Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie menschliche Haut auf nicht-adipöse diabetische (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Mäuse (NSG) transplantiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der menschlichen Haut für die Transplantation, der Vorbereitung von Mäusen für die Transplantation, der Transplantation der Split-Thickness der menschlichen Haut und des Wiederherstellungsverfahrens nach der Transplantation sind in dem Bericht enthalten.

Zusammenfassung

Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut, bei dem menschliche Spenderhaut auf einen immundefizienten Mauswirt transplantiert wird, ist eine wichtige Option für die translationale Forschung in der Hautimmunologie. Murine und menschliche Haut unterscheiden sich wesentlich in der Anatomie und der Zusammensetzung der Immunzellen. Daher haben traditionelle Mausmodelle Einschränkungen für die dermatologische Forschung und Arzneimittelforschung. Erfolgreiche Xenotransplantationen sind jedoch technisch anspruchsvoll und erfordern eine optimale Vorbereitung der Proben- und Maustransplantatstelle für das Überleben des Transplantats und des Wirts. Das vorliegende Protokoll bietet eine optimierte Technik zur Transplantation menschlicher Haut auf Mäuse und diskutiert notwendige Überlegungen für nachgeschaltete experimentelle Ziele. Dieser Bericht beschreibt die geeignete Vorbereitung einer menschlichen Spenderhautprobe, die Zusammenstellung eines chirurgischen Aufbaus, die Vorbereitung von Mäusen und Operationsstellen, die Hauttransplantation und die postoperative Überwachung. Die Einhaltung dieser Methoden ermöglicht die Aufrechterhaltung von Xenotransplantaten für mehr als 6 Wochen nach der Operation. Die unten beschriebenen Techniken ermöglichen eine maximale Transplantationseffizienz aufgrund der Entwicklung von technischen Kontrollen, steriler Technik und prä- und postoperativer Konditionierung. Eine angemessene Leistung des Xenograft-Modells führt zu langlebigen menschlichen Hauttransplantatproben für die experimentelle Charakterisierung der menschlichen Haut und die präklinische Prüfung von Verbindungen in vivo.

Einleitung

Mausmodelle werden häufig verwendet, um Rückschlüsse auf die menschliche Biologie und Krankheiten zu ziehen, teilweise aufgrund ihrer experimentellen Reproduzierbarkeit und Fähigkeit zur genetischen Manipulation. Die Physiologie der Maus rekapituliert jedoch menschliche Organsysteme, insbesondere die Haut, nicht vollständig und hat daher Einschränkungen für die Verwendung als präklinisches Modell in der Arzneimittelentwicklung¹. Anatomische Unterschiede zwischen Maus- und menschlicher Haut umfassen Unterschiede in der Epitheldicke und -architektur, das Fehlen von ekkrinen Schweißdrüsen der Maus und Variationen im Haarzyklus². Darüber hinaus unterscheiden sich sowohl die angeborenen als auch die adaptiven Arme des Immunsystems zwischen den beiden Spezies³. Maushaut enthält eine einzigartige Immunpopulation von dendritischen epidermalen T-Zellen (DETCs), hat eine höhere Häufigkeit von dermalen γδ-T-Zellen und variiert in der Lokalisierung von Immunzellen im Vergleich zu menschlichem Gewebe⁴. Daher profitieren experimentelle Erkenntnisse zur menschlichen Hautbiologie und Entzündung von der Validierung mit menschlichem Gewebe. Während In-vitro - und Organoid-Kultursysteme weit verbreitete Werkzeuge zur Untersuchung von menschlichem Gewebe sind, sind diese Systeme durch fehlende oder unvollständige Immunrekonstitution und eine fehlende Verbindung zum peripheren Gefäßsystem begrenzt⁵. Das humanisierte Xenograft-Hauttransplantationsmodell zielt darauf ab, die therapeutische oder biologische Manipulation von Immun- und Nicht-Immunwegen in menschlichem Gewebe in vivo zu ermöglichen.

Das Xenograft-Modell der menschlichen Haut wurde verwendet, um die Hautphysiologie und Pharmakologie zu untersuchen, Immunabstoßung und -reaktionen zu analysieren, menschliche Hautkrebsmechanismen zu analysieren und Hautkrankheiten und Wundheilung zu verstehen⁶. Obwohl das Xenograft-Modell auf mehrere Bereiche der Hautforschung anwendbar ist, hat es einen geringeren Durchsatz als In-vitro-Studien und verfügt nicht über die Leichtigkeit der genetischen Manipulation, die in Mausmodellen verwendet wird. Die Zeitpunkte innerhalb dieses Modells können von Wochen bis Monaten reichen, und eine erfolgreiche Transplantation erfordert geeignete Einrichtungen und Geräte, um diese Operationen durchzuführen. Das Xenograft-Modell liefert jedoch biologischen und physiologischen Kontext für Experimente, während organoide Kultursysteme wie Gewebeexplantate oft die Replikation einer Vielzahl von beweglichen Teilen, wie z. B. exogenen Signalen, in bestimmten Zeitintervallen erfordern⁷. Daher wird dieses Modell am besten verwendet, um Befunde, die in vitro und in Mausmodellen beobachtet wurden, weiter zu validieren oder für Arbeiten, die ansonsten biologisch nicht machbar sind. Die angemessene Verwendung des Xenograft-Modells bietet eine einzigartige Gelegenheit, intaktes menschliches Gewebe in vivo zu untersuchen und zu manipulieren.

Die Optimierung des Xenograft-Hauttransplantationsmodells stützt sich auf jahrzehntelange Forschung, um die Integrität des Transplantats im Laufe der Zeit zu erhalten. Entscheidend für diesen Prozess ist die Verwendung der nicht-adipösen diabetischen (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Maus (NSG), der B- und T-adaptive Immunzellen, funktionelle NK-Zellen fehlen und die Mängel an Makrophagen und dendritischen Zellen aufweist⁸. Die immundefiziente Natur dieser NSG-Wirte ermöglicht die Transplantation von menschlichen hämatopoetischen Zellen, von Patienten abgeleiteten Krebserkrankungen und Haut ^8,9,10. Trotz dieser immunsuppressiven Wirtsumgebung ist eine zusätzliche Unterdrückung der neutrophilen Immunantwort der Maus durch Anti-GR1-Verabreichung für den Transplantaterfolg erforderlich¹⁰. Die Haupthindernisse bei der Transplantation von intaktem Gewebe sind Infektionen, Abstoßungsreaktionen und Schwierigkeiten bei der Wiederherstellung des Blutflusses zum Transplantat, was manchmal zum Verlust der dermalen und epidermalen Integrität führt¹¹. Techniken wie die Verabreichung von Anti-FR1 und die Verwendung einer geeigneten Transplantattiefe verbessern das Überleben des Transplantats¹⁰. Eine sorgfältige Optimierung ermöglicht es, menschliche Xenograft-Hauttransplantationen an NSG-Mäusen mit hoher Effizienz und Überlebensraten von 90% bis 100% durchzuführen.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde in Übereinstimmung mit den Protokollen UCSF IACUC (AN191105-01H) und IRB (13-11307) genehmigt und durchgeführt. Hautproben, die im Rahmen routinemäßiger elektiver chirurgischer Eingriffe wie Hernienreparatur verworfen wurden, wurden für die vorliegende Forschung verwendet. Die Hautproben werden entweder anonymisiert und als Not Human Subjects Research zertifiziert oder, wenn klinisch identifizierende Informationen für nachgeschaltete Analysen erforderlich sind, haben die Patienten eine schriftliche Einwilligung gemäß IRB-Protokoll 13-11307 gegeben. Es wurden keine anderen Ein- oder Ausschlusskriterien verwendet. NSG-Mäuse beiderlei Geschlechts, 8-10 Wochen alt, wurden in der Studie eingesetzt. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Verarbeitung der menschlichen Spenderhautprobe

HINWEIS: Die menschliche Hautprobe, die bei dieser Transplantation verwendet wurde, war eine große Probe, die aus dem Bauch eines gesunden Patienten entnommen wurde. Die Probe muss mindestens 15 cm x 7,5 cm groß sein. Größenbeschränkungen können sich auf die Anzahl der Mäuse auswirken, für die Haut verfügbar ist, und auf die Wahl der Transplantatgröße.

1. Halten Sie die Hautprobe vor der Vorbereitung und Transplantation bei kalten Temperaturen (auf Eis; 4°C). Halten Sie die Probe feucht in einem geschlossenen Probenentnahmebecher, wobei die Gaze in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getränkt ist.
   HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, die Hautprobe länger als 2 Tage bei 4 °C zu lagern. Es gibt jedoch Berichte, in denen die Hautproben länger gelagert werden¹².
   VORSICHT: Behandeln Sie sämtliches menschliches Gewebe mit den üblichen Biogefahrenvorkehrungen.
2. Bereiten Sie die Dermatome der menschlichen Hautprobe in einer sterilisierten Unterdruck-Gewebekulturhaube auf einer sterilisierten Dissektionsplatte vor.
3. Legen Sie die Hautprobe, Epidermis mit der Seite nach oben, auf die Dissektionsplatte. Wischen Sie die Epidermis mit einem sterilen Alkohol-Vorbereitungspad und dann mit PBS ab.
4. Befestigen Sie den näheren Rand der Haut mit einem 1,5-Zoll-T-Stift (siehe Materialtabelle).
5. Dermatome die Hautprobe in einer Dicke von 400 μm, wobei gleichmäßiger Druck ausgeübt wird, während in einem Winkel von 30°-45° nach vorne geschnitten wird. Befolgen Sie alle gerätespezifischen Anweisungen und Sicherheitsmaßnahmen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Einzelheiten zur Dermatomtechnik finden Sie in einem zuvor veröffentlichten Bericht¹³.
6. Bereiten Sie eine 100 mm x 20 mm große Petrischale vor, indem Sie eine sterile, mit sterilem PBS getränkte Gaze auf den Boden der Schale legen. Legen Sie die Haut, Epidermis mit der Seite nach oben, auf die nasse Gaze.
7. Versiegeln und bedecken Sie die Plattenkanten mit einer halbtransparenten Dichtungsfolie (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass die Probe nicht kontaminiert ist. Lagern Sie die Probe vor dem Pfropfen bei 4° C.

2. Präoperative Konditionierung und Vorbereitung

1. Bereiten Sie die sterilen Instrumente und eine sterile Operationsstation für die Transplantation vor. Verwenden Sie autoklavierte Papierhandtücher als sterile Oberflächen für die Platzierung von Instrumenten und Mäusen.
   HINWEIS: Mäuse können nach dem Absetzen transplantiert werden, werden aber vorzugsweise im Alter von 8-10 Wochen transplantiert. Mäuse beiderlei Geschlechts können gepfropft werden.
2. Führen Sie die chirurgische Vorbereitung, wie z. B. die Haarentfernung, in einem Bereich durch, der physisch von der chirurgischen Station getrennt ist.
3. Bereiten Sie den Anti-GR1 (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie ihn auf 1 mg/ml in steriler Kochsalzlösung verdünnen. Dosieren Sie jede Maus mit 100 μg/100 μL der Anti-GR1-Lösung intraperitoneal nach Anäsieeinleitung.
4. Betäuben Sie die Mäuse nacheinander mit Isofluran oder anderen institutionell zugelassenen Anästhetika.
   HINWEIS: Isofluran muss während der Induktion in einer Konzentration von 3% -5% verabreicht werden. Sobald die Maus unbeweglich ist, senken Sie die Isoflurankonzentration auf 1% -3%, um für die Dauer der Operation zu wirken.
   1. Überwachen Sie die Maus auf eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atemfrequenz, das Fehlen einer Zehenklemmreaktion und eine angemessene rosa Färbung von Ohren und Mund beobachten.
      VORSICHT: Verwenden Sie geeignete Anästhesiemaschinen und Spülmethoden und vermeiden Sie die Exposition gegenüber Isoflurandämpfen.
5. Übertragen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine andere Wärmequelle (siehe Materialtabelle).
6. Verabreichen Sie die Augensalbe, indem Sie einen kleinen Tropfen Salbe mit einem behandschuhten Finger auf das Auge tupfen.
7. Die Analgetika Buprenorphin (0,08 mg/kg) und Carprofen (5 mg/kg) (siehe Materialtabelle) subkutan verabreichen, indem Sie die Haut kneifen und in einem Winkel parallel zum Körper injizieren.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Analgesie vor der Behandlung nach institutionellen Protokollen vor. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Auswahl und Verabreichung von Analgetika. Die in dieser Studie verwendete Methode der Analgesie ist in Schritt 2.7 und ergänzender Abbildung 1 beschrieben.
8. Verabreichen Sie das Anti-GR1 (hergestellt in Schritt 2.4) intraperitoneal, indem Sie die Maus leicht am Schwanz anheben, den Bauch freilegen und in einem Winkel von 30° mit einer Insulinspritze 1 ml (12,7 mm) injizieren.
9. Verwenden Sie tiersichere elektrische Haarschneider (siehe Materialtabelle), um den mittleren und oberen Teil der Rückenseite der Maus zu rasieren.
10. Reinigen Sie alle Haare und tragen Sie eine großzügige Menge Haarentfernungssalbe für 30 s bis 1 Minute auf die rasierte Haut auf.
11. Wischen Sie die Haarentfernungssalbe mit einem Papiertuch und PBS vollständig ab.

3. Transplantationsverfahren

1. Bringen Sie die Maus an einen sekundären chirurgischen Ort, weg von der Haarentfernungsstation.
2. Sterilisieren Sie die Operationsstelle mit dem Jodtupfer in kreisenden Bewegungen, beginnend in der Mitte und trainieren Sie zum Rand des enthaarten Bereichs.
3. Legen Sie ein Stück sterile Plastikfolie über die Maus und schneiden Sie ein Fenster in den Kunststoff, das etwas größer ist als die Größe des zu transplantierenden Bereichs.
4. Schneiden Sie einen rechteckigen 10 mm x 10 mm großen Teil der Spenderhaut ab, der mit einem Skalpell transplantiert werden soll. Tun Sie dies, indem Sie die Spenderhaut fest mit der Rückseite der Pinzette halten und mit dem Skalpell neben der Pinzette schneiden.
5. Schneiden Sie mit der chirurgischen Schere einen rechteckigen Bereich der Maushaut ab, der der Größe des Spenderhautstücks entspricht, wodurch ein Transplantatbett entsteht. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut vom Körper wegzuziehen, und schneiden Sie die Haut mit der Schere vom Körper weg, um zu vermeiden, dass sie tief in die Fassade einschneidet.
6. Legen Sie das Spenderhautstück, Epidermis mit der Seite nach oben, auf das vorbereitete Transplantatbett.
7. Manipulieren Sie die Haut mit der Rückseite der Pinzette und gleiten Sie hin und her, bis die Spenderhaut völlig flach gegen das Transplantatbett liegt.
8. Fügen Sie Tropfen chirurgischen Klebstoffgewebeklebers hinzu (siehe Materialtabelle), wo die Spenderhaut auf die Maushaut trifft, und halten Sie die Maus und die Spenderhaut mit einer Pinzette für 1-2 s zusammen, so dass der Klebstoff am Gewebe haftet. Versiegeln Sie den Rand des Transplantats vollständig und lassen Sie den Klebstoff vollständig trocknen.
9. Verbinden Sie die Mäuse (Abbildung 1), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Schneiden Sie ein Stück Petrolatumgaze (siehe Materialtabelle), das groß genug ist, um den Transplantatbereich vollständig abzudecken.
   2. Bedecken Sie das Transplantat mit der Vaselinegaze und drücken Sie die Gaze mit einer Pinzette leicht gegen die Haut.
   3. Schneiden Sie einen Streifen eines transparenten Filmverbandes der Länge nach ab, so dass die Breite groß genug ist, um die Wunde der Maus zu bedecken.
   4. Drücken Sie den transparenten Folienverband mit der Klebeseite nach unten fest über die Gaze. Rollen Sie schnell die Maus, um den Verband vollständig um den Oberkörper zu wickeln, um sicherzustellen, dass er fest sitzt, ohne die Atmung zu behindern und alle Gliedmaßen frei für die Bewegung sind.
   5. Setzen Sie die Maus in einen Wiederherstellungskäfig und überwachen Sie sie, bis sie wachsam ist und sich bewegt. Stellen Sie eine Wärmequelle auf einem Teil des Käfigs für mindestens 15 Minuten nach der Wiederherstellung bereit.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass sich die Tiere innerhalb von 1-5 Minuten erholen, nachdem sie in den Erholungskäfig gesetzt wurden.
10. Einzeln beherbergen die Mäuse nach dem Pfropfen.
11. Verabreichen Sie postoperative Analgesie gemäß den institutionellen Protokollen.
    HINWEIS: Buprenorphin (0,08 mg/kg) wurde 4-6 Stunden später während der vorliegenden Studie subkutan verabreicht.

4. Postoperative Eingriffe

1. Injizieren Sie 100 μL (100 μg) Anti-GR1 intraperitoneal nach 4 Tagen, 7 Tagen und 11 Tagen nach der Transplantation, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern (ergänzende Abbildung 1).
2. Ersetzen Sie die Bandagen nach Bedarf und wenn sie von Mäusen entfernt werden.
3. Verbinden Sie alle Mäuse am Tag 7.
4. Entfernen Sie die Bandagen am 14. Tag.
5. Überwachen Sie die Mäuse auf Anzeichen einer Transplantatabstoßung und systemischen Entzündungen (Gewichtsverlust, Haarausfall, extreme Lethargie).
6. Ernten Sie die Mäuse zwischen 3 und 6 Wochen nach der Transplantation.
   1. Euthanasieren Sie die Mäuse durch regulatorgesteuerte Kohlendioxid (CO₂) -Verabreichung, gefolgt von zervikaler Dislokation.
      HINWEIS: Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für Sterbehilfe.
   2. Sezieren Sie die Hauttransplantate der Mäuse¹⁴. Legen Sie einen Teil des Transplantats für 24 Stunden in 10% Formalin, bevor Sie Paraffin einbetten und schneiden, um die Histologie zu färben⁹.
   3. Zerkleinern Sie die Hauttransplantate mit einer Schere und verdauen Sie sie enzymatisch mit 250 IE / ml Kollagenase IV und 0,02 mg / ml DNase in Zellkulturmedien über Nacht. Färbung der Zellen für Oberflächen- und intrazelluläre Marker nach dem zuvor beschriebenen Verfahren¹⁴.

Ergebnisse

Xenotransplantate mit menschlicher Haut wurden an NSG-Mäusen in einer Superbarriere-Tiereinrichtung durchgeführt. Der Erfolg wurde durch das verlängerte Transplantat- und Mausüberleben und die Verhaltensgesundheit von Mäusen nach der Transplantation definiert. Ein schlechtes Überleben in der Woche nach der Operation wurde zunächst als größtes Hindernis für den experimentellen Erfolg beobachtet, wobei bis zu 50% der Mäuse Euthanasie benötigten. Die Verbesserung der sterilen Technik und eine bessere Unterstütz...

Diskussion

Das Maus-Xenograft-Hauttransplantationsmodell ist eine Schlüsseltechnik zur mechanistischen Analyse menschlicher Hautimmunantworten in einer In-vivo-Umgebung ¹⁴. Erfolgreiche Xenograft-Hauttransplantationen beruhen auf der geeigneten Vorbereitung von Mäusen und Hautproben und Mäusen und der Einhaltung aseptischer Nagetierchirurgiemethoden¹⁵. Eine schnelle Abkühlung und ordnungsgemäße Lagerung von Hautproben bei kalten Temperaturen in Medien (z. B. sterile Koc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye