Ксенотрансплантатная модель кожи для манипулирования иммунными реакциями человека In Vivo

Резюме

Настоящий протокол описывает, как трансплантировать кожу человека мышам, не страдающим ожирением диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG). В отчет включено подробное описание подготовки кожи человека к пересадке, подготовки мышей к пересадке, трансплантации расщепленной кожи человека и процедуры посттрансплантационного восстановления.

Аннотация

Модель ксенотрансплантата кожи человека, в которой донорская кожа человека пересаживается иммунодефицитному мышиному хозяину, является важным вариантом для трансляционных исследований в иммунологии кожи. Мышиная и человеческая кожа существенно различаются по анатомии и составу иммунных клеток. Поэтому традиционные мышиные модели имеют ограничения для дерматологических исследований и открытия лекарств. Тем не менее, успешные ксенотрансплантаты являются технически сложными и требуют оптимальной подготовки образца и участка трансплантата мыши для выживания трансплантата и хозяина. Настоящий протокол предоставляет оптимизированную технику для трансплантации кожи человека мышам и обсуждает необходимые соображения для последующих экспериментальных целей. В этом отчете описывается надлежащая подготовка образца кожи донора человека, сборка хирургической установки, подготовка мыши и хирургического участка, трансплантация кожи и послеоперационный мониторинг. Соблюдение этих методов позволяет поддерживать ксенотрансплантаты в течение более 6 недель после операции. Методы, описанные ниже, обеспечивают максимальную эффективность прививки благодаря разработке инженерных средств контроля, стерильной техники и пред- и послеоперационного кондиционирования. Соответствующая производительность модели ксенотрансплантата приводит к получению образцов долгоживущих трансплантатов кожи человека для экспериментальной характеристики кожи человека и доклинического тестирования соединений in vivo.

Введение

Мышиные модели часто используются для того, чтобы делать выводы о биологии и болезнях человека, отчасти из-за их экспериментальной воспроизводимости и способности к генетическим манипуляциям. Однако физиология мышей не полностью повторяет системы органов человека, особенно кожи, и поэтому имеет ограничения для использования в качестве доклинической модели при разработке лекарств¹. Анатомические различия между кожей мыши и человека включают различия в толщине и архитектуре эпителия, отсутствие мышиных эккриновых потовых желез и вариации в круговороте волос². Кроме того, как врожденные, так и адаптивные ветви иммунной системы расходятся между двумя видами³. Кожа мыши содержит уникальную иммунную популяцию дендритных эпидермальных Т-клеток (DETC), имеет более высокое обилие дермальных γδ-Т-клеток и варьируется по локализации подмножества иммунных клеток по сравнению с тканями человека⁴. Таким образом, экспериментальные результаты, касающиеся биологии кожи человека и воспаления, выигрывают от проверки с человеческими тканями. В то время как системы культуры in vitro и органоидные культуры широко используются для изучения тканей человека, эти системы ограничены отсутствующим или неполным восстановлением иммунитета и отсутствием связи с периферической сосудистой системой⁵. Гуманизированная модель трансплантации кожи ксенотрансплантата направлена на то, чтобы позволить терапевтические или биологические манипуляции с иммунными и неиммунными путями в тканях человека in vivo.

Модель ксенотрансплантата кожи человека была использована для изучения физиологии и фармакологии кожи, анализа иммунного отторжения и реакций, анализа механизмов рака кожи человека и понимания кожных заболеваний и заживления ран⁶. Хотя модель ксенотрансплантата применима к нескольким областям исследований кожи, она имеет более низкую пропускную способность, чем исследования in vitro , и ей не хватает простоты генетических манипуляций, используемых в мышиных моделях. Временные точки в этой модели могут варьироваться от недель до месяцев, и для успешной трансплантации требуются соответствующие средства и оборудование для выполнения этих операций. Тем не менее, модель ксенотрансплантата обеспечивает биологический и физиологический контекст для экспериментов, в то время как системы органоидных культур, такие как тканевые экспланты, часто требуют воспроизведения множества движущихся частей, таких как экзогенные сигналы, через определенные промежутки времени⁷. Поэтому эту модель лучше всего использовать для дальнейшей проверки результатов, наблюдаемых in vitro и в мышиных моделях, или для работы, которая в противном случае биологически невозможна. Надлежащее использование модели ксенотрансплантата дает уникальную возможность изучать и манипулировать неповрежденными тканями человека in vivo.

Оптимизация модели пересадки кожи ксенотрансплантата опиралась на десятилетия исследований для сохранения целостности трансплантата с течением времени. Критически важным для этого процесса является использование мыши без ожирения диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG), у которого отсутствуют B и T-адаптивные иммунные клетки, функциональные NK-клетки и недостатки в макрофагах и дендритных клетках⁸. Иммунодефицитная природа этих хозяев NSG позволяет трансплантировать человеческие кроветворные клетки, рак пациента и кожу ^8,9,10. Несмотря на эту иммуносупрессивную среду хозяина, дополнительное подавление нейтрофильных иммунных реакций мышей путем введения анти-GR1 необходимо для успеха трансплантата¹⁰. Основными препятствиями при пересадке неповрежденной ткани являются инфекция, отторжение и трудности с восстановлением притока крови к трансплантату, иногда приводящие к потере кожной и эпидермальной целостности¹¹. Методы, включая введение анти-FR1 и использование соответствующей глубины трансплантата, улучшают выживаемость трансплантата¹⁰. Тщательная оптимизация позволяет выполнять пересадку кожи ксенотрансплантата человека на мышах NSG с высокой эффективностью и выживаемостью, в пределах 90%-100%.

протокол

Настоящее исследование было одобрено и выполнено в соответствии с протоколами UCSF IACUC (AN191105-01H) и IRB (13-11307). Образцы кожи, выброшенные в рамках обычных плановых хирургических процедур, таких как грыжесечение, были использованы для настоящего исследования. Образцы кожи либо деидентифицированы и сертифицированы как Not Human Subjects Research, либо, если для последующего анализа требуется клинически идентифицирующая информация, пациенты предоставили письменное согласие в соответствии с протоколом IRB 13-11307. Никаких других критериев включения или исключения не использовалось. В исследовании были задействованы мыши NSG любого пола, в возрасте 8-10 недель. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Обработка донорского образца кожи человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Образец кожи человека, использованный при этой трансплантации, представлял собой большой образец, собранный из брюшной полости здорового пациента. Размер образца должен быть не менее 15 см х 7,5 см. Ограничения по размеру могут повлиять на количество мышей, для которых доступна кожа, и на выбор размера трансплантата.

1. Поддерживайте образец кожи при низких температурах (на льду; 4°C) перед подготовкой и трансплантацией. Держите образец влажным в закрытой чашке для сбора образцов с марлей, смоченной в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить образец кожи при температуре 4 °C дольше 2 дней не рекомендуется. Однако существуют отчеты, в которых образцы кожи хранятся в течение более длительного времени¹².
   ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте все ткани человека стандартными мерами предосторожности в отношении биологической опасности.
2. Подготовьте к дерматому образец кожи человека в стерилизованном вытяжке для культивирования тканей с отрицательным давлением на стерилизованной рассеченной доске.
3. Поместите образец кожи, эпидермис стороной вверх, на рассеченную доску. Протрите эпидермис стерильной спиртовой прокладкой, а затем PBS.
4. Закрепите более близкий край кожи на месте рассекающим Т-штифтом 1,5 дюйма (см. Таблицу материалов).
5. Дерматом является образец кожи толщиной 400 мкм, прикладывая устойчивое давление при разрезании вперед под углом 30°-45°. Следуйте всем инструкциям и мерам безопасности для конкретного прибора (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о технике дерматома, пожалуйста, смотрите ранее опубликованный отчет¹³.
6. Приготовьте чашку Петри размером 100 мм х 20 мм, поместив на дно тарелки стерильную марлю, смоченную в стерильной PBS. Поместите кожу, эпидермис стороной вверх, на влажную марлю.
7. Запечатайте и покройте края пластин полупрозрачной уплотнительной пленкой (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что образец не загрязнен. Храните образец при температуре 4°C перед трансплантацией.

2. Предоперационное кондиционирование и подготовка

1. Подготовьте стерильные инструменты и стерильную хирургическую станцию для трансплантации. Используйте автоклавные бумажные полотенца в качестве стерильных поверхностей для размещения инструментов и мышей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши могут быть привиты после отъема, но предпочтительно привиты в возрасте 8-10 недель. Мыши любого пола могут быть привиты.
2. Выполните хирургическую подготовку, такую как удаление волос, в области, физически отделенной от хирургической станции.
3. Готовят анти-GR1 (см. Таблицу материалов), разбавляя его до 1 мг/мл в стерильном физиологическом растворе. Дозируйте каждую мышь со 100 мкг/100 мкл раствора анти-GR1 внутрибрюшинно после индукции анестезии.
4. Обезболивайте мышей, по одной, изофлураном или другими институционально одобренными анестетиками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран необходимо давать в концентрации 3%-5% во время индукции. Как только мышь станет неподвижной, уменьшите концентрацию изофлурана до 1%-3%, чтобы действовать в течение всего периода операции.
   1. Следите за состоянием мыши на предмет соответствующей глубины анестезии, наблюдая за частотой дыхания, отсутствием реакции на защемление пальцев ног и соответствующей розовой окраской ушей и рта.
      ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие анестезирующие механизмы и методы очистки и избегайте воздействия паров изофлурана.
5. Перенесите мышь на грелку или другой источник тепла (см. Таблицу материалов).
6. Ввести офтальмологическую мазь, нанеся небольшую каплю мази на глаз пальцем в перчатке.
7. Вводят анальгетики Бупренорфин (0,08 мг/кг) и Карпрофен (5 мг/кг) (см. Таблицу материалов) подкожно путем защемления кожи и введения под углом, параллельным телу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте обезболивание перед лечением в соответствии с институциональными протоколами. Следуйте институциональным рекомендациям по выбору и введению анальгетиков. Метод обезболивания, используемый в данном исследовании, описан на этапе 2.7 и дополнительном рисунке 1.
8. Вводят анти-GR1 (приготовленный на стадии 2.4) внутрибрюшинно, слегка поднимая мышь за хвост, обнажая брюшко и вводя под углом 30° с использованием шприца инсулина 1 мл (12,7 мм).
9. Используйте безопасные для животных электрические кусачки (см. Таблицу материалов), чтобы побрить среднюю и верхнюю части спинной стороны мыши.
10. Очистите все волосы и нанесите обильное количество мази для удаления волос на бритую кожу на 30 с - 1 мин.
11. Полностью протрите мазь для удаления волос бумажным полотенцем и PBS.

3. Процедура трансплантации

1. Переместите мышь во вторичное хирургическое место, вдали от станции удаления волос.
2. Стерилизуйте место операции палочкой йодного тампона круговыми движениями, начиная с середины и отрабатывая к краю депилированной области.
3. Поместите кусок стерильной полиэтиленовой пленки на мышь и вырежьте в пластике окно, немного превышающее размер области, подлежащей прививке.
4. Вырежьте прямоугольную часть донорской кожи размером 10 мм х 10 мм для пересадки скальпелем. Сделайте это, крепко удерживая донорскую кожу на месте тыльной стороной щипцов и разрезая рядом щипцы скальпелем.
5. Используя хирургические ножницы, отрежьте прямоугольную область кожи мыши, соответствующую размеру куска кожи донора, создав трансплантатную кровать. Используйте щипцы, чтобы оттянуть кожу от тела, и срежьте кожу ножницами, расположенными под углом от тела, чтобы избежать глубокого врезания в лицевую часть.
6. Поместите кусок донорской кожи, эпидермис стороной вверх, на подготовленную трансплантатную кровать.
7. Используя заднюю часть щипцов, манипулируйте кожей, скользя взад и вперед, пока донорская кожа не ляжет совершенно ровно на ложе трансплантата.
8. Добавьте капли хирургического клеевого тканевого клея (см. Таблицу материалов), где донорская кожа встречается с кожей мыши и удерживайте кожу мыши и донора вместе с щипцами в течение 1-2 с, чтобы клей прилип к тканям. Полностью запечатайте край трансплантата и дайте клею полностью высохнуть.
9. Перевяжите мышей (рисунок 1), следуя приведенным ниже шагам.
   1. Вырежьте кусок вазелиновой марли (см. Таблицу материалов), достаточно большой, чтобы полностью покрыть область трансплантата.
   2. Накройте трансплантат вазелиновой марлей и слегка прижмите марлю к коже с помощью щипцов.
   3. Вырежьте полоску прозрачной пленки, повязочной вдоль, чтобы ширина была достаточно большой, чтобы покрыть рану мыши.
   4. Плотно прижмите прозрачную пленку повязкой, клейкой стороной вниз, поверх марли. Быстро сверните мышь, чтобы полностью обернуть повязку вокруг туловища, гарантируя, что она плотно прилегает, не препятствуя дыханию, и все конечности свободны для движения.
   5. Поместите мышь в клетку для восстановления и следите за ней, пока она не насторожится и не будет двигаться. Обеспечьте источник тепла на части клетки в течение не менее 15 минут после рекуперации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что животные выздоровеют в течение 1-5 минут после помещения их в клетку восстановления.
10. Поодиночке размещают мышей после прививки.
11. Назначать послеоперационную анальгезию в соответствии с требованиями институциональных протоколов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин (0,08 мг/кг) вводили подкожно через 4-6 ч во время настоящего исследования.

4. Послеоперационные процедуры

1. Вводят 100 мкл (100 мкг) анти-GR1 внутриперитонеально через 4 дня, 7 дней и 11 дней после трансплантации, чтобы предотвратить отторжение трансплантата (дополнительный рисунок 1).
2. Заменяйте бинты по мере необходимости и при снятии мышами.
3. Перегруппируйте всех мышей на 7-й день.
4. Снимите повязки на 14 день.
5. Следите за мышами на наличие признаков отторжения трансплантата и системного воспаления (потеря веса, выпадение волос, крайняя вялость).
6. Собирайте у мышей от 3 до 6 недель после трансплантата.
   1. Усыпляют мышей с помощью контролируемого регулятором введения углекислого газа (CO₂) с последующим вывихом шейки матки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте институциональным рекомендациям по эвтаназии.
   2. Рассекайте кожные трансплантаты у мышей¹⁴. Поместите часть трансплантата в 10% формалин в течение 24 ч перед встраиванием и сечением парафина для гистологического окрашивания⁹.
   3. Измельчите кожные трансплантаты ножницами и переваривайте ферментативно с 250 МЕ/мл коллагеназы IV и 0,02 мг/мл ДНКазы в клеточных культуральных средах в течение ночи. Окрашивают клетки для поверхностных и внутриклеточных маркеров в соответствии с ранее описанной процедурой¹⁴.

Результаты

Ксенотрансплантаты человеческой кожи были выполнены на мышах NSG внутри супербарьерного животного объекта. Успех был определен длительным выживанием трансплантата и мыши и поведенческим здоровьем мышей после трансплантации. Плохая выживаемость в течение недели после операции первон...

Обсуждение

Модель пересадки кожи ксенотрансплантата мыши является ключевым методом механистического препарирования иммунных реакций кожи человека в условиях in vivo ¹⁴. Успешная трансплантация ксенотрансплантата кожи зависит от соответствующей подготовки мышей и образцов кожи ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye