İnsan Bağışıklık Tepkilerini In Vivo'da Manipüle Etmek için Ksenograft Cilt Modeli

Özet

Mevcut protokol, insan derisinin obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) farelere nasıl aşılanacağını açıklamaktadır. Nakil için insan derisinin hazırlanması, nakil için farelerin hazırlanması, bölünmüş kalınlıkta insan derisinin nakli ve nakil sonrası iyileşme prosedürünün ayrıntılı bir açıklaması raporda yer almaktadır.

Özet

İnsan donör derisinin immün yetmezlikli bir fare konağına nakledildiği insan derisi ksenograft modeli, cilt immünolojisinde translasyonel araştırmalar için önemli bir seçenektir. Murin ve insan derisi anatomi ve bağışıklık hücresi kompozisyonunda önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu nedenle, geleneksel fare modellerinin dermatolojik araştırma ve ilaç keşfi için sınırlamaları vardır. Bununla birlikte, başarılı ksenotransplantasyonlar teknik olarak zordur ve greft ve konakçı sağkalımı için optimal numune ve fare greft bölgesi hazırlığı gerektirir. Mevcut protokol, insan derisinin farelere nakli için optimize edilmiş bir teknik sağlar ve aşağı akış deneysel amaçları için gerekli hususları tartışır. Bu rapor, bir insan donör cilt örneğinin uygun şekilde hazırlanmasını, cerrahi bir kurulumun montajını, fare ve cerrahi alan hazırlığını, cilt naklini ve cerrahi sonrası izlemeyi açıklamaktadır. Bu yöntemlere bağlılık, ksenogreftlerin ameliyat sonrası 6 haftadan fazla bir süre boyunca sürdürülmesini sağlar. Aşağıda özetlenen teknikler, mühendislik kontrollerinin, steril tekniğin ve ameliyat öncesi ve sonrası şartlandırmanın geliştirilmesi nedeniyle maksimum aşılama verimliliğine izin vermektedir. Ksenograft modelinin uygun performansı, insan derisinin deneysel karakterizasyonu ve bileşiklerin in vivo klinik öncesi testleri için uzun ömürlü insan derisi greft örnekleri ile sonuçlanır.

Giriş

Fare modelleri, kısmen deneysel tekrarlanabilirlikleri ve genetik manipülasyon kapasiteleri nedeniyle, insan biyolojisi ve hastalığı hakkında çıkarımlar yapmak için sıklıkla kullanılır. Bununla birlikte, fare fizyolojisi insan organ sistemlerini, özellikle cildi tamamen özetlemez ve bu nedenle ilaç geliştirmede klinik öncesi bir model olarak kullanım sınırlamaları vardır¹. Fare ve insan derisi arasındaki anatomik farklılıklar arasında epitel kalınlıkları ve mimarisindeki farklılıklar, murin ekrin ter bezlerinin eksikliği ve saç döngüsündeki farklılıklar^{bulunur 2}. Ayrıca, bağışıklık sisteminin hem doğuştan gelen hem de adaptif kolları iki tür arasında farklıdır³. Fare derisi, dendritik epidermal T hücrelerinin (DETC'ler) benzersiz bir bağışıklık popülasyonunu içerir, daha yüksek miktarda dermal γδ T hücresine sahiptir ve insan dokusuna kıyasla bağışıklık hücresi alt kümesi lokalizasyonunda değişir⁴. Bu nedenle, insan derisi biyolojisi ve inflamasyonu ile ilgili deneysel bulgular, insan dokusu ile doğrulamadan yararlanmaktadır. İn vitro ve organoid kültür sistemleri insan dokusunu incelemek için yaygın olarak kullanılan araçlar olsa da, bu sistemler eksik veya eksik immün rekonstrüksiyon ve periferik vaskülatür⁵ ile bağlantı eksikliği ile sınırlıdır. İnsanlaştırılmış ksenograft deri nakli modeli, insan dokularındaki immün ve immün olmayan yolakların in vivo olarak terapötik veya biyolojik manipülasyonuna izin vermeyi amaçlamaktadır.

İnsan derisi ksenograft modeli, cilt fizyolojisi ve farmakolojisini incelemek, bağışıklık reddini ve yanıtlarını analiz etmek, insan derisi kanseri mekanizmalarını incelemek ve cilt hastalıklarını ve yara iyileşmesini anlamak için kullanılmıştır⁶. Cilt araştırmasının birden fazla alanına uygulanabilir olsa da, ksenogreft modeli, in vitro çalışmalardan daha düşük verime sahiptir ve fare modellerinde kullanılan genetik manipülasyon kolaylığından yoksundur. Bu modeldeki zaman noktaları haftalardan aylara kadar değişebilir ve başarılı aşılama, bu ameliyatları gerçekleştirmek için uygun tesis ve ekipman gerektirir. Bununla birlikte, ksenograft modeli deneylere biyolojik ve fizyolojik bağlam sağlarken, doku eksplantları gibi organoid kültür sistemleri genellikle belirli zaman aralıklarında eksojen sinyaller gibi sayısız hareketli parçanın çoğaltılmasını gerektirir⁷. Bu nedenle, bu model en iyi şekilde in vitro ve fare modellerinde gözlemlenen bulguları daha da doğrulamak veya biyolojik olarak mümkün olmayan işler için kullanılır. Ksenograft modelinin uygun kullanımı, bozulmamış insan dokusunu in vivo olarak incelemek ve manipüle etmek için eşsiz bir fırsat sağlar.

Ksenograft cilt nakli modelinin optimizasyonu, zaman içinde greft bütünlüğünü korumak için onlarca yıllık araştırmalara dayanmaktadır. Bu süreç için kritik olan, B ve T adaptif bağışıklık hücrelerinden, fonksiyonel NK hücrelerinden yoksun olan ve makrofaj ve dendritik hücrelerde eksiklikleri olan obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) faresini kullanmaktır⁸. Bu NSG konakçılarının immün yetmezlikli doğası, insan hematopoetik hücrelerinin, hasta kaynaklı kanserlerin ve cildin ^8,9,10 transplantasyonuna izin verir. Bu immünsüpresif konakçı ortama rağmen, anti-GR1 uygulaması ile fare nötrofilik immün yanıtlarının daha fazla baskılanması greft başarısı için gereklidir¹⁰. Sağlam doku naklinde başlıca engeller enfeksiyon, reddetme ve greftten kan akışını yeniden kurmada zorluktur, bazen dermal ve epidermal bütünlüğün kaybına yol açar¹¹. Anti-FR1 uygulaması ve uygun greft derinliğinin kullanımını içeren teknikler greft sağkalımını iyileştirir¹⁰. Titiz optimizasyon, NSG fareleri üzerinde% 90 ila% 100 arasında değişen yüksek verimlilik ve hayatta kalma oranları ile insan ksenograft cilt nakillerinin gerçekleştirilmesini mümkün kılar.

Protokol

Bu çalışma UCSF IACUC (AN191105-01H) ve IRB (13-11307) protokollerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Bu araştırma için fıtık onarımı gibi rutin elektif cerrahi prosedürlerin bir parçası olarak atılan deri örnekleri kullanılmıştır. Cilt örnekleri ya İnsan Denekler Araştırması Değil olarak tanımlanmamış ve sertifikalandırılmıştır ya da aşağı akış analizleri için klinik olarak tanımlayıcı bilgiler gerekiyorsa, hastalar IRB protokolü 13-11307 kapsamında yazılı onay vermiştir. Başka hiçbir dahil etme veya hariç tutma kriteri kullanılmamıştır. Çalışmada her iki cinsiyetten de 8-10 haftalık NSG fareleri kullanıldı. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Donör insan derisi örneğinin işlenmesi

NOT: Bu nakilde kullanılan insan derisi örneği, sağlıklı bir hastanın karnından toplanan büyük bir örnektir. Örnek en az 15 cm x 7,5 cm olmalıdır. Boyut sınırlamaları, cildin mevcut olduğu fare sayısını ve greft boyutunun seçimini etkileyebilir.

1. Hazırlama ve aşılamadan önce cilt örneğini soğuk sıcaklıklarda (buz üzerinde; 4 ° C) tutun. Numuneyi, fosfat tamponlu salin (PBS) içine batırılmış gazlı bezle kapalı bir numune toplama kabında nemli tutun.
   NOT: Cilt örneğinin 4 °C'de 2 günden daha uzun süre saklanması önerilmez. Bununla birlikte, cilt örneklerinin daha uzun süre saklandığı raporlar mevcuttur¹².
   DİKKAT: Tüm insan dokularını standart biyolojik tehlike önlemleriyle tedavi edin.
2. İnsan derisi örneğini, sterilize edilmiş bir diseksiyon panosu üzerindeki sterilize edilmiş bir negatif basınçlı doku kültürü davlumbazında dermatome hazırlamaya hazırlanın.
3. Cilt örneğini, epidermis tarafını yukarıya, diseksiyon panosuna yerleştirin. Epidermisi steril bir alkol hazırlama pedi ve ardından PBS ile silin.
4. Cildin daha yakın kenarını, T-pimini parçalara ayırırken 1,5 ile yerine sabitleyin (bkz.
5. Cilt örneğini 400 μm kalınlığında dermatomlayın, 30 ° -45 ° 'lik bir açıyla ileri doğru keserken sabit basınç uygulayın. Cihaza özel tüm talimatları ve güvenlik önlemlerini izleyin (bkz.
   NOT: Dermatom tekniği hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen daha önce yayınlanmış bir rapor^13'e bakınız.
6. Kabın dibine steril PBS'ye batırılmış steril bir gazlı bez yerleştirerek 100 mm x 20 mm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Cildi, epidermis tarafı yukarıya, ıslak gazlı bezin üzerine yerleştirin.
7. Numunenin kirlenmediğinden emin olmak için plaka kenarlarını yarı saydam bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve örtün (bkz. Aşılamadan önce numuneyi 4° C'de saklayın.

2. Ameliyat öncesi kondisyon ve hazırlık

1. Steril aletleri ve aşılama için steril bir cerrahi istasyon hazırlayın. Alet ve fare yerleşimi için otoklavlanmış kağıt havluları steril yüzeyler olarak kullanın.
   NOT: Fareler sütten kesildikten sonra aşılanabilir, ancak tercihen 8-10 haftalıkken aşılanırlar. Her iki cinsiyetten fareler de aşılanabilir.
2. Epilasyon gibi cerrahi hazırlığı, cerrahi istasyondan fiziksel olarak ayrılmış bir alanda gerçekleştirin.
3. Anti-GR1'i (bakınız Malzeme Tablosu) steril salin içinde 1 mg/mL'ye seyrelterek hazırlayın. Her fareye anestezi indüksiyonunu takiben intraperitoneal olarak 100 μg / 100 μL anti-GR1 çözeltisi ile dozlayın.
4. Fareleri birer birer izofluran veya diğer kurumsal olarak onaylanmış anesteziklerle uyuşturun.
   NOT: İzofluran indüksiyon sırasında% 3-% 5'lik bir konsantrasyonda verilmelidir. Fare hareketsiz hale geldiğinde, ameliyat süresini etkilemek için izofluran konsantrasyonunu% 1 -% 3'e düşürün.
   1. Solunum hızını, ayak parmağını sıkıştırma yanıtının yokluğunu ve kulakların ve ağzın uygun pembe renklenmesini gözlemleyerek fareyi uygun anestezi derinliği açısından izleyin.
      DİKKAT: Uygun anestezik makineleri ve süpürme yöntemlerini kullanın ve izofluran buharlarına maruz kalmaktan kaçının.
5. Fareyi bir ısıtma yastığına veya başka bir ısı kaynağına aktarın (bkz.
6. Eldivenli bir parmakla göze küçük bir damla merhem sürerek oftalmik merhemi uygulayın.
7. Analjezikler Buprenorfin (0.08 mg / kg) ve Karprofen (5 mg / kg) ( bakınız Malzeme Tablosu) cildi sıkıştırarak ve vücuda paralel bir açıyla enjekte ederek deri altından uygulayın.
   NOT: Tedavi öncesi analjeziyi kurumsal protokollere uygun olarak hazırlayın. Analjeziklerin seçimi ve uygulanması için kurumsal yönergeleri izleyin. Bu çalışmada kullanılan analjezi yöntemi adım 2.7 ve Ek Şekil 1'de özetlenmiştir.
8. Anti-GR1'i (adım 2.4'te hazırlanan) fareyi kuyruğundan hafifçe kaldırarak, karnı açığa çıkararak ve insülin 1 mL (12.7 mm) şırınga kullanarak 30° açıyla enjekte ederek intraperitoneal olarak uygulayın.
9. Farenin sırt tarafının orta ve üst kısımlarını tıraş etmek için hayvanlara uygun elektrikli makaslar kullanın (bkz.
10. Tüm saçları temizleyin ve tıraş olmuş cilde 30 s ila 1 dakika boyunca bol miktarda epilasyon merhemi uygulayın.
11. Epilasyon merhemini bir kağıt havlu ve PBS ile tamamen silin.

3. Transplantasyon prosedürü

1. Fareyi epilasyon istasyonundan uzakta ikincil bir cerrahi yere aktarın.
2. Cerrahi bölgeyi, iyot çubuk çubuğu ile dairesel bir hareketle, ortadan başlayarak ve epilasyon yapılan alanın kenarına doğru çalışarak sterilize edin.
3. Farenin üzerine bir parça steril plastik sargı yerleştirin ve plastiğin içindeki pencereyi, aşılanacak alanın boyutundan biraz daha büyük olarak kesin.
4. Donör derisinin dikdörtgen şeklindeki 10 mm x 10 mm'lik bir kısmını neşterle aşılamak üzere kesin. Bunu, donör derisini forsepslerin arka tarafı ile sıkıca yerinde tutarak ve forsepslerin yanında neşterle keserek yapın.
5. Cerrahi makası kullanarak, donör cilt parçasının boyutuna uyan fare derisinin dikdörtgen bir alanını kırpın ve bir greft yatağı oluşturun. Cildi vücuttan uzaklaştırmak için forseps kullanın ve fasiya derinlemesine kesilmesini önlemek için cildi vücuttan uzağa açılı makasla kesin.
6. Donör deri parçasını, epidermis tarafı yukarıya, hazırlanan greft yatağına yerleştirin.
7. Forsepslerin arkasını kullanarak, cildi manipüle edin, donör cilt greft yatağına karşı tamamen düz durana kadar ileri geri kaydırın.
8. Donör cildinin fare derisiyle buluştuğu cerrahi tutkal dokusu yapıştırıcısı damlaları ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve fare ve donör cildini forseps ile birlikte 1-2 s boyunca tutun, böylece yapıştırıcı dokulara yapışır. Greftin kenarını tamamen kapatın ve yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin.
9. Aşağıdaki adımları izleyerek fareleri bandajlayın (Şekil 1).
   1. Greft alanını tamamen kaplayacak kadar büyük bir parça petrolatum gazlı bez (bkz.
   2. Grefti petrolatum gazlı bezle örtün ve forseps kullanarak gazlı bezi cilde hafifçe bastırın.
   3. Şeffaf bir film pansuman şeridini uzunlamasına kesin, böylece genişlik farenin yarasını örtecek kadar büyük olur.
   4. Şeffaf film pansumanını, yapışkan tarafı aşağıya, gazlı bezin üzerine sıkıca bastırın. Pansumanı gövdenin etrafına tamamen sarmak için fareyi hızlı bir şekilde yuvarlayın, solunumu engellemeden sıkıca oturduğundan ve tüm uzuvların hareket için serbest olduğundan emin olun.
   5. Fareyi bir kurtarma kafesine yerleştirin ve uyanana ve hareket edene kadar izleyin. İyileşmeyi takiben kafesin bir kısmında en az 15 dakika boyunca bir ısı kaynağı sağlayın.
      NOT: Hayvanların kurtarma kafesine yerleştirildikten sonra 1-5 dakika içinde iyileşmeleri beklenir.
10. Aşılamayı takiben fareleri tek başına barındırın.
11. Cerrahi sonrası analjezi kurumsal protokollerin gerektirdiği şekilde uygulanır.
    NOT: Buprenorfin (0.08 mg/kg) bu çalışma sırasında 4-6 saat sonra deri altından uygulandı.

4. Ameliyat sonrası işlemler

1. Greft reddini önlemek için greftlemeden 4 gün, 7 gün ve 11 gün sonra periton içi olarak 100 μL (100 μg) anti-GR1 enjekte edin (Ek Şekil 1).
2. Bandajları gerektiği gibi ve fareler tarafından çıkarılırsa değiştirin.
3. 7. günde tüm fareleri geri alın.
4. Bandajları 14. günde çıkarın.
5. Greft reddi ve sistemik inflamasyon belirtileri (kilo kaybı, saç dökülmesi, aşırı uyuşukluk) için fareleri izleyin.
6. Greftten 3 ila 6 hafta sonra fareleri hasat edin.
   1. Regülatör kontrollü karbondioksit (CO₂) uygulaması ve ardından servikal çıkık yoluyla fareleri ötenazileştirin.
      NOT: Ötanazi için kurumsal yönergeleri izleyin.
   2. Cilt greftlerini farelerden disseke edin¹⁴. Histoloji boyama⁹ için parafin gömme ve kesitleme işleminden önce greftin bir kısmını 24 saat boyunca% 10 formalin içine yerleştirin.
   3. Cilt greftlerini makasla kesin ve gece boyunca hücre kültürü ortamında 250 IU / mL Kollajenaz IV ve 0.02 mg / mL DNaz ile enzimatik olarak sindirin. Daha önce tarif edilen prosedür^14'ü takiben yüzey ve hücre içi belirteçler için hücreleri lekeleyin.

Sonuçlar

İnsan derisi ksenogreftleri, süper bariyerli bir hayvan tesisinde NSG fareleri üzerinde gerçekleştirildi. Başarı, nakil sonrası farelerin uzun süreli greft ve fare sağkalımı ve davranışsal sağlığı ile tanımlanmıştır. Ameliyatı takip eden hafta boyunca zayıf sağkalım başlangıçta deneysel başarının önündeki en büyük engel olarak gözlendi ve farelerin% 50'sine kadarı ötenazi gerektiriyordu. Steril tekniğin iyileştirilmesi ve ameliyat sırasında ve hemen sonrasında fare vücut ısı...

Tartışmalar

Fare ksenograft cilt nakli modeli, insan derisi bağışıklık tepkilerini in vivo bir ortamda mekanik olarak incelemek için anahtar bir tekniktir¹⁴. Başarılı deri ksenogreft nakilleri, farelerin ve cilt örneklerinin ve farelerin uygun şekilde hazırlanmasına ve aseptik kemirgen cerrahisi yöntemlerine uyulmasına bağlıdır¹⁵. Hızlı soğutma ve cilt örneklerinin soğuk sıcaklıklarda (steril salin gibi) uygun şekilde depolanması, nakil öncesi doku ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye