無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング

要約

本プロトコルは、無傷で除去された臓器および組織における増殖および休眠中の トリパノソーマクルジ 寄生虫およびT細胞を視覚化および正確に定量するためのライトシート蛍光顕微鏡法および自動化されたソフトウェア支援方法について説明しています。これらの手法は、治療結果を評価するための信頼できる方法を提供し、寄生虫と宿主の相互作用に関する新しい洞察を提供します。

要約

シャーガス病は、ラテンアメリカを中心に世界中の何百万人もの人々に影響を与える無視された病理です。シャーガス病剤である トリパノソーマ クルジ(T.クルジ)は、ヒトを含むいくつかの哺乳類種に感染し、心臓および消化器系の病状を引き起こす多様な生物学を持つ絶対性細胞内寄生虫です。 T. cruziのin vivo 感染の信頼性の高い検出は、シャーガス病の複雑な生物学を理解し、治療レジメンの結果を正確に評価するために長い間必要とされてきました。現在のプロトコルは、3D再構築されたクリアされた臓器における T.cruzi感染細胞の自動定量のための統合パイプラインを示しています。ライトシート蛍光顕微鏡法は、臓器または組織全体において活発に増殖および休眠している T. cruzi 寄生虫および免疫エフェクター細胞を正確に視覚化および定量することを可能にする。また、抗体および核染色で透明化された臓器の均一な標識を得るためのCUBIC-HistoVisionパイプラインも採用されました。組織クリアリングと3D免疫染色を組み合わせることで、薬物治療プロトコルを包括的に評価し、 T. cruzi感染組織の細胞組織の理解を深めるための公平なアプローチを提供し、シャーガス病における抗T.クルジ 免疫応答、組織損傷、および修復に関連する発見を進めることが期待されます。

概要

原虫寄生虫T. cruziによって引き起こされるシャーガス病は、世界で最も無視されている熱帯病の1つであり、年間約13,000人が死亡しています。感染症はしばしば急性期から慢性期に進行し、不整脈、心不全、突然死などの患者の30%に心臓病を引き起こします^1,2。急性期に寄生虫に対して強い宿主免疫応答が誘発されるにもかかわらず、少数の寄生虫は、心臓や骨格筋などの組織で宿主の生涯を通じて慢性的に存続します。適応免疫応答の開始遅延および寄生虫の非複製型の存在を含むいくつかの要因は、免疫系による完全な排除を回避するT. cruziの能力に寄与する可能性がある3,4,5,6。さらに、寄生虫の非複製休眠型は、トリパノシド薬に対する低い感受性を示し、多くの場合に観察される治療の失敗に部分的に関与している可能性があります^7,8。

新しいイメージング技術の開発は、感染した組織....

プロトコル

この研究は、実験動物の人道的ケアと使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび実験動物ケア認定ガイドラインの評価と認定のための協会に厳密に従って実施されました。動物使用プロトコル(マウスにおける T.クルジ 感染の制御-A2021 04-011-Y1-A0)は、ジョージア大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdトマト)Hze/J、B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdトマト)Hze}/JおよびC57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/Jマウス(雌、生後^1-2ヶ月)を本試験に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1.感染、灌流、解剖

1. コロンビアーナ(DTU TcI)またはブラジル(DTU TcV) T.cruzi 株の組織培養由来トリポマスティゴテスをそれぞれtdTomatoまたはGFP蛍光タンパク質を発現するマウスを腹腔内感染させる。感染量は、100 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈された50,000〜200,000のトリポマスティゴテの範囲である可能性があります。
   注:レポーター寄生虫の生成と感染のマウスモデルに関する具体的な詳細は、Canav....

結果

CUBIC固定組織をPBSで洗浄して固定液を除去した後、組織から色素と脂質を抽出するアミノアルコールの基本的な緩衝溶液であるCUBIC-Lカクテルと一緒にインキュベートし、組織構造を維持しながら組織の脱色を行いました。紙のグリッド線は、臓器の適切な透明化を示す組織を通して見ることができます(図2A)。脱脂質化後、組織を洗浄し、それぞれCUBIC-R+お?.......

ディスカッション

寄生虫と免疫応答の広範な全臓器イメージングの欠如は、宿主と寄生虫の相互作用の複雑さの理解を制限し、シャーガス病の治療法の評価を妨げます。本研究では、 C. cruzi感染マウスの無傷の臓器および組織を清澄化および染色するためにCUBICパイプラインを採用しました。

この研究では、複数の組織クリアリングプロトコルがテストされました(PACT^3.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-methylimidazole	Millipore Sigma	616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine	TCI	D1876
6-wells cell culture plates	ThermoFisher Scientific	140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment	Jackson Immuno Research Laboratories	315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment	Jackson Immuno Research Laboratories	111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647	Chromotek	gb2AF647-50
anti-RFP	Rockland	600-401-379
anti-α-SMA	Sigma	A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #007914	Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #007914	Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide	ThermoFisher Scientific	B3582
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	#A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse	The Jackson Laboratory	Strain #032080	Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO	Sigma	#C2278
Cleaning wipes Kimwipes	Kimberly-Clark	T8788
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit	TCI	C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit	TCI	C3698
CUBIC-L	TCI	T3740
CUBIC-P	TCI	T3782
CUBIC-R+	TCI	T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue	Scotch	571605
DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium	Biotium	#60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL	Corning	CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL	Corning	CLS430290
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128
Heparin	ThermoFisher Scientific	J16920.BBR
Hyaluronidase	Sigma	#H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64	BitPlane	v9.2.0
Imaris software	BitPlane	v9.3
ImSpector software	LaVision BioTec, Miltenyi Biotec	v6.7
Intravenous injection needle 23-G	Sartori, Minisart Syringe filter	16534
Kimwipes			lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope	Miltenyi Biotec	ULtramicroscope II imaging system
Methanol	ThermoFisher Scientific	041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL	Axygen	T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser	Fisher Scientific, Fisherbrand	03-692-172
Mounting Solution	TCI	M3294
N-butyldiethanolamine	TCI	B0725
Nicotinamide	TCI	N0078
N-Methylnicotinamide	TCI	M0374
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain	Biotium	#40061
Sacrifice Perfusion System	Leica	10030-380
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Serological pipettes	Costar Sterile	4488
Shaking incubator	TAITEC	BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3)	ThermoFisher Scientific	447815000
Sodium carbonate (Na2CO3)	ThermoFisher Scientific	L13098.36
Sodium Chloride (NaCl)	ThermoFisher Scientific	447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	ThermoFisher Scientific	014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7020
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787