Modelo de piel de xenoinjerto para manipular las respuestas inmunes humanas in vivo

Resumen

El presente protocolo describe cómo injertar piel humana en ratones diabéticos no obesos (NOD)-scid receptor de cadena gamma (NSG) con interleucina-2. En el informe se incluye una descripción detallada de la preparación de la piel humana para el trasplante, la preparación de ratones para el trasplante, el trasplante de piel humana de espesor dividido y el procedimiento de recuperación posterior al trasplante.

Resumen

El modelo de xenoinjerto de piel humana, en el que la piel de un donante humano se trasplanta a un huésped de ratón inmunodeficiente, es una opción importante para la investigación traslacional en inmunología de la piel. La piel murina y humana difieren sustancialmente en anatomía y composición de células inmunes. Por lo tanto, los modelos tradicionales de ratón tienen limitaciones para la investigación dermatológica y el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, los xenotrasplantes exitosos son técnicamente desafiantes y requieren una preparación óptima del sitio de injerto de muestra y ratón para la supervivencia del injerto y del huésped. El presente protocolo proporciona una técnica optimizada para trasplantar piel humana en ratones y discute las consideraciones necesarias para los objetivos experimentales posteriores. Este informe describe la preparación adecuada de una muestra de piel de donante humano, el ensamblaje de una configuración quirúrgica, la preparación del ratón y del sitio quirúrgico, el trasplante de piel y el monitoreo postquirúrgico. La adherencia a estos métodos permite el mantenimiento de los xenoinjertos durante más de 6 semanas después de la cirugía. Las técnicas descritas a continuación permiten la máxima eficiencia de injerto debido al desarrollo de controles de ingeniería, técnica estéril y acondicionamiento pre y postquirúrgico. El rendimiento adecuado del modelo de xenoinjerto da como resultado muestras de injerto de piel humana de larga vida para la caracterización experimental de la piel humana y las pruebas preclínicas de compuestos in vivo.

Introducción

Los modelos de ratón se utilizan con frecuencia para hacer inferencias sobre la biología humana y la enfermedad, en parte debido a su reproducibilidad experimental y capacidad de manipulación genética. Sin embargo, la fisiología del ratón no recapitula completamente los sistemas de órganos humanos, particularmente la piel, y por lo tanto tiene limitaciones para su uso como modelo preclínico en el desarrollo de fármacos¹. Las diferencias anatómicas entre la piel del ratón y la humana incluyen diferencias en el grosor epitelial y la arquitectura, la falta de glándulas sudoríparas ecrinas murinas y las variaciones en el ciclo del cabello². Además, tanto el brazo innato como el adaptativo del sistema inmune son divergentes entre las dos especies³. La piel de ratón contiene una población inmune única de células T epidérmicas dendríticas (DETC), tiene una mayor abundancia de células T γδ dérmicas y varía en la localización de subconjuntos de células inmunes en comparación con el tejido humano⁴. Por lo tanto, los hallazgos experimentales sobre la biología de la piel humana y la inflamación se benefician de la validación con tejido humano. Mientras que los sistemas de cultivo in vitro y organoides son herramientas ampliamente utilizadas para estudiar el tejido humano, estos sistemas están limitados por la reconstitución inmune ausente o incompleta y la falta de conexión con la vasculatura periférica⁵. El modelo humanizado de trasplante de piel de xenoinjerto tiene como objetivo permitir la manipulación terapéutica o biológica de las vías inmunes y no inmunes en tejidos humanos in vivo.

El modelo de xenoinjerto de piel humana se ha utilizado para estudiar la fisiología y farmacología de la piel, analizar el rechazo inmune y las respuestas, diseccionar los mecanismos del cáncer de piel humano y comprender las enfermedades de la piel y la cicatrización de heridas⁶. Si bien es aplicable a múltiples campos de investigación de la piel, el modelo de xenoinjerto tiene un rendimiento menor que los estudios in vitro y carece de la facilidad de manipulación genética empleada en modelos de ratón. Los puntos de tiempo dentro de este modelo pueden variar de semanas a meses, y el injerto exitoso requiere instalaciones y equipos adecuados para realizar estas cirugías. Sin embargo, el modelo de xenoinjerto proporciona contexto biológico y fisiológico a los experimentos, mientras que los sistemas de cultivo de organoides, como los explantes de tejidos, a menudo requieren replicar una miríada de partes móviles, como señales exógenas, a intervalos de tiempo específicos⁷. Por lo tanto, este modelo se utiliza mejor para validar aún más los hallazgos observados in vitro y dentro de modelos de ratón, o para trabajos que no son biológicamente factibles. El uso apropiado del modelo de xenoinjerto ofrece una oportunidad única para estudiar y manipular tejido humano intacto in vivo.

La optimización del modelo de trasplante de piel de xenoinjerto se ha basado en décadas de investigación para preservar la integridad del injerto a lo largo del tiempo. Fundamental para este proceso es utilizar el ratón receptor de cadena gamma (NSG) diabético no obeso (NOD)-scid interleucina-2, que carece de células inmunes adaptativas B y T, células NK funcionales y tiene deficiencias en macrófagos y células dendríticas⁸. La naturaleza inmunodeficiente de estos huéspedes NSG permite el trasplante de células hematopoyéticas humanas, cánceres derivados de pacientes y piel ^8,9,10. A pesar de este ambiente inmunosupresor del huésped, la supresión adicional de las respuestas inmunes neutrofílicas del ratón mediante la administración anti-GR1 es necesaria para el éxito del injerto¹⁰. Los principales obstáculos en el trasplante de tejido intacto son la infección, el rechazo y la dificultad para restablecer el flujo sanguíneo al injerto, lo que a veces conduce a la pérdida de integridad dérmica y epidérmica¹¹. Las técnicas que incluyen la administración de anti-FR1 y el uso de una profundidad de injerto adecuada mejoran la supervivencia del injerto¹⁰. La optimización meticulosa permite realizar trasplantes de piel de xenoinjerto humano en ratones NSG con altas tasas de eficiencia y supervivencia, que oscilan entre el 90% y el 100%.

Protocolo

El presente estudio fue aprobado y realizado de acuerdo con los protocolos UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Para la presente investigación se utilizaron muestras de piel, descartadas como parte de procedimientos quirúrgicos electivos de rutina, como la reparación de hernias. Las muestras de piel se desidentifican y se certifican como Investigación con sujetos no humanos o, si se requiere información de identificación clínica para los análisis posteriores, los pacientes proporcionaron un consentimiento por escrito bajo el protocolo IRB 13-11307. No se utilizaron otros criterios de inclusión o exclusión. En el estudio se emplearon ratones NSG de ambos sexos, de 8 a 10 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).

1. Procesamiento de la muestra de piel humana del donante

NOTA: La muestra de piel humana utilizada en este trasplante fue una muestra grande recolectada del abdomen de un paciente sano. La muestra debe ser de al menos 15 cm x 7,5 cm. Las limitaciones de tamaño pueden afectar el número de ratones para los que hay piel disponible y la elección del tamaño del injerto.

1. Mantener la muestra de piel a temperaturas frías (sobre hielo; 4°C) antes de la preparación y el injerto. Mantenga la muestra húmeda en una taza cerrada de recolección de muestras con la gasa empapada en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: No se recomienda almacenar la muestra de piel a 4 °C durante más de 2 días. Sin embargo, existen informes en los que las muestras de piel se almacenan durante más tiempo¹².
   PRECAUCIÓN: Trate todo el tejido humano con las precauciones estándar de riesgo biológico.
2. Prepárese para dermatomar la muestra de piel humana en una campana de cultivo de tejido esterilizada con presión negativa en una placa de disección esterilizada.
3. Coloque la muestra de piel, con la epidermis hacia arriba, en la tabla de disección. Limpie la epidermis con una almohadilla estéril de preparación de alcohol y luego con PBS.
4. Fije el borde más cercano de la piel en su lugar con un pasador en T de disección de 1.5 pulgadas (consulte la Tabla de materiales).
5. Dermata la muestra de piel a un espesor de 400 μm, aplicando una presión constante mientras se corta hacia adelante en un ángulo de 30°-45°. Siga todas las instrucciones y medidas de seguridad específicas del instrumento (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Para obtener detalles sobre la técnica del dermatoma, consulte un informe publicado anteriormente¹³.
6. Prepare una placa de Petri de 100 mm x 20 mm colocando una gasa estéril empapada en PBS estéril en el fondo del plato. Coloque la piel, con el lado de la epidermis hacia arriba, sobre la gasa húmeda.
7. Selle y cubra los bordes de la placa con una película de sellado semitransparente (consulte la Tabla de materiales) para asegurarse de que la muestra no esté contaminada. Conservar la muestra a 4°C antes del injerto.

2. Acondicionamiento y preparación preoperatoria

1. Prepare los instrumentos estériles y una estación quirúrgica estéril para el injerto. Use toallas de papel esterilizadas en autoclave como superficies estériles para la colocación de instrumentos y ratones.
   NOTA: Los ratones pueden ser injertados después del destete, pero son preferiblemente injertados entre las 8-10 semanas de edad. Se pueden injertar ratones de ambos sexos.
2. Realice la preparación quirúrgica, como la depilación, en un área físicamente separada de la estación quirúrgica.
3. Prepare el anti-GR1 (ver Tabla de materiales) diluyéndolo a 1 mg/ml en solución salina estéril. Dosificar cada ratón con 100 μg/100 μL de la solución anti-GR1 por vía intraperitoneal después de la inducción de la anestesia.
4. Anestesiar a los ratones, uno a la vez, con isoflurano u otros anestésicos aprobados institucionalmente.
   NOTA: El isoflurano debe administrarse a una concentración del 3% al 5% durante la inducción. Una vez que el ratón esté inmóvil, reduzca la concentración de isoflurano a 1% -3% para efectuar durante la duración de la cirugía.
   1. Controle el ratón para determinar la profundidad adecuada de la anestesia observando la frecuencia respiratoria, la ausencia de respuesta de pellizco del dedo del pie y la coloración rosada adecuada de las orejas y la boca.
      PRECAUCIÓN: Use maquinaria anestésica y métodos de eliminación apropiados, y evite la exposición a vapores de isoflurano.
5. Transfiera el ratón a una almohadilla térmica u otra fuente de calor (consulte la Tabla de materiales).
6. Administre el ungüento oftálmico frotando una pequeña gota de ungüento en el ojo con un dedo enguantado.
7. Administrar analgésicos buprenorfina (0,08 mg/kg) y carprofeno (5 mg/kg) (ver Tabla de materiales) por vía subcutánea pellizcando la piel e inyectando en ángulo paralelo al cuerpo.
   NOTA: Preparar la analgesia pre-tratamiento siguiendo protocolos institucionales. Seguir las pautas institucionales para la selección y administración de analgésicos. El método de analgesia utilizado en este estudio se describe en el paso 2.7 y en la Figura complementaria 1.
8. Administrar el anti-GR1 (preparado en el paso 2.4) por vía intraperitoneal levantando ligeramente el ratón por la cola, exponiendo el abdomen e inyectando en un ángulo de 30° con una jeringa de insulina de 1 ml (12,7 mm).
9. Use cortapelos eléctricos seguros para animales (consulte la Tabla de materiales) para afeitar las partes media y superior del lado dorsal del ratón.
10. Limpie todo el vello y aplique una cantidad generosa de ungüento depilatorio sobre la piel afeitada durante 30 s a 1 min.
11. Limpie completamente el ungüento depilatorio con una toalla de papel y PBS.

3. Procedimiento de trasplante

1. Transfiera el ratón a un lugar quirúrgico secundario, lejos de la estación de depilación.
2. Esterilice el sitio quirúrgico con la varilla de hisopo de yodo en un movimiento circular, comenzando en el medio y trabajando hacia el borde del área depilada.
3. Coloque un trozo de envoltura de plástico estéril sobre el mouse y corte una ventana en el plástico ligeramente más grande que el tamaño del área a injertar.
4. Corte una porción en forma de rectángulo de 10 mm x 10 mm de piel donante para ser injertada con un bisturí. Haga esto sosteniendo firmemente la piel del donante en su lugar con la parte posterior de los fórceps y cortando junto a los fórceps con el bisturí.
5. Usando las tijeras quirúrgicas, corte un área rectangular de piel de ratón que coincida con el tamaño de la pieza de piel del donante, creando un lecho de injerto. Use fórceps para separar la piel del cuerpo y corte la piel con las tijeras en ángulo lejos del cuerpo para evitar cortar profundamente la facia.
6. Coloque la pieza de piel del donante, con la epidermis hacia arriba, sobre el lecho de injerto preparado.
7. Usando la parte posterior de los fórceps, manipule la piel, deslizándose hacia adelante y hacia atrás hasta que la piel del donante quede completamente plana contra el lecho del injerto.
8. Agregue gotas de adhesivo de tejido de pegamento quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) donde la piel del donante se encuentre con la piel del ratón y sostenga la piel del ratón y del donante junto con pinzas durante 1-2 s para que el pegamento se adhiera a los tejidos. Selle completamente el borde del injerto y deje que el pegamento se seque completamente.
9. Vendar los ratones (Figura 1) siguiendo los pasos a continuación.
   1. Corte un trozo de gasa de vaselina (consulte la Tabla de materiales) lo suficientemente grande como para cubrir completamente el área del injerto.
   2. Cubra el injerto con la gasa de vaselina y presione ligeramente la gasa contra la piel con fórceps.
   3. Corte una tira de un apósito de película transparente a lo largo para que el ancho sea lo suficientemente grande como para cubrir la herida del ratón.
   4. Presione firmemente el apósito de película transparente, con el lado adhesivo hacia abajo, sobre la gasa. Haga rodar rápidamente el ratón para envolver el apósito completamente alrededor del torso, asegurándose de que se ajuste bien sin impedir la respiración y que todas las extremidades estén libres para el movimiento.
   5. Coloque el ratón en una jaula de recuperación y monitoréelo hasta que esté alerta y en movimiento. Proporcione una fuente de calor en una parte de la jaula durante al menos 15 minutos después de la recuperación.
      NOTA: Se espera que los animales se recuperen dentro de 1-5 minutos después de colocarlos en la jaula de recuperación.
10. Alojar individualmente a los ratones después del injerto.
11. Administrar analgesia postquirúrgica según lo exijan los protocolos institucionales.
    NOTA: La buprenorfina (0,08 mg/kg) se administró por vía subcutánea 4-6 h más tarde durante el presente estudio.

4. Procedimientos postquirúrgicos

1. Inyecte 100 μL (100 μg) de anti-GR1 por vía intraperitoneal a los 4 días, 7 días y 11 días después del injerto para prevenir el rechazo del injerto (Figura complementaria 1).
2. Reemplace los vendajes según sea necesario y si los ratones los quitan.
3. Vuelva a vendar a todos los ratones el día 7.
4. Retire los vendajes el día 14.
5. Controle a los ratones para detectar signos de rechazo del injerto e inflamación sistémica (pérdida de peso, pérdida de cabello, letargo extremo).
6. Cosechar los ratones entre 3 y 6 semanas después del injerto.
   1. Eutanasia a los ratones a través de la administración de dióxido de carbono (CO₂) controlada por el regulador seguida de dislocación cervical.
      NOTA: Siga las pautas institucionales para la eutanasia.
   2. Diseccionar los injertos de piel de los ratones¹⁴. Colocar una porción del injerto en formalina al 10% durante 24 h antes de la incrustación y seccionamiento de parafina para tinción histológica⁹.
   3. Picar los injertos de piel con tijeras y digerir enzimáticamente con 250 UI / ml de colagenasa IV y 0,02 mg / ml de DNasa en medios de cultivo celular durante la noche. Teñir las células para marcadores superficiales e intracelulares siguiendo el procedimiento descrito anteriormente¹⁴.

Resultados

Se realizaron xenoinjertos de piel humana en ratones NSG dentro de una instalación de animales de súper barrera. El éxito se definió por la supervivencia prolongada del injerto y del ratón y la salud conductual de los ratones después del trasplante. La mala supervivencia durante la semana posterior a la cirugía se observó inicialmente como la mayor barrera para el éxito experimental, con hasta el 50% de los ratones que requieren eutanasia. La mejora de la técnica estéril y un mejor soporte de las temperaturas ...

Discusión

El modelo de trasplante de piel de xenoinjerto de ratón es una técnica clave para diseccionar mecánicamente las respuestas inmunes de la piel humana en un entorno in vivo ¹⁴. El éxito de los trasplantes de xenoinjerto de piel se basa en la preparación adecuada de ratones y muestras de piel y ratones y en la adherencia a los métodos de cirugía aséptica con roedores¹⁵. El enfriamiento rápido y el almacenamiento adecuado de muestras de piel a temperaturas fr?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye