מודל Xenograft לעור למניפולציה של תגובות חיסוניות אנושיות in vivo

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתיל עור אנושי בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2 קולטן שרשרת גמא (NSG). בדו"ח נכללים תיאור מפורט של הכנת עור אדם להשתלה, הכנת עכברים להשתלה, השתלת עור אדם בעובי מפוצל והליך התאוששות לאחר ההשתלה.

Abstract

מודל קסנוגרפט העור האנושי, שבו מושתל עור תורם אנושי בפונדקאי עכבר חסר חיסון, הוא אופציה חשובה למחקר תרגומי באימונולוגיה של העור. מורין ועור האדם נבדלים זה מזה באופן מהותי באנטומיה ובהרכב תאי מערכת החיסון. לכן, למודלים מסורתיים של עכברים יש מגבלות למחקר דרמטולוגי ולגילוי תרופות. עם זאת, קסנוטרנספלנטים מוצלחים הם מאתגרים מבחינה טכנית ודורשים הכנה אופטימלית של אתר הדגימה והשתלת העכבר להישרדות השתל והמארח. הפרוטוקול הנוכחי מספק טכניקה אופטימלית להשתלת עור אנושי בעכברים ודן בשיקולים הכרחיים למטרות ניסוי במורד הזרם. דו"ח זה מתאר הכנה מתאימה של דגימת עור של תורם אנושי, הרכבה של מערך כירורגי, הכנת עכברים ואתרים כירורגיים, השתלת עור וניטור לאחר ניתוח. הקפדה על שיטות אלה מאפשרת שמירה על קסנוגרפטים במשך למעלה מ-6 שבועות לאחר הניתוח. הטכניקות המפורטות להלן מאפשרות יעילות השתלה מקסימלית בשל פיתוח בקרות הנדסיות, טכניקה סטרילית והתניה לפני ואחרי ניתוח. ביצועים מתאימים של מודל xenograft מביאים לדגימות השתלת עור אנושיות ארוכות טווח לאפיון ניסיוני של עור אנושי ובדיקות פרה-קליניות של תרכובות in vivo.

Introduction

מודלים של עכברים משמשים לעתים קרובות כדי להסיק מסקנות לגבי ביולוגיה ומחלות אנושיות, בין היתר בשל יכולת השחזור הניסיונית שלהם ויכולת המניפולציה הגנטית שלהם. עם זאת, הפיזיולוגיה של העכבר אינה משחזרת לחלוטין את מערכות האיברים האנושיים, במיוחד את העור, ולכן יש לה מגבלות לשימוש כמודל פרה-קליני בפיתוח תרופות¹. הבדלים אנטומיים בין עור העכבר לעור האדם כוללים הבדלים בעובי האפיתל ובארכיטקטורה, מחסור בבלוטות זיעה מורין אקרין ושינויים במחזור השיער². יתר על כן, הן הזרועות המולדות והן הזרועות הנרכשות של מערכת החיסון שונות בין שני המינים³. עור העכבר מכיל אוכלוסייה חיסונית ייחודית של תאי T אפידרמליים דנדריטיים (DETCs), יש לו שפע גבוה יותר של תאי γδ T עוריים, והוא משתנה בלוקליזציה של תת-קבוצה של תאי מערכת החיסון בהשוואה לרקמות אנושיות⁴. לכן, ממצאים ניסיוניים לגבי ביולוגיה ודלקת של עור האדם נהנים מאימות עם רקמות אנושיות. בעוד שמערכות תרבית חוץ גופית ואורגנואידית נמצאות בשימוש נרחב בכלים לחקר רקמות אנושיות, מערכות אלה מוגבלות על ידי שחזור חיסוני נעדר או לא שלם וחוסר חיבור לכלי הדם ההיקפיים⁵. מודל השתלת העור האנושי של קסנוגרפט נועד לאפשר מניפולציה טיפולית או ביולוגית של מסלולים חיסוניים ולא חיסוניים ברקמות אנושיות in vivo.

מודל קסנוגרפט העור האנושי שימש לחקר פיזיולוגיה ופרמקולוגיה של העור, ניתוח דחייה ותגובות של מערכת החיסון, ניתוח מנגנוני סרטן עור אנושיים והבנת מחלות עור וריפוי פצעים⁶. למרות שהוא ישים לתחומים רבים של מחקר עור, למודל xenograft יש תפוקה נמוכה יותר מאשר למחקרים במבחנה והוא חסר את הקלות של מניפולציה גנטית המשמשת במודלים של עכברים. נקודות הזמן במודל זה עשויות לנוע בין שבועות לחודשים, והשתלה מוצלחת דורשת מתקנים וציוד מתאימים לביצוע ניתוחים אלה. עם זאת, מודל xenograft מספק הקשר ביולוגי ופיזיולוגי לניסויים, בעוד שמערכות תרבית אורגנואידיות, כגון explants רקמות, דורשות לעתים קרובות שכפול של מספר עצום של חלקים נעים, כגון אותות אקסוגניים, במרווחי זמן ספציפיים⁷. לכן, מודל זה מנוצל בצורה הטובה ביותר כדי לאמת עוד יותר ממצאים שנצפו במבחנה ובתוך מודלים של עכברים, או לעבודה שאינה אפשרית ביולוגית אחרת. שימוש נכון במודל xenograft מספק הזדמנות ייחודית לחקור ולתפעל רקמות אנושיות שלמות in vivo.

אופטימיזציה של מודל השתלת העור xenograft הסתמכה על עשרות שנים של מחקר כדי לשמור על שלמות השתל לאורך זמן. קריטי לתהליך זה הוא שימוש בעכבר קולטן שרשרת הגמא (NSG) של סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2, אשר חסר תאי חיסון מסתגלים מסוג B ו-T, תאי NK מתפקדים, ויש לו ליקויים במקרופאגים ובתאים דנדריטיים⁸. האופי החיסוני של מארחי NSG אלה מאפשר השתלה של תאים המטופויאטיים אנושיים, סרטן שמקורו בחולה ועור ^8,9,10. למרות הסביבה המארחת המדכאת את מערכת החיסון, דיכוי נוסף של תגובות חיסוניות נויטרופיליות של עכברים על-ידי מתן anti-GR1 נחוץ להצלחת השתל¹⁰. המחסומים העיקריים בהשתלת רקמה שלמה הם זיהום, דחייה וקושי לבסס מחדש את זרימת הדם לשתל, מה שמוביל לעיתים לאובדן שלמות העור והאפידרמיס¹¹. טכניקות הכוללות מתן אנטי-FR1 ושימוש בעומק השתל המתאים משפרות את הישרדות השתל¹⁰. אופטימיזציה קפדנית מאפשרת לבצע השתלות עור של קסנוגרפט אנושי בעכברי NSG עם יעילות גבוהה ושיעורי הישרדות, הנעים בין 90%-100%.

Protocol

המחקר הנוכחי אושר ובוצע בהתאם לפרוטוקולי UCSF IACUC (AN191105-01H) ו-IRB (13-11307). דגימות עור, שהושלכו כחלק מהליכים כירורגיים אלקטיביים שגרתיים, כגון תיקון בקע, שימשו למחקר הנוכחי. דגימות העור אינן מזוהות ומאושרות כ-Not Human Subjects Research או, אם נדרש מידע מזהה קליני לניתוחים במורד הזרם, המטופלים סיפקו הסכמה בכתב תחת פרוטוקול IRB 13-11307. לא נעשה שימוש בקריטריונים אחרים של הכללה או הדרה. במחקר הועסקו עכברי NSG משני המינים, בני 8-10 שבועות. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. עיבוד דגימת עור אנושית של תורם

הערה: דגימת העור האנושית ששימשה להשתלה זו הייתה דגימה גדולה שנאספה מבטנו של חולה בריא. המדגם חייב להיות לפחות 15 ס"מ x 7.5 ס"מ. מגבלות גודל עשויות להשפיע על מספר העכברים שעבורם העור זמין ועל בחירת גודל השתל.

1. יש לשמור על דגימת העור בטמפרטורות קרות (על קרח; 4°C) לפני ההכנה וההשתלה. שמור את הדגימה לחה בכוס איסוף דגימות סגורה עם הגזה ספוגה בתמיסת מלח אפופת פוספטים (PBS).
   הערה: לא מומלץ לאחסן את דגימת העור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יותר מיומיים. עם זאת, קיימים דיווחים שבהם דגימות העור מאוחסנות למשך זמן רב יותר¹².
   אזהרה: טפלו בכל הרקמות האנושיות באמצעי זהירות ביולוגיים סטנדרטיים.
2. היכונו לדרמטומט את דגימת העור האנושית במכסה רכיית תרבית בלחץ שלילי מעוקר על לוח דיסקציה מעוקר.
3. מניחים את דגימת העור, בצד האפידרמיס כלפי מעלה, על לוח הנתיחה. נגבו את האפידרמיס עם כרית הכנה סטרילית לאלכוהול ולאחר מכן עם PBS.
4. הצמידו את הקצה הקרוב יותר של העור למקומו בעזרת פין T בחיתוך 1.5 (ראו טבלת חומרים).
5. דרמטום דגימת העור בעובי 400 מיקרומטר, תוך הפעלת לחץ יציב תוך כדי חיתוך קדימה בזווית של 30°-45°. בצע את כל ההוראות ואמצעי הבטיחות הספציפיים למכשיר (ראה טבלת חומרים).
   הערה: לפרטים על טכניקת הדרמטום, ראה דוח^{שפורסם בעבר 13}.
6. הכינו צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 20 מ"מ על ידי הנחת גזה סטרילית ספוגה ב-PBS סטרילי בתחתית המנה. מניחים את העור, בצד האפידרמיס כלפי מעלה, על הגזה הרטובה.
7. אטמו וכיסו את שולי הלוחות בסרט איטום שקוף למחצה (ראו טבלת חומרים) כדי לוודא שהדגימה אינה מזוהמת. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4° צלזיוס לפני ההשתלה.

2. התניה והכנה לפני הניתוח

1. הכינו את המכשירים הסטריליים ותחנת ניתוח סטרילית להשתלה. השתמש במגבות נייר אוטומטיות כמשטחים סטריליים למיקום המכשיר והעכבר.
   הערה: עכברים עשויים להיות מושתלים לאחר הגמילה, אך עדיף להשתיל אותם בין הגילאים 8-10 שבועות. עכברים משני המינים עשויים להיות מושתלים.
2. בצע את ההכנה הכירורגית, כגון הסרת שיער, באזור המופרד פיזית מתחנת הניתוח.
3. הכינו את האנטי-GR1 (ראו טבלת חומרים) על ידי דילול ל-1 מ"ג/מ"ל במלח סטרילי. מינון כל עכבר עם 100 מיקרוגרם/100 μL של תמיסה נגד GR1 intraperitoneally לאחר אינדוקציה הרדמה.
4. הרדמת העכברים, בזה אחר זה, באיזופלוראן או בחומרי הרדמה אחרים שאושרו על ידי מוסד.
   הערה: יש לתת איזופלוראן בריכוז של 3%-5% במהלך האינדוקציה. ברגע שהעכבר חסר תנועה, יש להוריד את ריכוז האיזופלוראן ל-1%-3% למשך הניתוח.
   1. עקוב אחר העכבר לעומק הרדמה מתאים על ידי התבוננות בקצב הנשימה, היעדר תגובת צביטה בבוהן וצבע ורוד מתאים של האוזניים והפה.
      אזהרה: השתמש במכונות הרדמה מתאימות ובשיטות חיטוי, והימנע מחשיפה לאדי איזופלורן.
5. העבירו את העכבר למשטח חימום או למקור חום אחר (ראו טבלת חומרים).
6. לתת את משחת העיניים על ידי טפיחה טיפה קטנה של משחה על העין עם אצבע כפפות.
7. מתן משככי כאבים בופרנורפין (0.08 מ"ג/ק"ג) וקרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים) באופן תת עורי על ידי צביטה בעור והזרקה בזווית מקבילה לגוף.
   הערה: הכינו את משכך הכאבים שלפני הטיפול בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים. עקוב אחר הנחיות מוסדיות לבחירה וניהול של משככי כאבים. השיטה של משכך כאבים המשמשת במחקר זה מתוארת בשלב 2.7 ובאיור משלים 1.
8. מתן anti-GR1 (מוכן בשלב 2.4) intraperitonely על ידי הרמה קלה של העכבר על ידי הזנב, חשיפת הבטן, והזרקת בזווית של 30° באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל (12.7 מ"מ).
9. השתמשו בקוצץ חשמלי בטוח לבעלי חיים (ראו טבלת חומרים) כדי לגלח את החלקים האמצעיים והעליונים של הצד הגבי של העכבר.
10. נקו את כל השיער ומרחו כמות נדיבה של משחה להסרת שיער על העור המגולח למשך 30 שניות עד דקה.
11. נגבו לחלוטין משחה להסרת שיער עם מגבת נייר ו-PBS.

3. הליך השתלה

1. העבירו את העכבר למיקום כירורגי משני, הרחק מתחנת הסרת השיער.
2. לעקר את האתר הכירורגי עם מקל ספוגית היוד בתנועה מעגלית, החל באמצע ולהתאמן לכיוון קצה האזור depilated.
3. מניחים חתיכת ניילון נצמד סטרילי מעל העכבר וחותכים חלון בניילון מעט גדול יותר מגודל האזור המיועד להשתלה.
4. חתכו חלק בצורת מלבן בגודל 10 מ"מ על 10 מ"מ של עור התורם כדי להשתיל אותו באזמל. עשו זאת על ידי החזקה איתנה של עור התורם במקומו עם החלק האחורי של המלקחיים וחיתוך לצד המלקחיים עם האזמל.
5. באמצעות המספריים הכירורגיים, חותכים אזור מלבני של עור העכבר התואם את גודל פיסת העור התורמת, ויוצרים מיטת השתלה. השתמשו במלקחיים כדי למשוך את העור הרחק מהגוף, וחתכו את העור עם המספריים בזווית הרחק מהגוף כדי להימנע מחיתוך עמוק לתוך החזית.
6. הניחו את פיסת העור של התורם, בצד האפידרמיס כלפי מעלה, על מיטת השתל המוכנה.
7. באמצעות החלק האחורי של המלקחיים, לתמרן את העור, מחליק קדימה ואחורה עד שהעור התורם שוכב שטוח לחלוטין על מיטת השתל.
8. יש להוסיף טיפות של דבק דבק כירורגי (ראו טבלת חומרים) במקום בו עור התורם פוגש את עור העכבר ולהחזיק את עור העכבר והתורם יחד עם מלקחיים למשך 1-2 שניות כך שהדבק יידבק לרקמות. יש לאטום לחלוטין את קצה השתל ולאפשר לדבק להתייבש במלואו.
9. חבשו את העכברים (איור 1) בהתאם לשלבים הבאים.
   1. חותכים חתיכת גזה פטרולאטום (ראו טבלת חומרים) גדולה מספיק כדי לכסות את אזור השתל לחלוטין.
   2. מכסים את השתל עם גזה פטרולאטום, ולחץ קלות את הגזה על העור באמצעות מלקחיים.
   3. חותכים רצועה של סרט שקוף לאורכו כך שהרוחב גדול מספיק כדי לכסות את הפצע של העכבר.
   4. לחץ בחוזקה על הלבשת הסרט השקוף, צד דבק למטה, מעל הגזה. גלגלו במהירות את העכבר כדי לעטוף את ההלבשה כולה סביב פלג הגוף העליון, כדי להבטיח שהיא תתאים היטב מבלי לפגוע בנשימה וכל הגפיים יהיו חופשיות לתנועה.
   5. הנח את העכבר בכלוב שחזור ונטר אותו עד שהוא ערני ומסתובב. ספק מקור חום בחלק מהכלוב למשך 15 דקות לפחות לאחר ההתאוששות.
      הערה: בעלי החיים צפויים להתאושש תוך 1-5 דקות לאחר הצבתם בכלוב ההתאוששות.
10. לשכן את העכברים לאחר השתלה.
11. מתן משכך כאבים לאחר הניתוח כנדרש על פי פרוטוקולים מוסדיים.
    הערה: בופרנורפין (0.08 מ"ג/ק"ג) ניתן באופן תת-עורי 4-6 שעות מאוחר יותר במהלך המחקר הנוכחי.

4. הליכים לאחר הניתוח

1. הזריקו 100 μL (100 מיקרוגרם) של אנטי-GR1 תוך-צפקית לאחר 4 ימים, 7 ימים ו-11 ימים לאחר ההשתלה כדי למנוע דחיית שתלים (איור משלים 1).
2. יש להחליף את התחבושות לפי הצורך ואם הן מוסרות על ידי עכברים.
3. חבשו מחדש את כל העכברים ביום 7.
4. הסירו את התחבושות ביום ה-14.
5. עקוב אחר העכברים אחר סימנים של דחיית שתלים ודלקת מערכתית (ירידה במשקל, נשירת שיער, עייפות קיצונית).
6. קוטפים את העכברים בין 3 ל-6 שבועות לאחר ההשתלה.
   1. הרדמת העכברים באמצעות מתן פחמן דו-חמצני (_{CO 2}) המבוקר על ידי הרגולטור ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
      הערה: פעל בהתאם להנחיות המוסדיות להמתת חסד.
   2. נתחו את שתלי העור מהעכברים¹⁴. מניחים חלק מהשתל ב-10% פורמלין למשך 24 שעות לפני הטמעת פרפין וחיתוך להכתמת היסטולוגיה⁹.
   3. טחנו את שתלי העור במספריים ועיכלו באופן אנזימטי עם 250 יב"ל/מ"ל של קולגןאז IV ו-0.02 מ"ג/מ"ל של DNase במדיה של תרביות תאים למשך הלילה. הכתימו את התאים עבור סמנים משטחים ותוך-תאיים בעקבות ההליך שתואר קודם^{לכן 14}.

תוצאות

קסנוגרפטים לעור האדם בוצעו על עכברי NSG בתוך מתקן בעלי חיים סופר-מחסום. ההצלחה הוגדרה על ידי הישרדות ממושכת של עכברים ועכברים ובריאות התנהגותית של עכברים לאחר ההשתלה. הישרדות לקויה במהלך השבוע שלאחר הניתוח נצפתה בתחילה כחסם הגדול ביותר להצלחת הניסוי, כאשר עד 50% מהעכברים נזקקו להמתת חסד. שיפ...

Discussion

מודל השתלת העור של xenograft של העכבר הוא טכניקה מרכזית לניתוח מכניסטי של תגובות חיסוניות של עור אנושי בסביבה in vivo ¹⁴. השתלות מוצלחות של קסנוגרפט עור מסתמכות על הכנה מתאימה של עכברים ודגימות עור ועכברים והיצמדות לשיטות ניתוח מכרסמים אספטיים¹⁵. קירור מהיר ואחסון נכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye