגד RFP, יש צורך ב-5 מיקרוגרם כדי לסמן את כל הלב או שבר של שריר השלד בממדים דומים. עבור מוצר של 1.25 מ"ג/מ"ל, נדרש 5/1.25 = 4 מיקרון של התמיסה. עבור נוגדן משני Alexa Fluor 647 אנטי ארנב שבר Fab, 2.5 מיקרוגרם יש צורך לתייג את כל הלב או שבר של שריר השלד של ממדים דומים. עבור מוצר של 1.5 מ"ג/מ"ל, יש צורך ב-2.5/1.5 = 1.7 מיקרון לתמיסה.
    2. הכן את תמיסת צביעת הנוגדנים כאמור בתיק משלים 1.
  4. הגבר את אותות ה-GFP באמצעות ננו-גופים אנטי-GFP בהתאם לשלבים הבאים.
    1. עקוב אחר אותם זמני דגירה וטמפרטורות כאמור בשלב 5.2.2.
      הערה: ננו-גופים נגד GFP (ראו טבלת חומרים) מצומדים ל-Alexa Fluor 647, כך שיצירת קומפלקס הנוגדנים אינה נחוצה.
    2. הכן את תמיסת צביעת הנוגדנים כאמור בתיק משלים 1.

6. התאמת RI

  1. לטבול איברים שקופים ב-5 מ"ל של תמיסת CUBIC-R+ מדוללת מים (ראו טבלת חומרים) ב-RT (ON) עם ניעור עדין (5 x גרם) בצינור חרוטי של 50 מ"ל. שמור על צינורות במצב עמידה במהלך כל שלב התאמת ה- RI.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסות CUBIC R+ ממוחזרות מניסויים קודמים (עד ארבע פעמים) בשלב זה. כדי להכין תמיסת CUBIC-R+, יש להמיס 45% מ-2,3-דימתיל-1-פניל-5-פיראזולון (אנטיפירין), 30% מניקוטינמיד או N-מתילניקוטין-אמיד, ו-0.5% מ-N-בוטילדיאתנולמין במים מזוקקים כפולים או להשתמש בחיץ CUBIC-R+ המסחרי (ראו טבלת חומרים).
    אזהרה: CUBIC-R+ גורם לגירוי בעור, לגירוי חמור בעיניים ולנזק לאיברים. יש ללבוש כפפות מגן ולהבטיח הגנה על העיניים והפנים. אין לנשום אבק, אדים, גז, ערפל או אדים. יש להשליך למפעל מאושר לסילוק פסולת.
  2. יש להחליף 50% CUBIC-R+ ב-5 מ"ל של 100% CUBIC-R+ ולדגור ברעידות עדינות (5 x גרם) ב-RT למשך יומיים. לאחר מכן, העבירו את הרקמות לערימה של מגבונים נטולי מוך וסובבו בזהירות את הרקמות כדי להסיר תמיסת CUBIC-R+ ממשטחי האיברים למשך 5 דקות.

7. הרכבה

  1. לאחר ייבוש הרקמות, העבירו אותן ל-5 מ"ל של תמיסת הרכבה (RI = 1.520) (ראו טבלת חומרים) בצלחת תרבית תאים בת שש בארות ודגרו אותן (ON) ב-RT. לעתים קרובות סובבו את הרקמות כדי לחסל בועות אוויר, במיוחד על פני השטח של האיברים.
    הערה: ניתן לאחסן איברים במשך יותר מ-6 חודשים בתמיסת הרכבה או ב-CUBIC-R+.
  2. הדביקו את הרקמות למחזיק דגימת המיקרוסקופ באמצעות דבק ג'ל על בסיס ציאנואקרילט.
  3. לטבול את הדגימות במיקרוסקופ קוורץ cuvette מלא 120 מ"ל של תמיסת הרכבה ולדמיין אותם באופן רוחבי לציר האורך שלהם. הדבק את הלב עם apex ואת אבי העורקים מיושר אופקית.
    הערה: איברים מנוקים ומותקנים ניתנים לחיתוך עם ויברטום והדמיה בהגדלה גבוהה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. להטמיע את האיברים ב 2% agarose ולחתוך חלקים של 100-500 מיקרומטר. איברים ניתן גם לחתוך באופן ידני עם להב חד כדי לייצר חלקים רקמה עבה (>1000 מיקרומטר). לאחר החיתוך, מניחים את הפרוסות בצלחות פטרי 35 מ"מ עם תחתית זכוכית, מרכיבים באמצעות אותה תמיסת הרכבה, אוטמים עם לק, ומצלמים עם מיקרוסקופ קונפוקלי.

8. רכישת תמונה

  1. דמיינו את הדוגמאות המותקנות באמצעות מיקרוסקופ בעל יריעת אור (ראו טבלת חומרים). הגדר הגדלה וגודל צעד בין פרוסות בודדות ל- 3 מיקרומטר, והשתמש במדפסות לייזר בהירות מימין ומשמאל בעוביים של 5 מיקרומטר וברוחב של 100%. הגדר את קבוע זמן החשיפה ל-50-100 אלפיות השנייה, וכוונן את עוצמת הלייזר מ-10% ל-80% בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי.
    1. לזיהוי משותף של טפילים מבטאי tdTomato ואמסטיגוטים רדומים מוכתמים ב-DiR (איור 2C), השתמשו בערוצים אדומים (Ex/Em 561/620-660 ננומטר) ובתת-אדום (Ex/Em 785/845-55 ננומטר), בהתאמה. לזיהוי משותף של תאי T וטפילים המבטאים tdTomato בעכבר מדווח CD8 (איור 2D), השתמש בירוק (Ex/Em 488/525-50 ננומטר) ובערוץ אדום, בהתאמה.
    2. עבור מבחני coinfections (איור 2E), כמו גם עבור זיהוי משותף של טפילים המבטאים GFP בעכברים מדווחים של גרעינים (איור 2F), השתמשו בערוצים הירוקים והאדומים, בהתאמה. לזיהוי טפילים המבטאים tdTomato, צבע גרעיני וכלי דם בלב (איור 3B,C), השתמשו בערוצים האדומים, הירוקים והאדומים הרחוקים (Ex/Em 640/680-730 ננומטר), בהתאמה.
    3. זהה נוגדנים נגד RFP עם הערוץ האדום הרחוק וננו-גופים נגד GFP באמצעות הערוץ הירוק (איור 3D).
  2. המירו את ערימות התמונות TIFF שנרכשו ושחזרו בתלת-ממד את האיברים באמצעות תוכנת Imaris v9.7.2 (ראו טבלת חומרים).

9. שחזור וכימות פני השטח באמצעות תוכנת Imaris

  1. בחר בכלי אלגוריתם לזיהוי משטחים והפעל את האשף בתוכנת ניתוח התמונות.
  2. בצע ניתוח ראשוני באזור עניין תלת-ממדי (שנבחר באקראי) ולאחר מכן החל אותו על כל שחזור האיברים התלת-ממדיים. לאחר בחירת אזור עניין (ROI), בחר את הערוץ לניתוח, בטל את הסימון של הלחצן החלק ובחר חיסור רקע.
    הערה: חיסור רקע מחשב ערך רקע מקומי ייחודי עבור כל ווקסל ומפחית אותו מערך הפיקסלים המקורי. קוטר הכדור הגדול ביותר שמתאים לאובייקט חייב להיות עד 200 מיקרומטר עבור תאים נגועים ב-T. cruzi, 10 מיקרומטר עבור תאי T ו-5 מיקרומטר עבור טפילים בודדים.
  3. השתמש בהיסטוגרמה כדי להתאים את הסיווג וברשימה הנפתחת של המסנן כדי לבחור את המדידות לסיווג.
    הערה: השתמש בהיסטוגרמה כדי להתאים את הסיווג: מדידות אליפטיות (oblate) וכדוריות מומלצות.
  4. סיים את האשף, לחץ על לחצן הסטטיסטיקה ואחזר את המספר הכולל של תאים נגועים בטפיל או תאי T כמספר הרכיבים המנותקים לכל נקודת זמן.

תוצאות

רקמות קבועות מעוקבות נשטפו עם PBS להסרת קיבועים ולאחר מכן דוגרו עם קוקטיילים CUBIC-L, תמיסה בסיסית של אלכוהולים אמינו המוציאים פיגמנטים ושומנים מהרקמה וכתוצאה מכך דה-צביעה של רקמות תוך שמירה על ארכיטקטורת הרקמות. ניתן לראות קווי רשת בנייר דרך הרקמות המעידים על ניקוי מתאים של האיברים (

Discussion

היעדר הדמיה נרחבת של איברים שלמים של טפילים והתגובה החיסונית מגביל את הבנת המורכבות של יחסי הגומלין בין פונדקאי לטפיל ומעכב את הערכת הטיפולים למחלת צ'אגאס. המחקר הנוכחי אימץ את צינור ה-CUBIC כדי להבהיר ולהכתים איברים ורקמות שלמים של עכברים נגועים ב-T. cruzi.

מספר פרוטוקולים ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר אטסואו סוסאקי על עזרתם החשובה והמלצותיהם בנוגע לפרוטוקולים לניקוי רקמות ובדיקות חיסון. כמו כן, אנו מודים ל- M. Kandasamy מליבת המיקרוסקופיה הביו-רפואית CTEGD על התמיכה הטכנית באמצעות LSFM והדמיה קונפוקלית. אנו גם מודים לכל חברי קבוצת המחקר של טרלטון על ההצעות המועילות במהלך מחקר זה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-methylimidazoleMillipore Sigma616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (AntipyrineTCID1876
6-wells cell culture platesThermoFisher Scientific140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragmentJackson Immuno Research Laboratories111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647Chromotekgb2AF647-50
anti-RFPRockland600-401-379
anti-α-SMASigmaA5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #007914Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 IodideThermoFisher ScientificB3582
Bovine serum albumin (BSA)Sigma#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouseThe Jackson LaboratoryStrain #032080Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSOSigma#C2278
Cleaning wipes Kimwipes Kimberly-ClarkT8788
Confocal Laser Scanning MicroscopeZeissLSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kitTCIC3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kitTCIC3698
CUBIC-LTCIT3740
CUBIC-PTCIT3782
CUBIC-R+TCIT3741
Cyanoacrylate-based gel superglueScotch571605
DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: BiotiumBiotium#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)Millipore Sigma60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mLCorningCLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mLCorningCLS430290
FormalinSigma-AldrichHT501128
HeparinThermoFisher ScientificJ16920.BBR
HyaluronidaseSigma#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64BitPlanev9.2.0
Imaris softwareBitPlanev9.3
ImSpector softwareLaVision BioTec, Miltenyi Biotecv6.7
Intravenous injection needle 23-GSartori, Minisart Syringe filter16534
Kimwipeslint free wipes
Light-sheet fluorescent microscopeMiltenyi BiotecULtramicroscope II imaging system
MethanolThermoFisher Scientific041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µLAxygenT-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenserFisher Scientific, Fisherbrand03-692-172
Mounting SolutionTCIM3294
N-butyldiethanolamineTCIB0725
NicotinamideTCIN0078
N-MethylnicotinamideTCIM0374
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear StainBiotium#40061
Sacrifice Perfusion SystemLeica10030-380
ScissorsFine Science Tools91460-11
Serological pipettesCostar Sterile4488
Shaking incubatorTAITECBR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)ThermoFisher Scientific447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)ThermoFisher ScientificL13098.36
Sodium Chloride (NaCl)ThermoFisher Scientific447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)ThermoFisher Scientific014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid StainThermoFisher ScientificS7020
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

  1. Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
  2. Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
  3. Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
  4. Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
  5. Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
  6. Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
  7. Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
  8. Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
  9. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
  10. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
  11. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
  12. Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
  13. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
  14. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
  15. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
  16. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  17. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  19. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  21. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  22. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  23. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
  24. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  25. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  26. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  27. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  28. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  31. Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
  32. Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
  33. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
  34. Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
  35. Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  36. Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184CUBIC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved