Modelo de pele de xenoenxerto para manipular respostas imunes humanas in vivo

Resumo

O presente protocolo descreve como enxertar pele humana em camundongos diabéticos não obesos (NOD)-scid interleucina-2 receptor de cadeia gama (NSG) camundongos. Uma descrição detalhada da preparação da pele humana para transplante, preparação de camundongos para transplante, transplante de pele humana de espessura dividida e procedimento de recuperação pós-transplante estão incluídas no relatório.

Resumo

O modelo de xenoenxerto de pele humana, no qual a pele do doador humano é transplantada para um hospedeiro de camundongo imunodeficiente, é uma opção importante para a pesquisa translacional em imunologia da pele. A pele murina e humana diferem substancialmente na anatomia e composição das células imunes. Portanto, os modelos tradicionais de camundongos têm limitações para a pesquisa dermatológica e a descoberta de medicamentos. No entanto, xenotransplantes bem-sucedidos são tecnicamente desafiadores e exigem uma preparação ideal do local do espécime e do enxerto de camundongo para a sobrevivência do enxerto e do hospedeiro. O presente protocolo fornece uma técnica otimizada para transplante de pele humana em camundongos e discute considerações necessárias para os objetivos experimentais a jusante. Este relatório descreve a preparação apropriada de uma amostra de pele de doador humano, montagem de uma configuração cirúrgica, preparação de camundongo e local cirúrgico, transplante de pele e monitoramento pós-cirúrgico. A adesão a esses métodos permite a manutenção de xenoenxertos por mais de 6 semanas após a cirurgia. As técnicas descritas abaixo permitem a máxima eficiência do enxerto devido ao desenvolvimento de controles de engenharia, técnica estéril e condicionamento pré e pós-cirúrgico. O desempenho adequado do modelo de xenoenxerto resulta em amostras de enxerto de pele humana de longa duração para caracterização experimental de pele humana e testes pré-clínicos de compostos in vivo.

Introdução

Modelos de camundongos são frequentemente usados para fazer inferências sobre a biologia humana e a doença, em parte devido à sua reprodutibilidade experimental e capacidade de manipulação genética. No entanto, a fisiologia do camundongo não recapitula completamente os sistemas de órgãos humanos, particularmente a pele, e, portanto, tem limitações para uso como modelo pré-clínico no desenvolvimento de fármacos¹. As diferenças anatômicas entre a pele de camundongos e humanos incluem diferenças nas espessuras e arquitetura epitelial, falta de glândulas sudoríparas écrinas murinas e variações no ciclo capilar². Além disso, tanto os braços inato quanto o adaptativo do sistema imunológico são divergentes entre as duas espécies³. A pele de camundongo contém uma população imune única de células T epidérmicas dendríticas (DETCs), tem uma maior abundância de células T γδ dérmicas e varia na localização do subconjunto de células imunes em comparação com o tecido humano⁴. Portanto, os achados experimentais sobre a biologia da pele humana e a inflamação se beneficiam da validação com tecido humano. Embora os sistemas de cultura in vitro e organoides sejam ferramentas amplamente utilizadas para o estudo do tecido humano, esses sistemas são limitados pela reconstituição imune ausente ou incompleta e pela falta de conexão com a vasculatura periférica⁵. O modelo humanizado de transplante de pele de xenoenxerto visa permitir a manipulação terapêutica ou biológica de vias imunes e não imunes em tecidos humanos in vivo.

O modelo de xenoenxerto de pele humana tem sido utilizado para estudar a fisiologia e farmacologia da pele, analisar a rejeição e as respostas imunes, dissecar os mecanismos do câncer de pele humano e entender as doenças de pele e a cicatrização de feridas⁶. Embora aplicável a vários campos de pesquisa da pele, o modelo de xenoenxerto tem menor rendimento do que os estudos in vitro e não tem a facilidade de manipulação genética empregada em modelos de camundongos. Os pontos de tempo dentro deste modelo podem variar de semanas a meses, e o enxerto bem-sucedido requer instalações e equipamentos apropriados para realizar essas cirurgias. No entanto, o modelo de xenoenxerto fornece contexto biológico e fisiológico aos experimentos, enquanto os sistemas de cultura organoides, como os explantes de tecidos, muitas vezes requerem a replicação de uma miríade de partes móveis, como sinais exógenos, em intervalos de tempo específicos⁷. Portanto, este modelo é melhor utilizado para validar ainda mais os achados observados in vitro e dentro de modelos de camundongos, ou para trabalhos que de outra forma não são biologicamente viáveis. O uso apropriado do modelo de xenoenxerto oferece uma oportunidade única para estudar e manipular o tecido humano intacto in vivo.

A otimização do modelo de transplante de pele de xenoenxerto tem contado com décadas de pesquisa para preservar a integridade do enxerto ao longo do tempo. Crítico para esse processo é a utilização do camundongo receptor de cadeia gama (NSG) não obeso diabético (NOD) e scid interleucina-2, que não possui células imunes adaptativas B e T, células NK funcionais e tem deficiências em macrófagos e células dendríticas⁸. A natureza imunodeficiente desses hospedeiros NSG permite o transplante de células hematopoiéticas humanas, cânceres derivados de pacientes e pele ^8,9,10. Apesar desse ambiente imunossupressor do hospedeiro, a supressão adicional das respostas imunes neutrofílicas de camundongos pela administração de anti-GR1 é necessária para o sucesso do enxerto¹⁰. Os principais obstáculos no transplante de tecido intacto são infecção, rejeição e dificuldade em restabelecer o fluxo sanguíneo para o enxerto, às vezes levando à perda da integridade dérmica e epidérmica¹¹. Técnicas que incluem a administração de anti-FR1 e o uso de profundidade apropriada do enxerto melhoram a sobrevida do enxerto¹⁰. A otimização meticulosa possibilita a realização de transplantes de pele de xenoenxerto humano em camundongos NSG com alta eficiência e taxas de sobrevivência, variando de 90% a 100%.

Protocolo

O presente estudo foi aprovado e realizado em conformidade com os protocolos UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Amostras de pele, descartadas como parte de procedimentos cirúrgicos eletivos de rotina, como o reparo de hérnia, foram utilizadas para a presente pesquisa. As amostras de pele são desidentificadas e certificadas como Pesquisa Não Humana ou, se informações de identificação clínica forem necessárias para análises a jusante, os pacientes forneceram consentimento por escrito sob o protocolo IRB 13-11307. Nenhum outro critério de inclusão ou exclusão foi utilizado. Camundongos NSG de ambos os sexos, 8-10 semanas de idade, foram empregados no estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Processamento da amostra de pele humana do dador

NOTA: A amostra de pele humana utilizada neste transplante foi uma grande amostra coletada do abdômen de um paciente saudável. A amostra deve ter pelo menos 15 cm x 7,5 cm. As limitações de tamanho podem afetar o número de camundongos para os quais a pele está disponível e a escolha do tamanho do enxerto.

1. Manter a amostra de pele a temperaturas frias (no gelo; 4°C) antes da preparação e enxertia. Manter a amostra úmida em um copo de coleta de amostra fechado com a gaze embebida em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   NOTA: Não é recomendado armazenar a amostra de pele a 4 °C durante mais de 2 dias. No entanto, existem relatos em que as amostras de pele são armazenadas por mais tempo¹².
   CUIDADO: Trate todo o tecido humano com precauções padrão de risco biológico.
2. Prepare-se para dermátomo da amostra de pele humana em um capuz de cultura de tecido de pressão negativa esterilizado em uma placa de dissecção esterilizada.
3. Coloque a amostra de pele, do lado da epiderme para cima, na placa de dissecção. Limpe a epiderme com uma almofada de preparação de álcool estéril e, em seguida, com PBS.
4. Fixe a borda mais próxima da pele no lugar com um pino T de dissecação de 1,5 (ver Tabela de Materiais).
5. Dermátomo a amostra de pele a uma espessura de 400 μm, aplicando pressão constante enquanto corta para a frente em um ângulo de 30°-45°. Siga todas as instruções e medidas de segurança específicas do instrumento (consulte Tabela de materiais).
   NOTA: Para obter detalhes sobre a técnica do dermátomo, consulte um relatório publicado anteriormente¹³.
6. Prepare uma placa de Petri de 100 mm x 20 mm colocando uma gaze estéril embebida em PBS estéril na parte inferior do prato. Coloque a pele, epiderme de lado para cima, sobre a gaze molhada.
7. Selar e cobrir as bordas da placa com uma película de vedação semitransparente (ver Tabela de Materiais) para garantir que a amostra não esteja contaminada. Conservar a amostra a 4°C antes da enxertia.

2. Condicionamento e preparação pré-cirúrgica

1. Prepare os instrumentos estéreis e uma estação cirúrgica estéril para enxerto. Use toalhas de papel autoclavadas como superfícies estéreis para a colocação de instrumentos e mouses.
   NOTA: Os ratos podem ser enxertados após o desmame, mas são preferencialmente enxertados entre 8-10 semanas de idade. Camundongos de ambos os sexos podem ser enxertados.
2. Realize o preparo cirúrgico, como a depilação, em uma área fisicamente separada da estação cirúrgica.
3. Preparar o anti-GR1 (ver Tabela de Materiais) diluindo-o em 1 mg/ml em solução salina estéril. Dose de cada rato com 100 μg/100 μL da solução anti-GR1 por via intraperitoneal após indução anestésica.
4. Anestesiar os camundongos, um de cada vez, com isoflurano ou outros anestésicos institucionalmente aprovados.
   NOTA: O isoflurano precisa ser administrado a uma concentração de 3% a 5% durante a indução. Uma vez que o rato está imóvel, diminua a concentração de isoflurano para 1%-3% para efeito durante a duração da cirurgia.
   1. Monitore o rato quanto à profundidade apropriada da anestesia, observando a frequência respiratória, a ausência de resposta de beliscar os dedos dos pés e a coloração rosa apropriada das orelhas e da boca.
      CUIDADO: Use máquinas anestésicas apropriadas e métodos de limpeza e evite a exposição a vapores de isoflurano.
5. Transfira o mouse para uma almofada de aquecimento ou outra fonte de calor (consulte Tabela de materiais).
6. Administre a pomada oftálmica passando uma pequena gota de pomada no olho com um dedo enluvado.
7. Administrar analgésicos Buprenorfina (0,08 mg/kg) e Carprofeno (5 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea, comprimindo a pele e injetando num ângulo paralelo ao corpo.
   NOTA: Preparar a analgesia pré-tratamento seguindo protocolos institucionais. Seguir as diretrizes institucionais para a seleção e administração de analgésicos. O método de analgesia utilizado neste estudo está descrito na etapa 2.7 e na Figura 1 Suplementar.
8. Administrar o anti-GR1 (preparado no passo 2.4) por via intraperitoneal, levantando ligeiramente o rato pela cauda, expondo o abdómen e injetando num ângulo de 30° utilizando uma seringa de insulina 1 ml (12,7 mm).
9. Use cortadores elétricos seguros para animais (consulte Tabela de Materiais) para raspar as porções média e superior do lado dorsal do rato.
10. Limpe todo o cabelo e aplique uma quantidade generosa de pomada de depilação na pele raspada por 30 s a 1 min.
11. Limpe completamente a pomada de depilação com uma toalha de papel e PBS.

3. Procedimento de transplante

1. Transfira o rato para um local cirúrgico secundário, longe da estação de depilação.
2. Esterilize o local cirúrgico com o cotonete de iodo em um movimento circular, começando no meio e trabalhando em direção à borda da área depilada.
3. Coloque um pedaço de filme plástico estéril sobre o mouse e corte uma janela no plástico um pouco maior do que o tamanho da área a ser enxertada.
4. Corte uma porção em forma de retângulo de 10 mm x 10 mm de pele do doador para ser enxertada com um bisturi. Faça isso segurando firmemente a pele do doador no lugar com a parte de trás do fórceps e cortando ao lado do fórceps com o bisturi.
5. Usando a tesoura cirúrgica, corte uma área retangular da pele do rato correspondente ao tamanho da peça de pele do doador, criando um leito de enxerto. Use fórceps para puxar a pele para longe do corpo e corte a pele com a tesoura inclinada para longe do corpo para evitar cortar profundamente a fácia.
6. Coloque a peça de pele do doador, do lado da epiderme para cima, no leito do enxerto preparado.
7. Usando a parte de trás da pinça, manipule a pele, deslizando para frente e para trás até que a pele do doador fique completamente plana contra o leito do enxerto.
8. Adicione gotas de adesivo de tecido de cola cirúrgica (ver Tabela de Materiais) onde a pele do doador encontra a pele do rato e segure a pele do rato e do dador juntamente com fórceps por 1-2 s para que a cola adera aos tecidos. Sele completamente a borda do enxerto e deixe a cola secar completamente.
9. Bandagem dos ratos (Figura 1) seguindo os passos abaixo.
   1. Corte um pedaço de gaze de petrolato (ver Tabela de Materiais) grande o suficiente para cobrir completamente a área do enxerto.
   2. Cubra o enxerto com a gaze de petrolato e pressione levemente a gaze contra a pele usando fórceps.
   3. Corte uma tira de um curativo de filme transparente longitudinalmente para que a largura seja grande o suficiente para cobrir a ferida do mouse.
   4. Pressione firmemente o curativo de filme transparente, lado adesivo para baixo, sobre a gaze. Enrole rapidamente o mouse para envolver o curativo completamente ao redor do tronco, garantindo que ele se encaixe firmemente sem impedir a respiração e que todos os membros estejam livres para o movimento.
   5. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação e monitore-o até que ele esteja alerta e se movendo. Forneça uma fonte de calor em parte da gaiola por pelo menos 15 minutos após a recuperação.
      NOTA: Espera-se que os animais se recuperem dentro de 1-5 minutos depois de colocá-los na gaiola de recuperação.
10. Embale individualmente os ratos após o enxerto.
11. Administrar analgesia pós-cirúrgica conforme exigido pelos protocolos institucionais.
    NOTA: Buprenorfina (0,08 mg/kg) foi administrada por via subcutânea 4-6 h mais tarde durante o presente estudo.

4. Procedimentos pós-cirúrgicos

1. Injetar 100 μL (100 μg) de anti-GR1 por via intraperitoneal aos 4 dias, 7 dias e 11 dias após o enxerto para evitar a rejeição do enxerto (Figura 1 Suplementar).
2. Substitua as ataduras conforme necessário e se removido por ratos.
3. Rebandage todos os ratos no dia 7.
4. Retire as ataduras no dia 14.
5. Monitore os ratos para sinais de rejeição do enxerto e inflamação sistêmica (perda de peso, perda de cabelo, letargia extrema).
6. Colha os ratos entre 3 e 6 semanas após o enxerto.
   1. Eutanasiar os ratos através da administração de dióxido de carbono (CO₂) controlada pelo regulador, seguida de luxação cervical.
      NOTA: Siga as diretrizes institucionais para a eutanásia.
   2. Dissecar os enxertos de pele dos camundongos¹⁴. Colocar uma porção do enxerto em formalina a 10% por 24 h antes da incorporação e seccionamento da parafina para coloração histológica⁹.
   3. Picar os enxertos de pele com uma tesoura e digerir enzimaticamente com 250 UI/mL de colagenase IV e 0,02 mg/mL de DNase em meio de cultura celular durante a noite. Coloração das células para marcadores superficiais e intracelulares seguindo o procedimento descrito anteriormente¹⁴.

Resultados

Xenoenxertos de pele humana foram realizados em camundongos NSG dentro de uma instalação animal de super-barreira. O sucesso foi definido pela sobrevida prolongada do enxerto e do rato e pela saúde comportamental dos camundongos pós-transplante. A baixa sobrevida durante a semana seguinte à cirurgia foi inicialmente observada como a maior barreira para o sucesso experimental, com até 50% dos camundongos necessitando de eutanásia. Melhorar a técnica estéril e melhor suporte das temperaturas corporais do rato dura...

Discussão

O modelo de transplante de pele de xenoenxerto de camundongo é uma técnica fundamental para dissecar mecanicamente as respostas imunes da pele humana em um ambiente in vivo ¹⁴. O sucesso dos transplantes de xenoenxerto de pele depende do preparo adequado de camundongos e espécimes de pele e camundongos e da adesão a métodos de cirurgia asséptica de roedores¹⁵. O resfriamento rápido e o armazenamento adequado de amostras de pele a temperaturas frias em meios ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	SF100-20	Fixative for histology
3M Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB	surgical glue
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)	Thermo Fischer	56-0451-82	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Anti-GR1 clone RB6-8C5	BioXcell	BE0075	Anti-rejection
APC mouse anti-human CD25  (Clone 2A3)	BD Biosciences	340939	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)	eBioscience	47-9956-42	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Autoclave pouches	VWR	89140-800	For autoclaving tools and paper towels
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4	Biolegend	317438	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)	Biolegend	301042	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)	Biolegend	317328	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Buprenex 0.3 mg/mL	Covetrus	059122	Analgesia
Carprofen 50 mg/mL	Zoetis	NADA # 141-199	Analgesia
Collagenase Type IV	Worthington	4188	Skin digestion
D42 Dermatome blade	Humeca	5.D42BL10	dermatome (1 blade per sample)
Dermatome D42	Humeca	4.D42	dermatome
Disposable Scalpel	Bard-Parker	371610	skin preparation
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5	Cole-Parmer	UX-10915-03	To pin skin specimen for dermatome
Dissection scissors	medicon	02.04.10	sample preparation and mouse dissection
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Skin digestion
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent	eBioscience	00-5521-00	Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)	eBioscience	48-4776-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Electric clippers	Kent	CL8787-KIT	hair removal
Epredia Shandon Instant Eosin	Fisher Scientific	6765040	H&E
Epredia Shandon Instant Hematoxylin	Fisher Scientific	6765015	H&E
FITC anti-human CD45 (Clone HI30)	Tonbo Biosciences	35-0459-T100	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
Forceps	medicon	07.60.07	sample preparation and mouse dissection
Gauze	Fisherbrand	22-362-178	Sample preparation
Heating lamp	Morganville Scientific	HL0100	Post-surgical care
Heating pads 4" x 10"	Pristech	20415	Surgical heat supply
Insulin 1cc 12.7 mm syringes	BD	329410	drug administration
Isoflurane	United States Pharmacopeia (USP)	NDC 66794-013-25	Anesthesia
Isoflurane machine	VetEquip	911103	Anesthesia
Nair for Men	Nair	‎ 10022600588556	hair removal
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17478-235-35	eye ointment to prevent drying
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	Mice
Paper towels	Kleenex	100848	May be autoclaved for sterile surfaces
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Semitransparent sealing film
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)	BD Biosciences	557938	Flow cytometry analysis: Surface protein staining
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)	BD Biosciences	561283	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)	eBioscience	46-1529-42	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining
Permeabilization Buffer 10x	eBioscience	00-8333-56	Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer
Petri Dish 150 mm	Corning	430597	Sample storage
Plastic Wrap	Fisherbrand	22-305-654	Site preparation
Providone-Iodine Swab stick	PDI	S41350	Site sterilization
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)	Se Lab Group Inc	NC9066511	For supplementing poorly recovering mice post-surgery
Specimen Collection Cups	Fisher Scientific	22-150-266	sample storage
Sterile alcohol prep pad	Fisherbrand	22-363-750	skin preparation
Sterile PBS	Gibco	14190-144	Media for sample storage
Sterile saline	Hospira	NDC 0409-4888-02	For drug dilution
Tegaderm Film 4” x 43/4”	3M	1626	transparent film wound dressing
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8”	Kendall	414600	wound dressing
Violet 510 Ghost Dye	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Flow cytometry analysis: Viability dye