생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종이식 피부 모델

요약

본 프로토콜은 비비만 당뇨병(NOD)-scid 인터루킨-2 감마사슬 수용체(NSG) 마우스에 인간 피부를 이식하는 방법을 설명합니다. 이식을 위한 인간 피부의 준비, 이식을 위한 마우스의 준비, 분할 두께의 인간 피부의 이식 및 이식 후 회복 절차에 대한 자세한 설명이 보고서에 포함되어 있습니다.

초록

인간 기증자 피부를 면역결핍 마우스 숙주에 이식하는 인간 피부 이종이식 모델은 피부 면역학의 중개 연구를 위한 중요한 옵션입니다. 뮤린 및 인간의 피부는 해부학적 및 면역 세포 조성에서 실질적으로 상이하다. 따라서 전통적인 마우스 모델은 피부과 연구 및 약물 발견에 한계가 있습니다. 그러나 성공적인 이종 이식은 기술적으로 어렵고 이식 및 숙주 생존을 위해 최적의 표본 및 마우스 이식 부위 준비가 필요합니다. 본 프로토콜은 마우스 상에 인간 피부를 이식하기 위한 최적화된 기술을 제공하고 다운스트림 실험 목표에 필요한 고려사항을 논의한다. 이 보고서는 인간 기증자 피부 샘플의 적절한 준비, 수술 설정의 조립, 마우스 및 수술 부위 준비, 피부 이식 및 수술 후 모니터링을 설명합니다. 이러한 방법을 준수하면 수술 후 6 주 이상 이종 이식편을 유지할 수 있습니다. 아래에 설명된 기술은 엔지니어링 제어, 멸균 기술 및 수술 전 및 수술 후 컨디셔닝의 개발로 인해 최대 이식 효율성을 허용합니다. 이종이식 모델의 적절한 성능은 인간 피부의 실험적 특성화 및 생체내 화합물의 전임상 시험을 위한 수명이 긴 인간 피부 이식편 샘플을 초래합니다.

서문

마우스 모델은 인간 생물학 및 질병에 대한 추론을 위해 자주 사용되며, 부분적으로는 실험적 재현성과 유전자 조작 능력 때문입니다. 그러나, 마우스 생리학은 인간 장기 시스템, 특히 피부를 완전히 재현하지 못하므로,^{약물 개발에서} 전임상 모델로 사용하기에는 한계가 있다1. 마우스와 인간 피부의 해부학적 차이에는 상피 두께와 구조의 차이, 쥐 에크린 땀샘의 부족, 모발 순환의 변화가^{포함됩니다2.} 또한, 면역계의 선천적 팔과 적응 팔은 두 종 사이에서 갈라진다³. 마우스 피부는 수지상 표피 T 세포 (DETC)의 독특한 면역 집단을 함유하고, 진피 γδ T 세포의 풍부함이 더 많으며, 인간 조직과 비교하여 면역 세포 하위 집합 국소화가 다양합니다⁴. 따라서 인간 피부 생물학 및 염증에 관한 실험 결과는 인간 조직을 사용한 검증의 이점을 얻습니다. 시험관 내 및 오가노이드 배양 시스템은 인체 조직을 연구하기 위해 널리 활용되는 도구이지만, 이러한 시스템은 부재하거나 불완전한 면역 재구성 및 말초 혈관구조에 대한 연결 부족으로 인해^{제한됩니다5.} 인간화 이종이식 피부 이식 모델은 생체 내에서 인간 조직에서 면역 및 비면역 경로의 치료적 또는 생물학적 조작을 허용하는 것을 목표로 합니다.

인간 피부 이종이식 모델은 피부 생리학 및 약리학을 연구하고, 면역 거부 반응 및 반응을 분석하고, 인간 피부암 메커니즘을 해부하고, 피부 질환 및^{상처 치유를} 이해하는 데 활용되었습니다6. 피부 연구의 여러 분야에 적용 할 수 있지만, 이종 이식 모델은 시험관 내 연구보다 처리량이 낮고 마우스 모델에 사용되는 유전자 조작의 용이성이 부족합니다. 이 모델 내의 시점은 몇 주에서 몇 달까지 다양할 수 있으며 성공적인 이식을 위해서는 이러한 수술을 수행하기 위한 적절한 시설과 장비가 필요합니다. 그러나 이종이식 모델은 실험에 생물학적 및 생리학적 맥락을 제공하는 반면, 조직 외식편과 같은 유기체 배양 시스템은 종종 특정 시간 간격으로 외인성 신호와 같은 무수한 움직이는 부분을 복제해야^합니다7. 따라서 이 모델은 시험관 내 및 마우스 모델 내에서 관찰된 결과를 추가로 검증하거나 생물학적으로 실현 가능하지 않은 작업에 가장 잘 활용됩니다. 이종이식 모델의 적절한 사용은 생체 내에서 온전한 인간 조직을 연구하고 조작할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다.

이종이식 피부 이식 모델의 최적화는 시간이 지남에 따라 이식편 무결성을 보존하기 위해 수십 년의 연구에 의존해 왔습니다. 이 과정에서 중요한 것은 B 및 T 적응 면역 세포, 기능성 NK 세포가 부족하고 대 식세포 및 수지상 세포⁸이 결핍 된 비 비만 당뇨병 (NOD) - scid 인터루킨 -2 감마 사슬 수용체 (NSG) 마우스를 활용하는 것입니다. 이들 NSG 숙주의 면역결핍 성질은 인간 조혈 세포, 환자-유래 암, 및 피부 ^8,9,10의 이식을 허용한다. 이러한 면역억제 숙주 환경에도 불구하고, 이식 성공¹⁰을 위해서는 항-GR1 투여에 의한 마우스 호중구 면역 반응의 추가의 억제가 필요하다. 손상되지 않은 조직을 이식하는 데 있어 주요 장애물은 감염, 거부 및 이식편으로의 혈류 재설정의 어려움이며 때로는 피부 및 표피 완전성의 손실로 이어집니다¹¹. 항-FR1의 투여 및 적절한 이식 깊이의 사용을 포함하는 기술은 이식편 생존을 개선한다¹⁰. 세심한 최적화를 통해 NSG 마우스에서 인간 이종 이식 피부 이식을 90 % -100 % 범위의 높은 효율성과 생존율로 수행 할 수 있습니다.

프로토콜

본 연구는 UCSF IACUC (AN191105-01H) 및 IRB (13-11307) 프로토콜에 따라 승인되고 수행되었다. 탈장 복구와 같은 일상적인 선택적 수술 절차의 일부로 폐기 된 피부 샘플이 본 연구에 사용되었습니다. 피부 샘플은 비식별화되고 비인간 피험자 연구로 인증되거나, 다운스트림 분석을 위해 임상적으로 식별 정보가 필요한 경우 환자는 IRB 프로토콜 13-11307에 따라 서면 동의를 제공했습니다. 다른 포함 또는 제외 기준은 사용되지 않았습니다. 어느 한 성별의, 8-10주령의 NSG 마우스를 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조).

1. 기증자 인간 피부 샘플 처리

참고: 이 이식에 사용된 인간 피부 샘플은 건강한 환자의 복부에서 수집된 큰 샘플이었습니다. 샘플은 15cm x 7.5cm 이상이어야합니다. 크기 제한은 피부를 사용할 수 있는 마우스의 수와 이식편 크기의 선택에 영향을 미칠 수 있습니다.

1. 준비 및 이식하기 전에 피부 샘플을 차가운 온도 (얼음 위, 4 ° C)로 유지하십시오. 인산염 완충 식염수(PBS)에 거즈를 적신 상태로 밀폐된 검체 수집 컵에 시료를 촉촉하게 유지하십시오.
   알림: 피부 샘플을 4°C에서 2일 이상 보관하는 것은 권장하지 않습니다. 그러나, 피부 샘플이 더 오랜 시간 동안 저장되는 보고가 존재한다¹².
   주의 : 모든 인체 조직을 표준 생물학적 위험 예방 조치로 처리하십시오.
2. 인간 피부 샘플을 멸균된 해부 보드 상의 멸균된 음압 조직 배양 후드에서 박피할 준비를 한다.
3. 피부 샘플을 표피 쪽이 위로 향하게 하여 해부 보드에 놓습니다. 멸균 알코올 준비 패드로 표피를 닦은 다음 PBS로 닦습니다.
4. 해부 T- 핀으로 피부의 더 가까운 가장자리를 제자리에 고정합니다 ( 재료 표 참조).
5. 피부 표본을 400μm 두께로 피부화하고 일정한 압력을 가하면서 30°-45° 각도로 앞으로 절단합니다. 모든 기기별 지침과 안전 조치를 따르십시오( 재료 표 참조).
   참고: 피부 분열 기술에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 보고서¹³을 참조하십시오.
6. 접시 바닥에 멸균 PBS에 적신 멸균 거즈를 놓아 100mm x 20mm 페트리 접시를 준비합니다. 피부가 위로 향하도록 피부를 젖은 거즈 위에 놓습니다.
7. 샘플이 오염되지 않도록 반투명 밀봉 필름( 재료 표 참조)으로 플레이트 가장자리를 밀봉하고 덮습니다. 접목 전에 샘플을 4°C에서 보관하십시오.

2. 수술 전 컨디셔닝 및 준비

1. 이식을 위해 멸균기구와 멸균 수술 스테이션을 준비하십시오. 고압 멸균 된 종이 타월을 기기 및 마우스 배치를위한 멸균 표면으로 사용하십시오.
   참고: 마우스는 이유 후 접목할 수 있지만 생후 8-10주 사이에 접목하는 것이 좋습니다. 두 성별의 마우스를 이식 할 수 있습니다.
2. 수술실에서 물리적으로 분리된 부위에서 제모와 같은 수술 준비를 수행합니다.
3. 항-GR1( 재료 표 참조)을 멸균 식염수에 1mg/mL로 희석하여 준비합니다. 마취 유도 후 각 마우스에 100μg/100μL의 항-GR1 용액을 복강 내 투여합니다.
4. 마우스를 한 번에 하나씩 이소플루란 또는 기타 기관적으로 승인된 마취제로 마취하십시오.
   참고: 이소플루란은 유도 중에 3%-5% 농도로 투여해야 합니다. 마우스가 움직이지 않으면 수술 기간 동안 효과가 있도록 이소플루란 농도를 1%-3%로 낮춥니다.
   1. 호흡수, 발가락 핀치 반응의 부재, 귀와 입의 적절한 분홍색 착색을 관찰하여 적절한 마취 깊이에 대해 마우스를 모니터링합니다.
      주의 : 적절한 마취 기계 및 청소 방법을 사용하고 이소 플루 란 증기에 노출되지 않도록하십시오.
5. 마우스를 가열 패드 또는 다른 열원으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
6. 장갑을 낀 손가락으로 눈에 작은 연고 방울을 두드려 안과 연고를 투여하십시오.
7. 진통제 부 프레 노르 핀 (0.08 mg / kg)과 카프로 펜 (5 mg / kg) ( 재료 표 참조)을 피부를 꼬집고 신체와 평행 한 각도로 주사하여 피하 투여하십시오.
   참고: 기관 프로토콜에 따라 치료 전 진통제를 준비하십시오. 진통제의 선택 및 관리에 대한 제도적 지침을 따르십시오. 이 연구에서 사용 된 진통 방법은 2.7 단계 및 보충 그림 1에 요약되어 있습니다.
8. 마우스를 꼬리로 약간 들어 올리고, 복부를 노출시키고, 인슐린 1mL (12.7mm) 주사기를 사용하여 30 ° 각도로 주사하여 항 GR1 (2.4 단계에서 제조)을 복강 내 투여합니다.
9. 동물에 안전한 전기 클리퍼( 재료 표 참조)를 사용하여 마우스 등쪽의 중간 및 윗부분을 면도합니다.
10. 모든 모발을 지우고 면도한 피부에 30초에서 1분 동안 충분한 양의 제모 연고를 바르십시오.
11. 종이 타월과 PBS로 제모 연고를 완전히 닦아냅니다.

3. 이식 절차

1. 마우스를 제모 스테이션에서 떨어진 보조 수술 위치로 옮깁니다.
2. 요오드 면봉 스틱으로 수술 부위를 원으로 멸균하고 중앙에서 시작하여 탈모 부위의 가장자리쪽으로 운동합니다.
3. 마우스 위에 멸균 플라스틱 랩을 놓고 접목 할 영역의 크기보다 약간 큰 플라스틱의 창을 자릅니다.
4. 메스로 이식 할 기증자 피부의 직사각형 모양의 10mm x 10mm 부분을 자릅니다. 집게의 뒷면으로 기증자 피부를 제자리에 단단히 잡고 메스로 집게를 따라 절단하여이를 수행하십시오.
5. 수술 용 가위를 사용하여 기증자 피부 조각의 크기와 일치하는 마우스 피부의 직사각형 영역을 잘라내어 이식 침대를 만듭니다. 집게를 사용하여 몸에서 피부를 빼내고 가위를 몸에서 멀리 비스듬히 기울여 피부를 잘라 얼굴이 깊숙이 베이지 않도록 합니다.
6. 기증자 피부 조각을 표피 쪽이 위로 향하게 하여 준비된 이식편 베드에 놓습니다.
7. 집게의 뒷면을 사용하여 기증자 피부가 이식 침대에 완전히 평평해질 때까지 앞뒤로 미끄러 져 피부를 조작합니다.
8. 기증자 피부가 마우스 피부와 만나는 곳에 수술용 접착제 조직 접착제( 재료 표 참조)를 한 방울 추가하고 접착제가 조직에 부착되도록 마우스와 기증자 피부를 집게로 1-2초 동안 유지합니다. 이식편의 가장자리를 완전히 밀봉하고 접착제가 완전히 건조되도록 합니다.
9. 아래 단계에 따라 마우스(그림 1)에 붕대를 감습니다.
   1. 이식편 부위를 완전히 덮을 수있을만큼 큰 바셀린 거즈 조각 ( 재료 표 참조)을 자릅니다.
   2. 바셀린 거즈로 이식편을 덮고 집게를 사용하여 거즈를 피부에 가볍게 누르십시오.
   3. 투명 필름 드레싱 스트립을 세로로 잘라 너비가 마우스의 상처를 덮을만큼 충분히 커지도록합니다.
   4. 투명 필름 드레싱을 접착면이 아래로 향하도록 거즈 위로 단단히 누릅니다. 마우스를 빠르게 굴려 드레싱을 몸통 주위로 완전히 감싸서 호흡을 방해하지 않고 단단히 고정되고 모든 팔다리가 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
   5. 마우스를 복구 케이지에 넣고 경계하고 움직일 때까지 모니터링합니다. 회수 후 최소 15분 동안 케이지 일부에 열원을 제공하십시오.
      알림: 동물은 회복 케이지에 넣은 후 1-5 분 이내에 회복 될 것으로 예상됩니다.
10. 접목 후 마우스를 단독으로 수용하십시오.
11. 기관 프로토콜에서 요구하는 대로 수술 후 진통제를 관리합니다.
    참고 : 부 프레 노르 핀 (0.08 mg / kg)은 본 연구에서 4-6 시간 후에 피하 투여되었습니다.

4. 수술 후 절차

1. 이식 거부를 방지하기 위해 이식 후 4일, 7일 및 11일에 100μL(100μg)의 anti-GR1을 복강 내 주사합니다(보충 그림 1).
2. 필요에 따라 붕대를 교체하고 마우스로 제거한 경우 붕대를 교체하십시오.
3. 7 일째에 모든 마우스를 붕대로 감습니다.
4. 14 일에 붕대를 제거하십시오.
5. 이식 거부 및 전신 염증 (체중 감소, 탈모, 극심한 혼수 상태)의 징후가 있는지 마우스를 모니터링하십시오.
6. 이식 후 3 주에서 6 주 사이에 생쥐를 수확하십시오.
   1. 조절자-제어된 이산화탄소(_CO2) 투여를 통해 마우스를 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 이룩한다.
      참고: 안락사에 대한 제도적 지침을 따르십시오.
   2. 마우스¹⁴로부터 피부 이식편을 해부한다. 파라핀 매립 및 조직학 염색을 위한 절편 전에 24시간 동안 10% 포르말린에 이식편의 일부를 배치합니다⁹.
   3. 피부 이식편을 가위로 다지고 밤새 세포 배양 배지에서 250IU/mL의 콜라게나제 IV 및 0.02mg/mL의 DNase로 효소적으로 소화합니다. 표면 및 세포내 마커에 대한 세포를 앞서 기술된 절차¹⁴에 따라 염색한다.

결과

인간 피부 이종 이식은 슈퍼 배리어 동물 시설 내부의 NSG 마우스에서 수행되었습니다. 성공은 이식 후 마우스의 연장 이식편 및 마우스 생존 및 행동 건강에 의해 정의되었습니다. 수술 후 일주일 동안의 열악한 생존은 처음에는 실험 성공의 가장 큰 장벽으로 관찰되었으며, 마우스의 최대 50 %가 안락사를 필요로했습니다. 멸균 기술을 개선하고 수술 중 및 수술 직후 마우스 체온을 더 잘 지원하면...

토론

마우스 이종이식 피부 이식 모델은 생체내 설정¹⁴에서 인간 피부 면역 반응을 기계적으로 해부하는 핵심 기술이다. 성공적인 피부 이종 이식 이식은 마우스 및 피부 표본 및 마우스의 적절한 준비와 무균 설치류 수술 방법¹⁵의 준수에 달려 있습니다. 배지(예: 멸균 식염수)의 차가운 온도에서 피부 샘플을 급속 냉각 및 적절하게 보관하는 것은 이식 전에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye