نموذج Xenograft للجلد للتلاعب بالاستجابات المناعية البشرية في الجسم الحي

Summary

يصف البروتوكول الحالي كيفية تطعيم جلد الإنسان على الفئران غير المصابة بالسمنة والسكرية (NOD) -scid interleukin-2 مستقبلات سلسلة غاما (NSG). يتضمن التقرير وصفا مفصلا لإعداد جلد الإنسان للزراعة ، وإعداد الفئران للزراعة ، وزرع جلد الإنسان ذي السماكة المنقسمة ، وإجراء التعافي بعد الزرع.

Abstract

يعد نموذج xenograft للجلد البشري ، حيث يتم زرع جلد متبرع بشري على مضيف فأر يعاني من نقص المناعة ، خيارا مهما للبحث الانتقالي في علم المناعة الجلدي. يختلف جلد الفئران والإنسان اختلافا كبيرا في التشريح وتكوين الخلايا المناعية. لذلك ، فإن نماذج الماوس التقليدية لها قيود على أبحاث الأمراض الجلدية واكتشاف الأدوية. ومع ذلك ، فإن عمليات الزرع الخارجية الناجحة تمثل تحديا تقنيا وتتطلب إعداد مثالي لموقع الكسب غير المشروع للعينات والفئران من أجل الكسب غير المشروع وبقاء المضيف. يوفر البروتوكول الحالي تقنية محسنة لزرع جلد الإنسان على الفئران ويناقش الاعتبارات اللازمة للأهداف التجريبية النهائية. يصف هذا التقرير التحضير المناسب لعينة جلد متبرع بشري ، وتجميع الإعداد الجراحي ، وإعداد الفئران والموقع الجراحي ، وزرع الجلد ، ومراقبة ما بعد الجراحة. يسمح الالتزام بهذه الطرق بالحفاظ على الطعوم الخارجية لأكثر من 6 أسابيع بعد الجراحة. تسمح التقنيات الموضحة أدناه بأقصى قدر من كفاءة التطعيم بسبب تطوير الضوابط الهندسية والتقنية المعقمة والتكييف قبل الجراحة وبعدها. ينتج عن الأداء المناسب لنموذج xenograft عينات طعم جلد الإنسان طويلة العمر للتوصيف التجريبي لجلد الإنسان والاختبار قبل السريري للمركبات في الجسم الحي.

Introduction

كثيرا ما تستخدم نماذج الفئران لعمل استنتاجات حول البيولوجيا البشرية والمرض ، ويرجع ذلك جزئيا إلى قابليتها للتكاثر التجريبي وقدرتها على التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا الفئران لا تلخص تماما أنظمة الأعضاء البشرية ، وخاصة الجلد ، وبالتالي لديها قيود للاستخدام كنموذج قبل سريري في تطوير الأدوية¹. تشمل الاختلافات التشريحية بين جلد الفأر والإنسان الاختلافات في سمك الظهارة والهندسة المعمارية ، ونقص الغدد العرقية المفرزة للفئران ، والاختلافات في دورة الشعر². علاوة على ذلك ، فإن كلا من الأذرع الفطرية والتكيفية للجهاز المناعي متباعدة بين النوعين³. يحتوي جلد الفأر على مجموعة مناعية فريدة من الخلايا التائية للبشرة المتغصنة (DETCs) ، ولديه وفرة أعلى من الخلايا التائية الجلدية γδ ، ويختلف في توطين المجموعة الفرعية للخلايا المناعية مقارنة بالأنسجة البشرية⁴. لذلك ، تستفيد النتائج التجريبية المتعلقة ببيولوجيا الجلد البشري والالتهاب من التحقق من صحة الأنسجة البشرية. في حين أن أنظمة الزراعة العضوية والمختبرية تستخدم على نطاق واسع أدوات لدراسة الأنسجة البشرية ، فإن هذه الأنظمة محدودة بسبب إعادة تكوين المناعة الغائبة أو غير المكتملة وعدم الاتصال بالأوعية الدموية الطرفية⁵. يهدف نموذج زرع الجلد xenograft المتوافق مع البشر إلى السماح بالتلاعب العلاجي أو البيولوجي للمسارات المناعية وغير المناعية في الأنسجة البشرية في الجسم الحي.

تم استخدام نموذج xenograft للجلد البشري لدراسة فسيولوجيا الجلد وعلم الأدوية ، وتحليل الرفض والاستجابات المناعية ، وتشريح آليات سرطان الجلد البشري ، وفهم الأمراض الجلدية والتئام الجروح⁶. في حين أن نموذج xenograft قابل للتطبيق على مجالات متعددة من أبحاث الجلد ، إلا أنه يحتوي على إنتاجية أقل من الدراسات المختبرية ويفتقر إلى سهولة التلاعب الجيني المستخدم في نماذج الفئران. قد تتراوح النقاط الزمنية ضمن هذا النموذج من أسابيع إلى أشهر ، ويتطلب التطعيم الناجح مرافق ومعدات مناسبة لإجراء هذه العمليات الجراحية. ومع ذلك ، فإن نموذج xenograft يوفر السياق البيولوجي والفسيولوجي للتجارب ، في حين أن أنظمة الزراعة العضوية ، مثل explants الأنسجة ، غالبا ما تتطلب تكرار عدد لا يحصى من الأجزاء المتحركة ، مثل الإشارات الخارجية ، في فترات زمنية محددة⁷. لذلك ، يتم استخدام هذا النموذج بشكل أفضل للتحقق من صحة النتائج التي لوحظت في المختبر وداخل نماذج الفئران ، أو للعمل غير الممكن بيولوجيا بطريقة أخرى. يوفر الاستخدام المناسب لنموذج xenograft فرصة فريدة لدراسة ومعالجة الأنسجة البشرية السليمة في الجسم الحي.

اعتمد تحسين نموذج زراعة الجلد xenograft على عقود من البحث للحفاظ على سلامة الكسب غير المشروع بمرور الوقت. من الأهمية بمكان لهذه العملية استخدام فأر مستقبلات سلسلة جاما (NSG) غير البدين (NOD) -scid interleukin-2 ، والذي يفتقر إلى الخلايا المناعية التكيفية B و T ، والخلايا القاتلة الطبيعية الوظيفية ، ولديه أوجه قصور في الخلايا البلعمية والخلايا المتغصنة⁸. تسمح الطبيعة التي تعاني من نقص المناعة لمضيفات NSG هذه بزرع الخلايا المكونة للدم البشرية والسرطانات المشتقة من المريض والجلد⁸،^9،10. على الرغم من هذه البيئة المضيفة المثبطة للمناعة ، فإن القمع الإضافي للاستجابات المناعية للعدلات في الفئران عن طريق الإدارة المضادة ل GR1 ضروري لنجاح الكسب غير المشروع¹⁰. تتمثل الحواجز الرئيسية في زرع الأنسجة السليمة في العدوى والرفض وصعوبة إعادة تدفق الدم إلى الكسب غير المشروع ، مما يؤدي في بعض الأحيان إلى فقدان سلامة الجلد والبشرة¹¹. التقنيات بما في ذلك إعطاء مضاد FR1 واستخدام عمق الكسب غير المشروع المناسب تحسين بقاء الكسب غير المشروع¹⁰. يتيح التحسين الدقيق إجراء عمليات زرع جلد xenograft البشرية على فئران NSG بكفاءة عالية ومعدلات بقاء ، تتراوح من 90٪ إلى 100٪.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة الحالية وتنفيذها وفقا لبروتوكولات UCSF IACUC (AN191105-01H) و IRB (13-11307). تم استخدام عينات الجلد ، التي تم التخلص منها كجزء من الإجراءات الجراحية الاختيارية الروتينية ، مثل إصلاح الفتق ، في البحث الحالي. يتم إلغاء تحديد عينات الجلد واعتمادها على أنها ليست أبحاث مواضيع بشرية أو ، إذا كانت معلومات التعريف السريري مطلوبة للتحليلات النهائية ، فقد قدم المرضى موافقة خطية بموجب بروتوكول IRB 13-11307. لم يتم استخدام أي معايير إدراج أو استبعاد أخرى. تم توظيف الفئران NSG من كلا الجنسين ، 8-10 أسابيع من العمر ، في الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. معالجة عينة جلد الإنسان المانحة

ملاحظة: كانت عينة جلد الإنسان المستخدمة في عملية الزرع هذه عينة كبيرة تم جمعها من بطن مريض سليم. يجب ألا يقل حجم العينة عن 15 سم × 7.5 سم. قد تؤثر قيود الحجم على عدد الفئران التي يتوفر لها الجلد واختيار حجم الكسب غير المشروع.

1. الحفاظ على عينة الجلد في درجات حرارة باردة (على الجليد ؛ 4 درجات مئوية) قبل التحضير والتطعيم. حافظ على رطوبة العينة في كوب مغلق لجمع العينات مع الشاش المنقوع في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   ملاحظة: لا ينصح بتخزين عينة الجلد عند 4 °C لمدة تزيد عن 2 أيام. ومع ذلك ، توجد تقارير حيث يتم تخزين عينات الجلد لفترة أطول¹².
   تنبيه: عالج جميع الأنسجة البشرية باحتياطات المخاطر البيولوجية القياسية.
2. الاستعداد لdermatome عينة الجلد البشري في غطاء معقم للأنسجة ذات الضغط السلبي على لوحة تشريح معقمة.
3. ضع عينة الجلد ، جانب البشرة لأعلى ، على لوحة التشريح. امسح البشرة باستخدام وسادة تحضير كحول معقمة ثم باستخدام PBS.
4. ثبت الحافة الأقرب من الجلد في مكانها باستخدام 1.5 في تشريح دبوس T (انظر جدول المواد).
5. Dermatome عينة الجلد بسمك 400 ميكرومتر ، مع تطبيق ضغط ثابت أثناء القطع للأمام بزاوية 30 درجة -45 درجة. اتبع جميع التعليمات الخاصة بالجهاز وتدابير السلامة (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول تقنية الجلد ، يرجى الاطلاع على تقرير منشور مسبقا¹³.
6. قم بإعداد طبق بتري 100 مم × 20 مم عن طريق وضع شاش معقم منقوع في PBS معقم في قاع الطبق. ضع الجلد ، بحيث يكون جانب البشرة لأعلى ، على الشاش المبلل.
7. قم بإغلاق حواف اللوحة وتغطيتها بغشاء مانع للتسرب شبه شفاف (انظر جدول المواد) لضمان عدم تلوث العينة. قم بتخزين العينة عند 4 درجات مئوية قبل التطعيم.

2. تكييف وإعداد ما قبل الجراحة

1. تحضير الأدوات المعقمة ومحطة جراحية معقمة للتطعيم. استخدم المناشف الورقية المعقمة كأسطح معقمة لوضع الأدوات والماوس.
   ملاحظة: يمكن تطعيم الفئران بعد الفطام ولكن يفضل تطعيمها بين 8-10 أسابيع من العمر. يمكن تطعيم الفئران من أي من الجنسين.
2. قم بإجراء التحضير الجراحي ، مثل إزالة الشعر ، في منطقة منفصلة جسديا عن المحطة الجراحية.
3. تحضير مضاد GR1 (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيفه إلى 1 ملغ / مل في محلول ملحي معقم. جرعة كل فأر مع 100 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من محلول مضاد GR1 داخل الصفاق بعد تحريض التخدير.
4. تخدير الفئران، واحدا تلو الآخر، باستخدام إيزوفلوران أو غيره من أدوية التخدير المعتمدة مؤسسيا.
   ملاحظة: يجب إعطاء إيزوفلوران بتركيز 3٪ -5٪ أثناء الحث. بمجرد أن يصبح الماوس غير متحرك ، قم بخفض تركيز الأيزوفلوران إلى 1٪ -3٪ للتأثير طوال مدة الجراحة.
   1. راقب الماوس للحصول على عمق مناسب للتخدير من خلال مراقبة معدل التنفس ، وغياب استجابة قرصة إصبع القدم ، والتلوين الوردي المناسب للأذنين والفم.
      تنبيه: استخدم آلات التخدير المناسبة وطرق الكسح ، وتجنب التعرض لأبخرة إيزوفلوران.
5. انقل الماوس إلى وسادة تدفئة أو مصدر حرارة آخر (انظر جدول المواد).
6. تطبيق مرهم العيون عن طريق وضع قطرة صغيرة من المرهم على العين بإصبع قفاز.
7. تطبيق المسكنات البوبرينورفين (0.08 ملغ/كغ) وكاربروفين (5ملغ / كغ) (انظر جدول المواد) تحت الجلد عن طريق القرص الجلد والحقن بزاوية موازية للجسم.
   ملاحظة: تحضير تسكين ما قبل العلاج باتباع البروتوكولات المؤسسية. اتبع الإرشادات المؤسسية لاختيار المسكنات وإدارتها. تم توضيح طريقة التسكين المستخدمة في هذه الدراسة في الخطوة 2.7 والشكل التكميلي 1.
8. يتم تطبيق مضاد GR1 (المحضر في الخطوة 2.4) داخل الصفاق عن طريق رفع الماوس قليلا من الذيل، وتعريض البطن، والحقن بزاوية 30 درجة باستخدام حقنة الأنسولين 1 مل (12.7 مم).
9. استخدم كليبرز كهربائي آمن للحيوانات (انظر جدول المواد) لحلق الأجزاء الوسطى والعلوية من الجانب الظهري للماوس.
10. نظف كل الشعر وضع كمية وفيرة من مرهم إزالة الشعر على الجلد المحلوق لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
11. امسح تماما مرهم إزالة الشعر بمنشفة ورقية و PBS.

3. إجراء الزرع

1. نقل الماوس إلى موقع جراحي ثانوي ، بعيدا عن محطة إزالة الشعر.
2. تعقيم موقع الجراحة بعصا مسحة اليود في حركة دائرية ، بدءا من المنتصف والعمل نحو حافة المنطقة المزيلة للشعر.
3. ضع قطعة من غلاف بلاستيكي معقم فوق الفأر وقم بقص نافذة في البلاستيك أكبر قليلا من حجم المنطقة المراد تطعيمها.
4. قطع جزء مستطيل الشكل 10 مم × 10 مم من جلد المتبرع ليتم تطعيمه بمشرط. افعل ذلك عن طريق تثبيت جلد المتبرع بإحكام في مكانه مع الجانب الخلفي من الملقط والقطع جنبا إلى جنب مع الملقط بالمشرط.
5. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص منطقة مستطيلة من جلد الفأر تتناسب مع حجم قطعة جلد المتبرع ، مما يؤدي إلى إنشاء سرير ترقيع. استخدم ملقط لسحب الجلد بعيدا عن الجسم ، وقم بقص الجلد بالمقص بزاوية بعيدا عن الجسم لتجنب القطع بعمق في الوجه.
6. ضع قطعة جلد المتبرع ، بحيث يكون جانب البشرة لأعلى ، على سرير الكسب غير المشروع المجهز.
7. باستخدام الجزء الخلفي من الملقط ، تعامل مع الجلد ، وانزلق ذهابا وإيابا حتى يصبح جلد المتبرع مسطحا تماما على سرير الكسب غير المشروع.
8. أضف قطرات من لاصق أنسجة الغراء الجراحي (انظر جدول المواد) حيث يلتقي جلد المتبرع بجلد الفأر ويمسك جلد الفأر والمتبرع معا بالملقط لمدة 1-2 ثانية حتى يلتصق الغراء بالأنسجة. أغلق حافة الكسب غير المشروع تماما واترك الغراء يجف تماما.
9. ضمادة الفئران (الشكل 1) باتباع الخطوات أدناه.
   1. قطع قطعة من شاش الفازلين (انظر جدول المواد) كبيرة بما يكفي لتغطية منطقة الكسب غير المشروع بالكامل.
   2. قم بتغطية الكسب غير المشروع بشاش الفازلين ، واضغط برفق على الشاش على الجلد باستخدام الملقط.
   3. قم بقص شريط من ضمادة فيلم شفاف بالطول بحيث يكون العرض كبيرا بما يكفي لتغطية جرح الماوس.
   4. اضغط بقوة على ضمادة الفيلم الشفافة ، الجانب اللاصق لأسفل ، فوق الشاش. لف الماوس بسرعة للف الضمادة بالكامل حول الجذع ، وتأكد من ملاءمتها بإحكام دون إعاقة التنفس وأن جميع الأطراف حرة للحركة.
   5. ضع الماوس في قفص الاسترداد وراقبه حتى يصبح في حالة تأهب ويتحرك. توفير مصدر حرارة على جزء من القفص لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد التعافي.
      ملاحظة: من المتوقع أن تتعافى الحيوانات في غضون 1-5 دقائق بعد وضعها في قفص التعافي.
10. منزل منفردة الفئران بعد التطعيم.
11. إدارة تسكين ما بعد الجراحة كما هو مطلوب من قبل البروتوكولات المؤسسية.
    ملاحظة: تم إعطاء البوبرينورفين (0.08 ملغم / كغم) تحت الجلد بعد 4-6 ساعات خلال الدراسة الحالية.

4. إجراءات ما بعد الجراحة

1. حقن 100 ميكرولتر (100 ميكروغرام) من مضاد GR1 داخل الصفاق في 4 أيام و 7 أيام و 11 يوما بعد التطعيم لمنع رفض الكسب غير المشروع (الشكل التكميلي 1).
2. استبدل الضمادات حسب الضرورة وإذا أزيلت بواسطة الفئران.
3. ضمادة جميع الفئران في اليوم 7.
4. إزالة الضمادات في اليوم 14.
5. راقب الفئران بحثا عن علامات رفض الكسب غير المشروع والالتهاب الجهازي (فقدان الوزن ، تساقط الشعر ، الخمول الشديد).
6. حصاد الفئران بين 3 و 6 أسابيع بعد الكسب غير المشروع.
   1. القتل الرحيم للفئران عن طريق إدارة ثاني أكسيد الكربون (CO₂) التي يتحكم فيها المنظم متبوعا بخلع عنق الرحم.
      ملاحظة: اتبع الإرشادات المؤسسية للقتل الرحيم.
   2. تشريح ترقيع الجلد من الفئران¹⁴. ضع جزءا من الكسب غير المشروع في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة قبل تضمين البارافين وتقسيمه لتلطيخ الأنسجة⁹.
   3. فرم ترقيع الجلد بالمقص وهضمه إنزيميا باستخدام 250 وحدة دولية / مل من كولاجيناز الوريدي و 0.02 مجم / مل من DNase في وسط زراعة الخلايا طوال الليل. قم بتلطيخ الخلايا بحثا عن علامات سطحية وداخل الخلايا باتباع الإجراء الموصوف سابقا¹⁴.

النتائج

تم إجراء الطعوم الأجنبية لجلد الإنسان على فئران NSG داخل منشأة حيوانية فائقة الحاجز. تم تعريف النجاح من خلال الكسب غير المشروع لفترات طويلة وبقاء الفئران والصحة السلوكية للفئران بعد الزرع. لوحظ في البداية أن ضعف البقاء على قيد الحياة خلال الأسبوع التالي للجراحة هو أكبر عائق أمام النجاح الت...

Discussion

يعد نموذج زرع جلد الفأر xenograft تقنية رئيسية لتشريح الاستجابات المناعية لجلد الإنسان ميكانيكيا في وضع في الجسم الحي ¹⁴. تعتمد عمليات زرع الطعم الأجنبي الناجحة على التحضير المناسب للفئران وعينات الجلد والفئران والالتزام بطرق جراحة القوارض المعقمة¹⁵. يعد التبري?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye