Modello cutaneo di xenotrapianto per manipolare le risposte immunitarie umane in vivo

Riepilogo

Il presente protocollo descrive come innestare la pelle umana su topi del recettore della catena gamma (NSG) diabetici non obesi (NOD)-scid. Una descrizione dettagliata della preparazione della pelle umana per il trapianto, la preparazione di topi per il trapianto, il trapianto di pelle umana a spessore diviso e la procedura di recupero post-trapianto sono inclusi nella relazione.

Abstract

Il modello di xenotrapianto di pelle umana, in cui la pelle di un donatore umano viene trapiantata su un ospite di topo immunodeficiente, è un'opzione importante per la ricerca traslazionale in immunologia cutanea. La pelle murina e umana differiscono sostanzialmente nell'anatomia e nella composizione delle cellule immunitarie. Pertanto, i modelli murini tradizionali hanno limitazioni per la ricerca dermatologica e la scoperta di farmaci. Tuttavia, gli xenotrapianti di successo sono tecnicamente impegnativi e richiedono una preparazione ottimale del campione e del sito di innesto di topo per la sopravvivenza dell'innesto e dell'ospite. Il presente protocollo fornisce una tecnica ottimizzata per il trapianto di pelle umana sui topi e discute le considerazioni necessarie per gli obiettivi sperimentali a valle. Questo rapporto descrive la preparazione appropriata di un campione di pelle di donatore umano, l'assemblaggio di una configurazione chirurgica, la preparazione del topo e del sito chirurgico, il trapianto di pelle e il monitoraggio post-chirurgico. L'aderenza a questi metodi consente il mantenimento degli xenotrapianti per oltre 6 settimane dopo l'intervento. Le tecniche descritte di seguito consentono la massima efficienza dell'innesto grazie allo sviluppo di controlli ingegneristici, tecniche sterili e condizionamento pre e post-chirurgico. L'esecuzione appropriata del modello di xenotrapianto si traduce in campioni di innesto di pelle umana di lunga durata per la caratterizzazione sperimentale della pelle umana e test preclinici di composti in vivo.

Introduzione

I modelli murini sono spesso usati per fare inferenze sulla biologia umana e sulle malattie, in parte a causa della loro riproducibilità sperimentale e della capacità di manipolazione genetica. Tuttavia, la fisiologia del topo non ricapitola completamente i sistemi di organi umani, in particolare la pelle, e quindi ha limitazioni per l'uso come modello preclinico nello sviluppo di farmaci¹. Le differenze anatomiche tra la pelle del topo e quella umana includono differenze negli spessori epiteliali e nell'architettura, mancanza di ghiandole sudoripare eccrine murine e variazioni nel ciclo dei capelli². Inoltre, sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario sono divergenti tra le due specie³. La pelle di topo contiene una popolazione immunitaria unica di cellule T epidermiche dendritiche (DETC), ha una maggiore abbondanza di cellule T γδ dermiche e varia nella localizzazione del sottogruppo di cellule immunitarie rispetto al tessuto umano⁴. Pertanto, i risultati sperimentali riguardanti la biologia della pelle umana e l'infiammazione beneficiano della convalida con tessuto umano. Mentre i sistemi di coltura in vitro e organoidi sono strumenti ampiamente utilizzati per studiare il tessuto umano, questi sistemi sono limitati dalla ricostituzione immunitaria assente o incompleta e dalla mancanza di connessione con la vascolarizzazione periferica⁵. Il modello umanizzato di trapianto di pelle di xenotrapianto mira a consentire la manipolazione terapeutica o biologica di percorsi immunitari e non immunitari nei tessuti umani in vivo.

Il modello di xenotrapianto di pelle umana è stato utilizzato per studiare la fisiologia e la farmacologia della pelle, analizzare il rigetto immunitario e le risposte, analizzare i meccanismi del cancro della pelle umana e comprendere le malattie della pelle e la guarigione delle ferite⁶. Sebbene applicabile a più campi della ricerca sulla pelle, il modello di xenotrapianto ha un rendimento inferiore rispetto agli studi in vitro e manca della facilità di manipolazione genetica impiegata nei modelli murini. I punti temporali all'interno di questo modello possono variare da settimane a mesi e l'innesto di successo richiede strutture e attrezzature adeguate per eseguire questi interventi chirurgici. Tuttavia, il modello di xenotrapianto fornisce un contesto biologico e fisiologico agli esperimenti, mentre i sistemi di coltura organoide, come gli espianti di tessuto, spesso richiedono la replica di una miriade di parti mobili, come i segnali esogeni, a specifici intervalli di tempo⁷. Pertanto, questo modello è meglio utilizzato per convalidare ulteriormente i risultati osservati in vitro e all'interno di modelli murini, o per lavori che non sono altrimenti biologicamente fattibili. L'uso appropriato del modello di xenotrapianto offre un'opportunità unica per studiare e manipolare il tessuto umano intatto in vivo.

L'ottimizzazione del modello di trapianto di pelle di xenotrapianto si è basata su decenni di ricerca per preservare l'integrità dell'innesto nel tempo. Fondamentale per questo processo è l'utilizzo del topo del recettore della catena gamma (NSG) del diabete non obeso (NOD)-scid, che manca di cellule immunitarie adattative B e T, cellule NK funzionali e ha carenze nei macrofagi e nelle cellule dendritiche⁸. La natura immunodeficiente di questi ospiti NSG consente il trapianto di cellule ematopoietiche umane, tumori derivati dal paziente e pelle ^8,9,10. Nonostante questo ambiente ospite immunosoppressivo, è necessaria un'ulteriore soppressione delle risposte immunitarie neutrofile del topo mediante somministrazione di anti-GR1 per il successo del trapianto¹⁰. I principali ostacoli nel trapianto di tessuto intatto sono l'infezione, il rigetto e la difficoltà di ristabilire il flusso sanguigno all'innesto, che a volte porta alla perdita dell'integrità dermica ed epidermica¹¹. Le tecniche che includono la somministrazione di anti-FR1 e l'uso di un'appropriata profondità di innesto migliorano la sopravvivenza del trapianto¹⁰. L'ottimizzazione meticolosa consente di eseguire trapianti di pelle di xenotrapianto umano su topi NSG con alti tassi di efficienza e sopravvivenza, compresi tra il 90% e il 100%.

Protocollo

Il presente studio è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Campioni di pelle, scartati come parte di procedure chirurgiche elettive di routine, come la riparazione dell'ernia, sono stati utilizzati per la presente ricerca. I campioni di pelle sono de-identificati e certificati come Not Human Subjects Research o, se sono richieste informazioni clinicamente identificative per le analisi a valle, i pazienti hanno fornito il consenso scritto ai sensi del protocollo IRB 13-11307. Non sono stati utilizzati altri criteri di inclusione o esclusione. Topi NSG di entrambi i sessi, 8-10 settimane di età, sono stati impiegati nello studio. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Trattamento del campione di pelle umana del donatore

NOTA: Il campione di pelle umana utilizzato in questo trapianto era un grande campione raccolto dall'addome di un paziente sano. Il campione deve essere di almeno 15 cm x 7,5 cm. Le limitazioni delle dimensioni possono influenzare il numero di topi per i quali la pelle è disponibile e la scelta della dimensione dell'innesto.

1. Mantenere il campione di pelle a basse temperature (su ghiaccio; 4°C) prima della preparazione e dell'innesto. Mantenere il campione umido in una tazza di raccolta del campione chiusa con la garza imbevuta di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
   NOTA: Non è consigliabile conservare il campione cutaneo a 4 °C per più di 2 giorni. Tuttavia, esistono rapporti in cui i campioni di pelle vengono conservati per un tempo più lungo¹².
   ATTENZIONE: Trattare tutti i tessuti umani con le precauzioni standard di rischio biologico.
2. Preparare a dermatomare il campione di pelle umana in un cappuccio di coltura tissutale sterilizzato a pressione negativa su un pannello di dissezione sterilizzato.
3. Posizionare il campione di pelle, con l'epidermide rivolta verso l'alto, sul bordo di dissezione. Pulire l'epidermide con un tampone sterile per la preparazione dell'alcool e poi con PBS.
4. Appuntare il bordo più vicino della pelle in posizione con un perno a T da 1,5 pollici (vedere la tabella dei materiali).
5. Dermatoma il campione di pelle con uno spessore di 400 μm, applicando una pressione costante mentre si taglia in avanti con un angolo di 30 ° -45 °. Seguire tutte le istruzioni specifiche dello strumento e le misure di sicurezza (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Per i dettagli sulla tecnica del dermatoma, consultare un rapporto precedentemente pubblicato¹³.
6. Preparare una capsula di Petri da 100 mm x 20 mm posizionando una garza sterile imbevuta di PBS sterile sul fondo del piatto. Posizionare la pelle, con l'epidermide rivolta verso l'alto, sulla garza bagnata.
7. Sigillare e coprire i bordi della piastra con una pellicola sigillante semitrasparente (vedere Tabella dei materiali) per garantire che il campione non sia contaminato. Conservare il campione a 4°C prima dell'innesto.

2. Condizionamento e preparazione pre-operatoria

1. Preparare gli strumenti sterili e una stazione chirurgica sterile per l'innesto. Utilizzare asciugamani di carta autoclavati come superfici sterili per il posizionamento di strumenti e mouse.
   NOTA: I topi possono essere innestati dopo lo svezzamento, ma sono preferibilmente innestati tra le 8-10 settimane di età. I topi di entrambi i sessi possono essere innestati.
2. Eseguire la preparazione chirurgica, come la depilazione, in un'area fisicamente separata dalla stazione chirurgica.
3. Preparare l'anti-GR1 (vedere Tabella dei materiali) diluendolo a 1 mg/ml in soluzione salina sterile. Dosare ogni topo con 100 μg/100 μL della soluzione anti-GR1 per via intraperitoneale dopo l'induzione dell'anestesia.
4. Anestetizzare i topi, uno alla volta, con isoflurano o altri anestetici istituzionalmente approvati.
   NOTA: L'isoflurano deve essere somministrato ad una concentrazione del 3%-5% durante l'induzione. Una volta che il topo è immobile, abbassare la concentrazione di isoflurano all'1% -3% per effetto per tutta la durata dell'intervento chirurgico.
   1. Monitorare il mouse per un'adeguata profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria, l'assenza di risposta del pizzico e la colorazione rosa appropriata delle orecchie e della bocca.
      ATTENZIONE: Utilizzare macchinari anestetici appropriati e metodi di scavenging ed evitare l'esposizione a vapori di isoflurano.
5. Trasferire il mouse su una piastra elettrica o su un'altra fonte di calore (vedere Tabella dei materiali).
6. Somministrare l'unguento oftalmico tamponando una piccola goccia di unguento sull'occhio con un dito guantato.
7. Somministrare analgesici Buprenorfina (0,08 mg/kg) e Carprofen (5 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea pizzicando la pelle e iniettando con un angolo parallelo al corpo.
   NOTA: Preparare l'analgesia pre-trattamento seguendo i protocolli istituzionali. Seguire le linee guida istituzionali per la selezione e la somministrazione di analgesici. Il metodo di analgesia utilizzato in questo studio è descritto nella fase 2.7 e nella Figura supplementare 1.
8. Somministrare l'anti-GR1 (preparato al punto 2.4) per via intraperitoneale sollevando leggermente il topo per la coda, esponendo l'addome e iniettando con un angolo di 30° utilizzando una siringa da insulina da 1 mL (12,7 mm).
9. Utilizzare tagliatrici elettriche sicure per gli animali (vedere la tabella dei materiali) per radere le porzioni centrale e superiore del lato dorsale del mouse.
10. Cancellare tutti i capelli e applicare una generosa quantità di unguento depilatorio sulla pelle rasata per 30 secondi a 1 minuto.
11. Pulire completamente l'unguento per la depilazione con un tovagliolo di carta e PBS.

3. Procedura di trapianto

1. Trasferire il mouse in una posizione chirurgica secondaria, lontano dalla stazione di depilazione.
2. Sterilizzare il sito chirurgico con il bastoncino di tampone di iodio con un movimento circolare, iniziando dal centro e lavorando verso il bordo dell'area depilata.
3. Posizionare un pezzo di pellicola sterile sopra il mouse e tagliare una finestra nella plastica leggermente più grande della dimensione dell'area da innestare.
4. Tagliare una porzione rettangolare di 10 mm x 10 mm di pelle del donatore da innestare con un bisturi. Fallo tenendo saldamente la pelle del donatore in posizione con il retro della pinza e tagliando accanto alla pinza con il bisturi.
5. Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare un'area rettangolare di pelle di topo corrispondente alle dimensioni del pezzo di pelle del donatore, creando un letto di innesto. Usa una pinza per allontanare la pelle dal corpo e taglia la pelle con le forbici inclinate lontano dal corpo per evitare di tagliare profondamente nella faccia.
6. Posizionare il pezzo di pelle del donatore, con il lato dell'epidermide rivolto verso l'alto, sul letto di innesto preparato.
7. Usando la parte posteriore della pinza, manipolare la pelle, scivolando avanti e indietro fino a quando la pelle del donatore si trova completamente piatta contro il letto di innesto.
8. Aggiungere gocce di colla chirurgica adesivo per tessuti (vedi Tabella dei materiali) dove la pelle del donatore incontra la pelle del topo e tenere la pelle del topo e del donatore insieme con una pinza per 1-2 secondi in modo che la colla aderisca ai tessuti. Sigillare completamente il bordo dell'innesto e lasciare asciugare completamente la colla.
9. Bendare i topi (Figura 1) seguendo i passaggi seguenti.
   1. Tagliare un pezzo di garza di petrolato (vedi Tabella dei materiali) abbastanza grande da coprire completamente l'area dell'innesto.
   2. Coprire l'innesto con la garza di petrolato e premere leggermente la garza contro la pelle usando una pinza.
   3. Tagliare una striscia di una pellicola trasparente medicata longitudinalmente in modo che la larghezza sia abbastanza grande da coprire la ferita del topo.
   4. Premere con decisione la medicazione del film trasparente, con il lato adesivo verso il basso, sulla garza. Ruota rapidamente il mouse per avvolgere completamente la medicazione attorno al busto, assicurandoti che si adatti perfettamente senza ostacolare la respirazione e che tutti gli arti siano liberi di movimento.
   5. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero e monitorarlo fino a quando non è vigile e si muove. Fornire una fonte di calore su una parte della gabbia per almeno 15 minuti dopo il recupero.
      NOTA: Gli animali dovrebbero riprendersi entro 1-5 minuti dopo averli messi nella gabbia di recupero.
10. Ospitare singolarmente i topi dopo l'innesto.
11. Somministrare l'analgesia post-chirurgica come previsto dai protocolli istituzionali.
    NOTA: La buprenorfina (0,08 mg/kg) è stata somministrata per via sottocutanea 4-6 ore dopo durante il presente studio.

4. Procedure post-chirurgiche

1. Iniettare 100 μL (100 μg) di anti-GR1 per via intraperitoneale a 4 giorni, 7 giorni e 11 giorni dopo l'innesto per prevenire il rigetto dell'innesto (Figura supplementare 1).
2. Sostituire le bende se necessario e se rimosse dai topi.
3. Bendare tutti i topi il giorno 7.
4. Rimuovere le bende il giorno 14.
5. Monitorare i topi per segni di rigetto del trapianto e infiammazione sistemica (perdita di peso, perdita di capelli, letargia estrema).
6. Raccogliere i topi tra 3 e 6 settimane dopo l'innesto.
   1. Eutanasia dei topi tramite somministrazione di anidride carbonica (CO₂) controllata dal regolatore seguita da dislocazione cervicale.
      NOTA: Seguire le linee guida istituzionali per l'eutanasia.
   2. Sezionare gli innesti di pelle dai topi¹⁴. Posizionare una porzione dell'innesto in formalina al 10% per 24 ore prima dell'incorporazione della paraffina e del sezionamento per la colorazione istologica⁹.
   3. Tritare gli innesti cutanei con le forbici e digerire enzimaticamente con 250 UI/ml di collagenasi IV e 0,02 mg/ml di DNasi nei terreni di coltura cellulare durante la notte. Colorare le cellule per marcatori superficiali e intracellulari seguendo la procedura precedentemente descritta¹⁴.

Risultati

Gli xenotrapianti di pelle umana sono stati eseguiti su topi NSG all'interno di una struttura animale super-barriera. Il successo è stato definito dalla prolungata sopravvivenza del trapianto e del topo e dalla salute comportamentale dei topi post-trapianto. La scarsa sopravvivenza durante la settimana successiva all'intervento chirurgico è stata inizialmente osservata come la più grande barriera al successo sperimentale, con fino al 50% dei topi che richiedono l'eutanasia. Il miglioramento della tecnica sterile e un ...

Discussione

Il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto di topo è una tecnica chiave per sezionare meccanicamente le risposte immunitarie della pelle umana in un ambiente in vivo ¹⁴. Il successo dei trapianti di xenotrapianto cutaneo si basa su un'adeguata preparazione di topi e campioni di pelle e topi e sull'aderenza ai metodi di chirurgia asettica dei roditori¹⁵. Il raffreddamento rapido e la corretta conservazione dei campioni di pelle a basse temperature in terreni...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye