Modèle de peau de xénogreffe pour manipuler les réponses immunitaires humaines in vivo

Résumé

Le présent protocole décrit comment greffer de la peau humaine sur des souris non obèses diabétiques (NOD)-SCID à récepteur de la chaîne gamma (NSG) diabétiques (NOD). Une description détaillée de la préparation de la peau humaine pour la transplantation, de la préparation des souris pour la transplantation, de la transplantation de la peau humaine d’épaisseur fendue et de la procédure de récupération post-transplantation est incluse dans le rapport.

Résumé

Le modèle de xénogreffe de peau humaine, dans lequel la peau d’un donneur humain est transplantée sur un hôte souris immunodéficient, est une option importante pour la recherche translationnelle en immunologie de la peau. La peau murine et la peau humaine diffèrent considérablement dans l’anatomie et la composition des cellules immunitaires. Par conséquent, les modèles murins traditionnels ont des limites pour la recherche dermatologique et la découverte de médicaments. Cependant, les xénotransplantations réussies sont techniquement difficiles et nécessitent une préparation optimale du site de greffe et du greffon de souris pour la survie du greffon et de l’hôte. Le présent protocole fournit une technique optimisée pour la transplantation de peau humaine sur des souris et discute des considérations nécessaires pour les objectifs expérimentaux en aval. Ce rapport décrit la préparation appropriée d’un échantillon de peau de donneur humain, l’assemblage d’une installation chirurgicale, la préparation de souris et de sites chirurgicaux, la transplantation de peau et la surveillance post-chirurgicale. L’adhésion à ces méthodes permet le maintien des xénogreffes pendant plus de 6 semaines après la chirurgie. Les techniques décrites ci-dessous permettent une efficacité maximale de greffage grâce au développement de contrôles techniques, de techniques stériles et de conditionnement pré et post-chirurgical. La performance appropriée du modèle de xénogreffe permet d’obtenir des échantillons de greffe de peau humaine à longue durée de vie pour la caractérisation expérimentale de la peau humaine et les essais précliniques de composés in vivo.

Introduction

Les modèles murins sont fréquemment utilisés pour faire des inférences sur la biologie humaine et la maladie, en partie en raison de leur reproductibilité expérimentale et de leur capacité de manipulation génétique. Cependant, la physiologie de la souris ne récapitule pas complètement les systèmes d’organes humains, en particulier la peau, et présente donc des limites pour être utilisée comme modèle préclinique dans le développement de médicaments¹. Les différences anatomiques entre la peau de souris et la peau humaine comprennent des différences d’épaisseurs épithéliales et d’architecture, l’absence de glandes sudoripares eccrines murines et des variations dans le cycle des cheveux². De plus, les bras innés et adaptatifs du système immunitaire divergent entre les deux espèces³. La peau de souris contient une population immunitaire unique de lymphocytes T épidermiques dendritiques (DETC), a une plus grande abondance de cellules T γδ dermiques et varie dans la localisation du sous-ensemble de cellules immunitaires par rapport au tissu humain⁴. Par conséquent, les résultats expérimentaux concernant la biologie de la peau humaine et l’inflammation bénéficient d’une validation avec des tissus humains. Alors que les systèmes de culture in vitro et organoïdes sont des outils largement utilisés pour étudier les tissus humains, ces systèmes sont limités par une reconstitution immunitaire absente ou incomplète et un manque de connexion au système vasculaire périphérique⁵. Le modèle de greffe de peau de xénogreffe humanisée vise à permettre la manipulation thérapeutique ou biologique des voies immunitaires et non immunitaires dans les tissus humains in vivo.

Le modèle de xénogreffe de peau humaine a été utilisé pour étudier la physiologie et la pharmacologie de la peau, analyser le rejet immunitaire et les réponses, disséquer les mécanismes du cancer de la peau humaine et comprendre les maladies de la peau et la cicatrisation des plaies⁶. Bien qu’applicable à de multiples domaines de recherche sur la peau, le modèle de xénogreffe a un débit inférieur à celui des études in vitro et n’a pas la facilité de manipulation génétique utilisée dans les modèles murins. Les périodes de ce modèle peuvent varier de quelques semaines à quelques mois, et une greffe réussie nécessite des installations et un équipement appropriés pour effectuer ces chirurgies. Cependant, le modèle de xénogreffe fournit un contexte biologique et physiologique aux expériences, tandis que les systèmes de culture organoïdes, tels que les explants tissulaires, nécessitent souvent la réplication d’une myriade de pièces mobiles, telles que des signaux exogènes, à des intervalles de temps spécifiques⁷. Par conséquent, il est préférable d’utiliser ce modèle pour valider davantage les résultats observés in vitro et dans des modèles murins, ou pour des travaux qui ne sont pas autrement réalisables sur le plan biologique. L’utilisation appropriée du modèle de xénogreffe offre une occasion unique d’étudier et de manipuler des tissus humains intacts in vivo.

L’optimisation du modèle de greffe de peau de xénogreffe s’est appuyée sur des décennies de recherche pour préserver l’intégrité du greffon au fil du temps. L’utilisation de la souris non obèse diabétique (NOD)-scid à récepteur de la chaîne gamma (NSG) de l’interleukine-2, qui manque de cellules immunitaires adaptatives B et T, de cellules NK fonctionnelles et présente des déficiences en macrophages et en cellules dendritiques⁸. La nature immunodéficiente de ces hôtes NSG permet la transplantation de cellules hématopoïétiques humaines, de cancers dérivés de patients et de peau ^8,9,10. Malgré cet environnement hôte immunosuppresseur, une suppression supplémentaire des réponses immunitaires neutrophiles de la souris par administration d’anti-GR1 est nécessaire pour le succès du greffon¹⁰. Les principaux obstacles à la transplantation de tissus intacts sont l’infection, le rejet et la difficulté à rétablir le flux sanguin vers le greffon, entraînant parfois une perte d’intégrité cutanée et épidermique¹¹. Les techniques telles que l’administration d’anti-FR1 et l’utilisation d’une profondeur de greffe appropriée améliorent la survie du greffon¹⁰. Une optimisation méticuleuse permet d’effectuer des greffes de peau de xénogreffe humaine sur des souris NSG avec des taux d’efficacité et de survie élevés, allant de 90% à 100%.

Protocole

La présente étude a été approuvée et réalisée conformément aux protocoles UCSF IACUC (AN191105-01H) et IRB (13-11307). Des échantillons de peau, jetés dans le cadre d’interventions chirurgicales électives de routine, telles que la réparation d’une hernie, ont été utilisés pour la présente recherche. Les échantillons de peau sont soit anonymisés et certifiés comme étant des sujets non humains, soit, si des renseignements d’identification clinique sont requis pour les analyses en aval, les patients ont donné leur consentement écrit en vertu du protocole 13-11307 de la CISR. Aucun autre critère d’inclusion ou d’exclusion n’a été utilisé. Des souris NSG des deux sexes, âgées de 8 à 10 semaines, ont été employées dans l’étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Traitement de l’échantillon de peau humaine du donneur

REMARQUE : L’échantillon de peau humaine utilisé dans cette greffe était un grand échantillon prélevé dans l’abdomen d’un patient en bonne santé. L’échantillon doit mesurer au moins 15 cm x 7,5 cm. Les limites de taille peuvent affecter le nombre de souris pour lesquelles la peau est disponible et le choix de la taille du greffon.

1. Conserver l’échantillon de peau à des températures froides (sur glace; 4 °C) avant la préparation et la greffe. Gardez l’échantillon humide dans une tasse de prélèvement fermée avec la gaze imbibée de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE: Il n’est pas recommandé de conserver l’échantillon de peau à 4 °C pendant plus de 2 jours. Cependant, il existe des rapports où les échantillons de peau sont stockés plus longtemps¹².
   ATTENTION : Traiter tous les tissus humains avec des précautions standard contre les risques biologiques.
2. Préparez-vous à dermatomater l’échantillon de peau humaine dans une hotte de culture tissulaire stérilisée à pression négative sur une planche de dissection stérilisée.
3. Placez l’échantillon de peau, côté épiderme vers le haut, sur la planche de dissection. Essuyez l’épiderme avec un tampon de préparation à l’alcool stérile, puis avec PBS.
4. Épinglez le bord le plus proche de la peau en place avec une broche en T de 1,5 en dissection (voir le tableau des matériaux).
5. Dermatome l’échantillon de peau à une épaisseur de 400 μm, en appliquant une pression constante tout en coupant vers l’avant à un angle de 30°-45°. Suivez toutes les instructions et mesures de sécurité propres à l’instrument (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Pour plus de détails sur la technique dermatome, veuillez consulter un rapport publié précédemment¹³.
6. Préparez une boîte de Petri de 100 mm x 20 mm en plaçant une gaze stérile imbibée de PBS stérile au fond de la boîte. Placez la peau, côté épiderme vers le haut, sur la gaze humide.
7. Scellez et recouvrez les bords de la plaque avec un film d’étanchéité semi-transparent (voir le tableau des matériaux) pour vous assurer que l’échantillon n’est pas contaminé. Conservez l’échantillon à 4 °C avant la greffe.

2. Conditionnement et préparation préopératoires

1. Préparez les instruments stériles et une station chirurgicale stérile pour la greffe. Utilisez des serviettes en papier autoclavées comme surfaces stériles pour le placement des instruments et de la souris.
   REMARQUE: Les souris peuvent être greffées après le sevrage, mais sont de préférence greffées entre 8 et 10 semaines. Des souris des deux sexes peuvent être greffées.
2. Effectuer la préparation chirurgicale, telle que l’épilation, dans une zone physiquement séparée du poste chirurgical.
3. Préparer l’anti-GR1 (voir le tableau des matières) en le diluant à 1 mg/mL dans une solution saline stérile. Administrer 100 μg/100 μL à chaque souris de la solution anti-GR1 par voie intrapéritonéale après induction de l’anesthésie.
4. Anesthésiez les souris, une à la fois, avec de l’isoflurane ou d’autres anesthésiques approuvés par l’institution.
   NOTE: L’isoflurane doit être administré à une concentration de 3% à 5% pendant l’induction. Une fois que la souris est immobile, abaissez la concentration d’isoflurane à 1%-3% pour effectuer pendant toute la durée de la chirurgie.
   1. Surveillez la profondeur appropriée de l’anesthésie de la souris en observant la fréquence respiratoire, l’absence de réponse de pincement des orteils et la coloration rose appropriée des oreilles et de la bouche.
      ATTENTION : Utilisez des machines anesthésiques et des méthodes de récupération appropriées, et évitez l’exposition aux vapeurs d’isoflurane.
5. Transférez la souris sur un coussin chauffant ou une autre source de chaleur (voir le tableau des matériaux).
6. Administrer la pommade ophtalmique en tamponnant une petite goutte de pommade sur l’œil avec un doigt ganté.
7. Administrer les analgésiques Buprénorphine (0,08 mg/kg) et Carprofène (5 mg/kg) (voir le tableau des matières) par voie sous-cutanée en pinçant la peau et en injectant à un angle parallèle au corps.
   REMARQUE : Préparer l’analgésie prétraitement en suivant les protocoles institutionnels. Suivre les directives institutionnelles pour la sélection et l’administration des analgésiques. La méthode d’analgésie utilisée dans cette étude est décrite à l’étape 2.7 et à la figure supplémentaire 1.
8. Administrer l’anti-GR1 (préparé à l’étape 2.4) par voie intrapéritonéale en soulevant légèrement la souris par la queue, en exposant l’abdomen et en l’injectant à un angle de 30° à l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL (12,7 mm).
9. Utilisez des tondeuses électriques sans danger pour les animaux (voir le tableau des matériaux) pour raser les parties médiane et supérieure de la face dorsale de la souris.
10. Effacez tous les poils et appliquez une quantité généreuse de pommade dépilatoire sur la peau rasée pendant 30 s à 1 min.
11. Essuyez complètement la pommade épilatoire avec une serviette en papier et du PBS.

3. Procédure de transplantation

1. Transférez la souris dans un emplacement chirurgical secondaire, loin du poste d’épilation.
2. Stérilisez le site chirurgical avec le bâtonnet d’écouvillon d’iode dans un mouvement circulaire, en commençant par le milieu et en travaillant vers le bord de la zone épilée.
3. Placez un morceau de pellicule de plastique stérile sur la souris et coupez une fenêtre dans le plastique légèrement plus grande que la taille de la zone à greffer.
4. Couper une partie rectangulaire de 10 mm x 10 mm de peau de donneur à greffer avec un scalpel. Pour ce faire, maintenez fermement la peau du donneur en place avec l’arrière de la pince et coupez le long de la pince avec le scalpel.
5. À l’aide des ciseaux chirurgicaux, coupez une zone rectangulaire de peau de souris correspondant à la taille de la pièce de peau du donneur, créant ainsi un lit de greffe. Utilisez des pinces pour éloigner la peau du corps et coupez la peau avec les ciseaux inclinés loin du corps pour éviter de couper profondément dans le visage.
6. Placez le morceau de peau du donneur, côté épiderme vers le haut, sur le lit de greffe préparé.
7. À l’aide de l’arrière des forceps, manipulez la peau en glissant d’avant en arrière jusqu’à ce que la peau du donneur repose complètement à plat contre le lit de greffe.
8. Ajouter des gouttes d’adhésif pour tissu de colle chirurgicale (voir le tableau des matériaux) à l’endroit où la peau du donneur rencontre la peau de la souris et maintenir la peau de la souris et du donneur ensemble avec une pince pendant 1-2 s afin que la colle adhère aux tissus. Scellez complètement le bord de la greffe et laissez la colle sécher complètement.
9. Bandez les souris (Figure 1) en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Coupez un morceau de gaze de vaseline (voir le tableau des matériaux) assez grand pour couvrir complètement la zone de greffe.
   2. Couvrir la greffe avec la gaze de vaseline et appuyer légèrement la gaze contre la peau à l’aide d’une pince.
   3. Coupez une bande d’un pansement transparent dans le sens de la longueur afin que la largeur soit assez grande pour couvrir la blessure de la souris.
   4. Appuyez fermement sur le pansement de film transparent, côté adhésif vers le bas, sur la gaze. Faites rouler rapidement la souris pour enrouler complètement le pansement autour du torse, en vous assurant qu’il s’adapte bien sans entraver la respiration et que tous les membres sont libres de mouvement.
   5. Placez la souris dans une cage de récupération et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit alerte et se déplace. Fournir une source de chaleur sur une partie de la cage pendant au moins 15 minutes après la récupération.
      REMARQUE : On s’attend à ce que les animaux se rétablissent dans un délai de 1 à 5 minutes après les avoir placés dans la cage de récupération.
10. Abriter individuellement les souris après greffe.
11. Administrer l’analgésie post-chirurgicale tel que requis par les protocoles de l’établissement.
    REMARQUE : La buprénorphine (0,08 mg/kg) a été administrée par voie sous-cutanée 4 à 6 heures plus tard au cours de la présente étude.

4. Interventions post-chirurgicales

1. Injecter 100 μL (100 μg) d’anti-GR1 par voie intrapéritonéale 4 jours, 7 jours et 11 jours après la greffe pour prévenir le rejet du greffon (Figure supplémentaire 1).
2. Remplacez les bandages au besoin et s’ils sont enlevés par des souris.
3. Rebander toutes les souris le jour 7.
4. Retirez les bandages le jour 14.
5. Surveillez les souris pour détecter les signes de rejet de greffe et d’inflammation systémique (perte de poids, perte de cheveux, léthargie extrême).
6. Récolter les souris entre 3 et 6 semaines après la greffe.
   1. Euthanasier les souris par administration de dioxyde de carbone (CO₂) contrôlée par régulateur suivie d’une luxation cervicale.
      REMARQUE : Suivez les lignes directrices de l’établissement pour l’euthanasie.
   2. Disséquer les greffes de peau des souris¹⁴. Placer une partie du greffon dans du formol à 10% pendant 24 h avant l’enrobage de la paraffine et la section pour la coloration histologique⁹.
   3. Hacher les greffes de peau avec des ciseaux et les digérer par voie enzymatique avec 250 UI/mL de collagénase IV et 0,02 mg/mL de DNase dans des milieux de culture cellulaire pendant la nuit. Colorer les cellules pour les marqueurs de surface et intracellulaires en suivant la procédure décrite précédemment¹⁴.

Résultats

Des xénogreffes de peau humaine ont été effectuées sur des souris NSG à l’intérieur d’une animalerie super-barrière. Le succès a été défini par la survie prolongée du greffon et de la souris et la santé comportementale des souris après la greffe. Une faible survie au cours de la semaine suivant la chirurgie a d’abord été observée comme le plus grand obstacle au succès expérimental, avec jusqu’à 50% des souris nécessitant une euthanasie. L’amélioration de la technique stérile et un meilleu...

Discussion

Le modèle de greffe de peau de xénogreffe de souris est une technique clé pour disséquer mécaniquement les réponses immunitaires de la peau humaine dans un contexte in vivo ¹⁴. Le succès des greffes de xénogreffes cutanées repose sur une préparation appropriée de souris et d’échantillons de peau et de souris et sur l’adhésion aux méthodes de chirurgie aseptique des rongeurs¹⁵. Un refroidissement rapide et un entreposage approprié des échantillon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye