JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول الثقافات العضوية طويلة الأجل للقشرة البشرية البالغة جنبا إلى جنب مع الزرع داخل القشرة خارج الجسم الحي للأسلاف القشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، والتي تقدم منهجية جديدة لمزيد من اختبار العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للاضطرابات التنكسية العصبية البشرية.

Abstract

الاضطرابات التنكسية العصبية شائعة وغير متجانسة من حيث أعراضها وتأثيرها الخلوي ، مما يجعل دراستهم معقدة بسبب عدم وجود نماذج حيوانية مناسبة تحاكي تماما الأمراض البشرية وضعف توافر أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة. توفر زراعة الأنسجة العصبية البشرية للبالغين إمكانية دراسة جوانب مختلفة من الاضطرابات العصبية. يمكن معالجة الآليات الجزيئية والخلوية والكيميائية الحيوية بسهولة في هذا النظام ، بالإضافة إلى اختبار الأدوية أو العلاجات المختلفة والتحقق من صحتها ، مثل العلاجات القائمة على الخلايا. تجمع هذه الطريقة بين الثقافات العضوية طويلة الأجل للقشرة البشرية البالغة ، والتي تم الحصول عليها من مرضى الصرع الذين يخضعون لجراحة استئصالية ، والزرع داخل القشرة خارج الجسم الحي للأسلاف القشرية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية. ستسمح هذه الطريقة بدراسة بقاء الخلايا ، والتمايز العصبي ، وتشكيل المدخلات والمخرجات المشبكية ، والخصائص الكهربية للخلايا المشتقة من الإنسان بعد الزرع في الأنسجة القشرية البشرية البالغة السليمة. هذا النهج هو خطوة مهمة قبل تطوير منصة نمذجة الأمراض البشرية 3D التي من شأنها أن تجعل البحوث الأساسية أقرب إلى الترجمة السريرية للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للمرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية مختلفة والسماح بتطوير أدوات جديدة لإعادة بناء الدوائر العصبية التالفة.

Introduction

الاضطرابات التنكسية العصبية ، مثل مرض باركنسون أو مرض الزهايمر أو السكتة الدماغية الإقفارية ، هي مجموعة من الأمراض التي تشترك في السمة المشتركة لخلل الخلايا العصبية أو الموت. فهي غير متجانسة من حيث منطقة الدماغ والسكان الخلايا العصبية المتأثرة. لسوء الحظ ، فإن علاجات هذه الأمراض نادرة أو ذات فعالية محدودة بسبب عدم وجود نماذج حيوانية تحاكي ما يحدث في الدماغ البشري 1,2. العلاج بالخلايا الجذعية هو واحد من أكثر الاستراتيجيات الواعدة لتجديد الدماغ3. تم تطوير جيل السلف العصبي من الخلايا الجذعية من مصادر مختلفة بشكل كبير في السنوات الأخيرة 4,5. أظهرت المنشورات الحديثة أن الخلايا الجذعية الشبيهة بالظهارة العصبية ذاتية التجدد (lt-NES) المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة من قبل الإنسان ، والتي تتبع بروتوكول التمايز القشري وبعد الزرع داخل القشرة في نموذج الفئران مع السكتة الدماغية الإقفارية التي تؤثر على القشرة الحسية الجسدية ، تولد خلايا عصبية قشرية ناضجة. بالإضافة إلى ذلك ، تلقت الخلايا العصبية المشتقة من الكسب غير المشروع اتصالات متشابكة واردة وصادرة من الخلايا العصبية المضيفة ، مما يدل على اندماجها في الشبكة العصبية للفئران 6,7. كانت المحاور المشتقة من الكسب غير المشروع ميالينية ووجدت في مناطق مختلفة من دماغ الفئران ، بما في ذلك منطقة الاحتشاء ، والجسم الثفني ، والقشرة الحسية الجسدية المقابلة. الأهم من ذلك ، أن زرع الخلايا المشتقة من iPS عكس العجز الحركي في السكتة الدماغية7.

حتى لو ساعدت النماذج الحيوانية في دراسة بقاء الزرع ، والتكامل العصبي ، وتأثير الخلايا المطعمة على الوظائف الحركية والمعرفية ، فإن المعلومات حول التفاعل بين الخلايا البشرية (مضيف الكسب غير المشروع) مفقودة في هذا النظام 8,9. لهذا السبب ، يتم وصف طريقة مشتركة لثقافة النمط العضوي للدماغ البشري على المدى الطويل مع زرع خارج الجسم الحي للأسلاف العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية هنا. الثقافات العضوية في الدماغ البشري التي تم الحصول عليها من استئصال جراحة الأعصاب هي نماذج 3D ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للدماغ التي تسمح للباحثين بزيادة فهمهم لدوائر الجهاز العصبي المركزي البشري والطريقة الأكثر دقة لاختبار العلاجات لاضطرابات الدماغ البشري. ومع ذلك ، لم يتم إجراء أبحاث كافية في هذا السياق ، وفي معظم الحالات ، تم استخدام الثقافات العضوية للدماغ الحصين البشري10,11. تتأثر القشرة الدماغية بالعديد من الاضطرابات التنكسية العصبية ، مثل السكتة الدماغية12 أو مرض الزهايمر13 ، لذلك من المهم أن يكون لدينا نظام ثلاثي الأبعاد قشري بشري يسمح لنا بتوسيع معرفتنا واختبار الاستراتيجيات العلاجية المختلفة والتحقق من صحتها. استخدمت العديد من الدراسات في السنوات القليلة الماضية مزارع من الأنسجة القشرية البشرية البالغة (hACtx) لنمذجة أمراض الدماغ البشري14،15،16،17،18،19 ؛ ومع ذلك ، تتوفر معلومات محدودة في سياق العلاج بالخلايا الجذعية. وقد أثبتت دراستان بالفعل جدوى النظام الموصوف هنا. في عام 2018 ، تبين أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المبرمجة بعوامل نسخ مختلفة وزرعها في أنسجة hACtx تؤدي إلى ظهور خلايا عصبية قشرية ناضجة يمكن أن تندمج في الشبكات القشرية البشرية البالغة20. في عام 2020 ، كشف زرع خلايا lt-NES في نظام النمط العضوي البشري عن قدرتها على التمايز إلى خلايا عصبية قشرية ناضجة خاصة بالطبقة مع الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية الوظيفية. أقامت الخلايا العصبية المطعمة اتصالات متشابكة واردة وصادرة مع الخلايا العصبية القشرية البشرية في شرائح الدماغ البالغة ، كما يؤكدها تتبع أحادي المشبك الرجعي لفيروس داء الكلب ، وتسجيلات المشبك التصحيحي للخلية الكاملة ، والمجهر الإلكتروني المناعي21.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول الإرشادات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية الإقليمية ، لوند ، السويد (رقم التصريح الأخلاقي 2021-07006-01). تم الحصول على أنسجة القشرة المخية الحديثة السليمة من المرضى الذين يخضعون لجراحة اختيارية لصرع الفص الصدغي. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى.

ملاحظة: تمت معالجة جميع الأنسجة التي تم الحصول عليها بغض النظر عن حجمها. ومع ذلك ، فإن الأنسجة الأصغر من 1-1.5 مم3 في الحجم ستكون صعبة تقنيا للتعامل معها وتقسيمها باستخدام اهتزاز.

1. جمع الأنسجة وصيانتها وقطعها وطلائها

  1. الاستعدادات في اليوم السابق لتقطيع الأنسجة
    1. تحضير 2 لتر من محلول القطع (الجدول 1) في قارورة حجمية. قم بإذابة جميع المكونات باستثناء MgCl 2 و CaCl2 في ~ 1800 مل من الماء منزوع الأيونات والفقاعات بغاز الكربوجين لمدة 15 دقيقة. ثم أضف كميات مناسبة من 1 M MgCl2 و CaCl2 واستمر في الفقاعات لمدة 15 دقيقة أخرى. أخيرا ، املأ القارورة بعلامة 2 لتر ؛ تحقق من درجة الحموضة والتناضح واضبطها إذا لزم الأمر. تجمد 2 × 350 مل من المحلول المحضر وتخزن الباقي على حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: عادة ما يكون الرقم الهيدروجيني والتناضح 7.3-7.4 و 295-300 mOsm على التوالي.
    2. تحضير 100 مل من محلول الشطف (الجدول 2). قم بإذابة 476 مجم من HEPES و 200.6 مجم من الجلوكوز في 100 مل من HBSS مع 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين. يمكن تخزين هذا في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 10 أيام.
    3. تحضير وسط الثقافة القشرية البشرية البالغة (hACtx) (وسط hACtx) (الجدول 3) وترشيحه في مختبر زراعة الخلايا تحت غطاء محرك السيارة جيد التهوية. يتكون الوسط من وسط عصبي بدون الفينول الأحمر (انظر جدول المواد) ، ومكمل B27 ، و L-glutamine (انظر جدول المواد) ، والجنتاميسين. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  2. الاستعدادات في يوم العملية قبل وصول عينات الأنسجة
    1. تحقق من توفر المعدات اللازمة ومساحة المختبر ، وقم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية والاهتزاز تماما (انظر جدول المواد) ، وكذلك مساحة الطاولة ، بالماء المقطر (بدون منظف) ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. اترك الإيثانول يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل استخدام الأدوات والمعدات.
    2. سحق محلول القطع المجمد وفقاعة "حساء" الثلج والسائل بغاز الكربوجين لمدة 30 دقيقة. ثم أغلق إحدى الحاويات بإحكام بالمحلول المسحوق "الحساء" وضعه في صندوق الثلج. سيتم استخدام هذا لجمع الأنسجة من غرفة العمليات.
    3. قم بمعايرة الاهتزاز واضبط معلمات القطع: سرعة 0.05 مم / ثانية واهتزاز 1.7 مم. ضع حجرة القطع على مرحلة اهتزازية وابدأ المبرد المتصل بها بحيث تكون الحجرة عند درجة حرارة ثابتة تبلغ -3 درجة مئوية.
    4. قم بإعداد غرفة جمع الشرائح بإدخالات لوضع شرائح الأنسجة ومحلول القطع ، مع غليها باستمرار بغاز الكربوجين في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. في مختبر زراعة الخلايا وتحت غطاء التهوية ، ضع إدخالات المزرعة في لوحة ذات 6 آبار باستخدام ملقط. أضف 5 مل من وسط hACtx في الجزء السفلي من الملحق حتى يلامس الغشاء ، وتجنب تكوين الفقاعات ، وأضف 2 مل في الجزء العلوي من الملحق. التوازن في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة2 ساعة على الأقل قبل نقل شرائح الأنسجة إلى الحشوات.
  3. إجراءات جمع الأنسجة وتقطيعها
    1. مباشرة بعد الاستئصال ، اجمع الأنسجة من المريض في غرفة العمليات ، إن أمكن ، مباشرة في وعاء به محلول قطع مجمد وفقاعات وسحق. انقل الحاوية المغلقة على الثلج على الفور إلى منطقة القطع في المختبر.
    2. افحص الأنسجة وحدد أفضل سطح للغراء (انظر الخطوة 1.3.3) إلى مرحلة قطع الاهتزاز ، مع مراعاة اتجاه الطبقات القشرية. إذا لزم الأمر ، قم بقص السطح غير المستوي بمشرط بحيث يسهل وضع الأنسجة على المسرح لتوجيه الشريحة الأمثل.
    3. قم بلصق الأنسجة على المسرح باستخدام مادة لاصقة للأنسجة (انظر جدول المواد) ، وضعها في غرفة التقطيع ، واملأ الحجرة على الفور بمحلول قطع فقاعات بارد. استمر في الفقاعات أثناء إجراء القطع بالكامل.
    4. قطع شرائح إكليلية أو سهمية ، اعتمادا على اتجاه الأنسجة إلى الشفرة ، بسمك 300 ميكرومتر لاحتواء جميع الطبقات القشرية ، وإذا أمكن ، المادة البيضاء. ضع الشرائح في غرفة التجميع بمحلول قطع الفقاعات في RT.
      ملاحظة: قطع من جانب المادة البيضاء باتجاه سطح القشرة. لا تقم بإزالة السحايا ، لأن هذا قد يتلف الأنسجة. عادة ما تقطع شفرة القطع من خلالها بسهولة.
    5. بمجرد قطع جميع الأنسجة ، انقل الشرائح إلى طبق بتري معقم بمحلول شطف في RT وانقلها إلى مختبر زراعة الخلايا. هذه الخطوة ضرورية لإزالة السكروز الزائد من الشرائح قبل نقلها إلى لوحة الثقافة.
      ملاحظة: لنقل الشرائح (في هذه الخطوة والخطوات التالية) ، استخدم ماصة زجاجية مقلوبة ، واقطع الجزء الأرق ، وضع حلمة مطاطية للشفط.
  4. زراعة وصيانة شرائح الأنسجة hACtx
    1. ضع شرائح الأنسجة بشكل فردي فوق الإدخالات المبللة والمغمورة بالفعل. بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسط لإزالة أي سكروز متبقي أو مواد متبقية أخرى من إجراءات القطع.
    2. استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد كل 7 أيام. بعد 2 أسابيع ، استخدم hACtx المتوسطة دون جنتاميسين. يمكن الحفاظ على الثقافة لمدة تصل إلى 2 أشهر.
      ملاحظة: قم بموازنة وسط hACtx في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعتين على الأقل قبل تغيير الوسط. يجب إعداد وسيط جديد كل 2 أسابيع. تحقق من الشرائح كل 2-3 أيام ، وإذا تبخر بعض الوسط ، أضف المزيد إلى الجزء العلوي من الإدخال.
حل القطعتركيز المخزونالتركيز النهائي [mM]لكل 1 لتر
سكروزذرور20068.46 غ
هيدروكسي الصوديوم 3ذرور211.76 غ
ككلذرور30.22 غ
NaH2PO4ذرور1.250.17 غ
الجلوكوزذرور101.80 غ
مغسو 41 م22 مل
CaCl21 م1.61.6 مل
إم جي سي إل22 م21 مل

الجدول 1: تكوين محلول القطع. يتم استخدام MgCl2 و CaCl2 كمحاليل 1 M معدة مسبقا في الماء منزوع الأيونات.

حل الشطفتركيز المخزونالتركيز النهائيلكل 100 مل
هبس1x95 مل
بنسترب10000 وحدة / مل500 وحدة / مل5 مل
هيبسذرور4.76 جم/لتر476 ملغ
الجلوكوزذرور2 غ/لتر200.6 مجم

الجدول 2: تكوين محلول الشطف.

hACtx المتوسطةتركيز المخزونالتركيز النهائيلكل 100 مل
وسط عصبي بدون فينول أحمر97.4 ملانظر جدول المواد
ب 2750 ضعفا1:502 مل
إل-جلوتامين100 ضعف1:200500 ميكرولترانظر جدول المواد
الجنتاميسين50 ملغ/مل1:1000100 ميكرولتر

الجدول 3: تكوين وسط hACtx.

2. تكاثر وتمايز خلايا lt-NES

ملاحظة: يتم إنشاء خلايا Lt-NES كما هو موضح سابقا21،22 ويتم تحويلها باستخدام ناقل عدسي فيروسي يحمل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت محفز تأسيسي (خلايا GFP-lt-NES). يتم تخزين قوارير تحتوي على 3 × 106 خلايا في -150 درجة مئوية حتى الاستخدام.

  1. إعداد حلول الأسهم والوسائط
    1. قم بتخفيف 100 ميكروغرام من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) في 10 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون يبلغ 10 ميكروغرام / مل. تحضير 100 ميكرولتر من القسامة.
    2. قم بتخفيف 100 ميكروغرام من عامل نمو البشرة (EGF) في 10 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون يبلغ 10 ميكروغرام / مل. تحضير 100 ميكرولتر من القسامة.
    3. ملحق Aliquot 50x B27 بحجم 100 ميكرولتر لكل قسولة.
    4. خفف 10 ملغ من بولي-إل-أورنيثين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات ليكون تركيز المخزون 100 ميكروغرام/مل. اصنع 1 مل من القسامة.
    5. تحضير 30 ميكرولتر من القسمة من 1.20 ملغ / مل لامينين الفأر.
    6. تمييع 10 مل من التربسين-EDTA (0.25٪) في 90 مل من PBS إلى تركيز مخزون 0.025٪. تحضير 1 مل من القسامة.
    7. خفف 0.025 غ من مثبطات التربسين في 50 مل من PBS إلى تركيز مخزون قدره 0.5 ملغم/مل. تحضير 1 مل من القسامة.
    8. قم بتخفيف 10 ميكروغرام من Wnt3a (عضو عائلة موقع تكامل MMTV من النوع بدون أجنحة 3A) في 1 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون يبلغ 10 ميكروغرام / مل. تحضير BMP4 (البروتين المورفولوجي العظمي 4) بنفس الطريقة. القسمة بحجم 100 ميكرولتر.
    9. تمييع 1 ملغ من السيكلوبامين في 2.5 مل من DMSO إلى تركيز نهائي قدره 400 ميكروغرام / مل ، وجعل 100 ميكرولتر القسامة.
    10. تحضير الوسط الأساسي (الجدول 4) والوسط المحدد بالتمايز (DDM ، الجدول 5) ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. طلاء أطباق الثقافة
    1. لطلاء الأطباق مسبقا لاستزراع خلايا GFP-It-NES أثناء الانتشار أو التمايز ، قم بتخفيف poly-L-ornithine 1: 100 في الماء منزوع الأيونات وأضف 5 مل من المحلول إلى قارورة T25. احتضان بين عشية وضحاها في RT.
    2. اغسل الألواح المطلية بالبولي L-ornithine 1x بالماء منزوع الأيونات و 1x باستخدام PBS.
    3. بالنسبة لخلايا GFP-It-NES في مرحلة التكاثر ، قم بتخفيف لامينين الفأر عند 1: 500 في PBS واحتضانه لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لخلايا GFP-It-NES في حالة تمايز ، قم بتخفيف لامينين الفأر عند 1: 100 في PBS واحتضانه لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
  3. تكاثر خلايا GFP-lt-NES
    1. دافئ 5 مل (للغسيل) و 5 مل (للبذر) من الوسط الأساسي في أنبوبين مختلفين سعة 15 مل.
    2. قم بإذابة قارورة واحدة من خلايا GFP-lt-NES بسرعة عند 37 درجة مئوية ، وانقلها إلى أنبوب الغسيل ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. نضح الوسط بعناية دون لمس الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الأساسي الذي تم تسخينه مسبقا. انقل معلق الخلية إلى أنبوب البذر الذي يحتوي على وسط أساسي مكمل بعوامل الانتشار: EGF (10 نانوغرام / مل) ، bFGF (10 نانوغرام / مل) ، و B27 (10 نانوغرام / مل). بذر الخلايا على دورق T25 مغلف ببولي-L-ornithine / laminin.
    4. تغذية الخلايا مع عوامل الانتشار كل يوم. استبدل الوسيط إذا تحول إلى اللون الأصفر. مرور الخلايا كل يوم ثالث أو رابع (1 يوم بعد أن تصل إلى التقاء 100٪).
  4. تقسيم خلايا GFP-lt-NES للتكاثر والتمايز
    1. قم بالتسخين المسبق 5 مل من الوسط الأساسي لكل قارورة (لجمع الخلايا) ، بالإضافة إلى الحجم الإجمالي اللازم لإعادة زرعها.
      ملاحظة: يتم المرور بتخفيف 1: 3 للحفاظ على الخلايا في حالة تكاثر ، مما يتطلب 15 مل من الوسط الأساسي ، وتخفيف 1: 6 لبدء التمايز ، مما يتطلب 30 مل من الوسط الأساسي.
    2. قم بإزالة الوسط من قارورة زراعة الخلايا عن طريق الشفط ، وأضف 500 ميكرولتر من التربسين 0.025٪ المسخن مسبقا. احتضان لمدة 5-10 دقائق في RT. يمكن تأكيد انفصال الخلايا تحت مجهر ضوئي قياسي عند تكبير 10x.
    3. أضف حجما متساويا من مثبطات التربسين (0.5 ملغم / مل التركيز النهائي) متبوعا ب 5 مل من الوسط الأساسي الدافئ. افصل الخلايا واجمع عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام.
    4. للحفاظ على تكاثر الخلايا ، أعد الطلاء بتخفيف 1: 3 في وسط أساسي جديد مكمل بعوامل الانتشار ، وكرر الخطوة 2.3.4.
  5. التمايز القشري لخلايا GFP-lt-NES
    1. في اليوم 0 ، أعد تعليق الخلايا (لاستخدامها في التمايز) في 30 مل من الوسط الأساسي المكمل بعوامل الانتشار ، وقم بوضعها في ست قوارير T25 مغلفة بالتمايز (انقسام 1: 6).
    2. في اليوم 1 ، قم بتغيير نصف الوسط إلى DDM ، وأضف عوامل الانتشار بنصف تركيزها.
    3. في اليوم 2 ، قم بتغيير الوسط تماما إلى DDM المكمل بعوامل التمايز: BMP4 (10 نانوغرام / مل) ، Wnt3a (10 نانوغرام / مل) ، وسيكلوبامين (400 نانوغرام / مل).
    4. في اليوم 4 ، أضف عوامل التمايز وحدها. استبدل الوسيط إذا تحول إلى اللون الأصفر.
    5. في اليوم 6 ، قم بتغيير الوسيط إلى DDM المكمل ب BMP4 و Wnt3a. تتم إزالة السيكلوبامين في هذه الخطوة.
    6. في اليوم السابع ، افصل الخلايا كما هو مذكور في الخطوة 2.4.2 والخطوة 2.4.3.
الوسط الأساسيتركيز المخزونالتركيز النهائيلكل 100 مل
DMEM/F12 مع إل-جلوتامين1x98.7 مل
ملحق N-2100 ضعف1:1001 مل
الجلوكوز45%3.5 مل / لتر350 ميكرولتر

الجدول 4: تكوين وسط انتشار خلايا lt-NES (الوسط الأساسي).

DDM المتوسطةتركيز المخزونالتركيز النهائيلكل 100 مل
DMEM/F12 مع إل-جلوتامين96 مل
ن2100 ×1:1001 مل
نيا100 ×1:1001 مل
بيروفات الصوديوم100 مللي متر1:1001 مل
BSA V الكسر7.5%6.6 مل / لتر660 ميكرولتر
2-ميركابتوإيثانول50 نيوتن متر7 ميكرولتر / لتر0.7 ميكرولتر
الجلوكوز45%3.2 مل / لتر320 ميكرولتر

الجدول 5: تكوين الوسط المحدد بالتمايز (DDM) لخلايا lt-NES.

3. زرع خلايا GFP-lt-NES في شرائح hACtx ذات النمط العضوي

ملاحظة: يجب زراعة أنسجة hACtx لمدة 1 أسبوع قبل زرع الخلايا. لتسهيل إجراء عملية الزرع ، من الضروري إزالة 2 مل من وسط hACtx من أعلى الملحق لمنع الأنسجة من الطفو.

  1. أعد تعليق خلايا GFP-lt-NES المحضرة قشريا (من الخطوة 2.5.6) في مصفوفة غشاء القاعدية النقية الباردة (انظر جدول المواد) بتركيز 1 × 105 خلايا / ميكرولتر ونقل المحلول إلى أنبوب معقم أصغر.
    ملاحظة: أثناء إجراء عملية الزرع ، يجب تبريد جميع المواد (أطراف الماصة ، الأنابيب ، الشعيرات الدموية ، إلخ) مسبقا لتجنب تصلب الهلام. قم بإذابة جل مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج لمدة 30 دقيقة قبل استخدامه.
  2. اجمع تعليق الخلية في شعرية زجاجية باردة متصلة بحلمة مطاطية للشفط. حقن معلق الخلية كقطرات صغيرة (حوالي 1 ميكرولتر لكل منها) عن طريق طعن شريحة الأنسجة شبه الجافة في مواقع مختلفة.
  3. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يتماسك الجل. انقل اللوحة من الحاضنة مرة أخرى إلى الغطاء ، وأضف بعناية 2 مل من وسط hACtx إلى الجزء العلوي من الملحق لغمر الأنسجة تماما.
  4. استبدل وسط الاستزراع بوسيط hACtx جديد مرة واحدة في الأسبوع.

4. التحقق من الصحة

  1. تلطيخ شرائح hACtx
    1. في الوقت المطلوب ، أخرج الشرائح من مختبر زراعة الخلايا ، وقم بإزالتها من الإدخال عن طريق غمرها في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى قوارير ملطخة باستخدام ماصة زجاجية مقلوبة (انظر الملاحظة في الخطوة 1.3.5) ، وقم بتثبيتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. شطف 3x مع KPBS لمدة 15 دقيقة في كل مرة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع محلول نفاذية (0.02٪ BSA و 1٪ Triton X-100 في KPBS).
    3. في اليوم التالي ، أضف محلول الحجب (KPBS مع 0.2٪ Triton X-100 ، 1٪ BSA ، أزيد الصوديوم [1: 10000] ، و 10٪ مصل حمار عادي) ، واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    4. بعد الحجب ، أضف الأجسام المضادة الأولية (انظر الجدول 6 للتخفيفات) المخففة في محلول الحجب ، واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    5. اغسل 3 مرات بمحلول مانع دون إضافة السيروم لمدة 15 دقيقة لكل منهما. تضاف الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول الحجب (انظر الجدول 6 للتخفيفات) ، وتحتضن لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    6. اغسل 3 مرات بمحلول مانع بدون مصل ، واحتضن لمدة 2 ساعة في RT في صبغة Hoechst المخففة في محلول النفاذية (1: 1000).
    7. اغسل 3 مرات باستخدام KPBS ، وقم بتركيب الشرائح على شرائح زجاجية باستخدام فرشاة الرسم ، واتركها تجف. أخيرا ، اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات ، وقم بإزالة الماء الزائد ، وأضف وسيط التثبيت ، وقم بتغطيته بغطاء زجاجي. احتفظ بالشرائح لمدة 24 ساعة على الأقل في RT ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
      ملاحظة: بالنسبة للأجسام المضادة التي تضع علامات على الحواتم النووية ، قم بإجراء استرجاع المستضد قبل النفاذية (الخطوة 4.1.2) مع سترات الصوديوم (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 6.0) لمدة ساعتين عند 65 درجة مئوية.
  2. المشبك التصحيح الخلية الكاملة
    1. في يوم التسجيل ، قم بإعداد 1 لتر من السائل النخاعي الاصطناعي البشري (haCSF) ، المعدل ليتناسب بشكل أفضل مع بيئة الدماغ البشري (الجدول 7). على غرار محلول القطع ، اصنع ما يقرب من 900 مل من المحلول مع جميع المكونات باستثناء CaCl 2 المذاب في الماء منزوع الأيونات ، وقم بفقاعته بالكربوجين لمدة 15 دقيقة قبل إضافة الحجم المناسب من 1 M CaCl2 محلول. املأ القارورة الحجمية إلى علامة 1 لتر ، واستمر في الفقاعات في RT لمدة 15 دقيقة إضافية قبل بدء التسجيل وطوال التجربة.
    2. انقل شرائح الأنسجة من صفيحة المزرعة إلى غرفة التسجيل على مسرح مجهر قائم يتم تعطيره باستمرار باستخدام haCSF الفقاعي بمعدل تروية 2 مل / دقيقة ويتم تسخينه إلى 34 درجة مئوية باستخدام جهاز تحكم في درجة حرارة الحمام.
    3. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة إلى متوسط مقاومة 3-5 MΩ ، وردم الشعيرات الدموية بمحلول داخلي قائم على K-gluconate (الجدول 8) مع 2-4 ملغ مضاف حديثا من البيوسيتين لتحديد الخلايا المسجلة بعد التخصيص. الرقم الهيدروجيني والأسمولية لهذا الحل الداخلي هما 7.2-7.3 و 285-295 mOsm ، على التوالي.
    4. في حالة تسجيل الخلية المضيفة ، احصل على نظرة عامة تقريبية على الشريحة ذات الهدف 4x ، وابحث عن خلية ذات مظهر صحي لتصحيحها بهدف 40x. بعد ذلك ، تابع مشبك التصحيح القياسي للخلية الكاملة.
    5. في حالة تسجيل الخلايا المطعمة ، حدد منطقة الأنسجة بالخلايا المطعمة باستخدام هدف 4x ومرشح epifluorescence في النطاق الأزرق (460 نانومتر) بواسطة تعبير مراسل GFP في الكسب غير المشروع. بعد ذلك ، قم بتكبير المنطقة الموجودة بهدف 40x ، وابحث عن خلية مطعمة تعبر عن GFP لمشبك تصحيح قياسي كامل الخلية.
    6. تحقق من إمكانات غشاء الراحة (RMP) فور اقتحام الخلية ، وتأكد من أن جودة التسجيل جيدة. سجل جميع المعلمات ذات الأهمية (على سبيل المثال ، مقاومة الغشاء [Ri] ، ومعلمات AP ، وتيارات الصوديوم والبوتاسيوم ، والنشاط المشبكي) في جهد الخلية بالكامل أو تكوين المشبك الحالي.
    7. بعد جمع جميع البيانات اللازمة ، اسحب ماصة التسجيل بعناية دون إلحاق المزيد من الضرر بالخلية بحيث يمكن التعرف عليها باستخدام تلطيخ مناعي بعد التخصيص.
    8. انقل الشريحة إلى محلول PFA بنسبة 4٪ لمزيد من التثبيت والتلوين ، كما هو موضح في الخطوة 4.1. يستخدم الستربتافيدين لتسمية الخلايا المملوءة بالبوسيتين أثناء التسجيلات.
الاجسام المضادهالتخفيفتلاحظ 
ابتدائي
دجاج مضاد ل GFP1:1000
دجاج مضاد ل MAP21:1000
الماعز المضادة AiF11:100
الماوس مكافحة MBP1:1000مطلوب استرجاع المستضد
ماوس مضاد SC1231:2000
أرنب مضاد للنيوين1:1000
أرنب مضاد أوليج 21:500
أرنب مضاد Tmem1191:200
ثانوي
488 مترافق AffinityPure Donkey مضاد للفأر IgG1:500
488 مترافق تقارب حمار نقي مضاد للأرانب IgG1:500
488 مترافق AffinityPure Donkey مضاد للدجاج IgG1:500
Cy3-مترافق التقاربالحمار النقي مكافحة الدجاج IgG1:500
Cy3-مترافق التقاربحمار نقي مضاد للماعز IgG1:500
Cy3-مترافق تقارب حمار نقي مضاد للفأر IgG1:500
أليكسا فلور 647 مترافق ستربتافيدين1:500

الجدول 6: قائمة الأجسام المضادة الأولية والثانوية للكيمياء الهيستولوجية المناعية.

هاكفتركيز المخزونالتركيز النهائي [mM]لكل 1 لتر
كلوريد الصوديومذرور1297.54 غ
هيدروكسي الصوديوم 3ذرور211.76 غ
الجلوكوزذرور101.80 غ
ككلذرور30.22 غ
NaH2PO4ذرور1.250.17 غ
مغسو 41 م22 مل
CaCl21 م1.61.6 مل

الجدول 7: تكوين السائل النخاعي الاصطناعي (haCSF).

محلول K-غلوكونات الداخليتركيز المخزونالتركيز النهائي [mM]لكل 100 مل
ك-غلوكوناتذرور122.52.87 غ
ككلذرور12.593.18 مجم
كلوريد الصوديومذرور846.76 مجم
هيبسذرور10238.32 مجم
مغاتبذرور2101.4 مجم
Na3GTPذرور0.317.0 مجم
ملاحظه: ضبط درجة الحموضة مع KOH / HCl

الجدول 8: تكوين محلول داخلي قائم على K-gluconate.

النتائج

باتباع البروتوكول الموصوف ، تم جمع ومعالجة أنسجة hACtx من مريض مصاب بصرع الفص الصدغي ، كما هو موضح أعلاه. تم تثبيت بضع شرائح بعد 24 ساعة في الثقافة لدراسة نقطة البداية للأنسجة المضيفة. أظهر تحليل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة مثل الخلايا العصبية (معبرا عن NeuN و Map2 ، الشكل 1A) ، والخلايا قليلة ?...

Discussion

يعد الحصول على شرائح hACtx ذات الجودة العالية بما يكفي الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. يتم الحصول على الأنسجة القشرية من مرضى الصرع الذين يخضعون لجراحة استئصالية24. جودة الأنسجة المقطوعة ، وكذلك وقت تعرض الأنسجة بين الاستئصال والثقافة ، أمر بالغ الأهمية. كلما تم...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من مجلس البحوث السويدي ، ومؤسسة الدماغ السويدية ، والمؤسسة السويدية للسكتة الدماغية ، ومنطقة Skåne ، ومؤسسة Thorsten and Elsa Segerfalk ، ومبادرة الحكومة السويدية لمجالات البحث الاستراتيجي (StemTherapy).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Bath temperature controller Luigs & NeumannTC0511354
Calcium Chloride dihydrateMerck102382
Carbogen gasAir LiquideNA
CoolerJulaba FL 3009661012.03
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Double Patch-Clamp amplifierHEKA electronicEPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium saltMillipore371701
HEPESAppliChemA1069
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670
Magnesium Sulfate heptahydrateSigma-Aldrich230391
PatchmasterHEKA electronicPatchmaster 2x91
Pipette PullerSutterP-2000
Plastic Petri dishAny suitable
Potassium chlorideMerck104936
Potassium D-gluconateThermoFisherB25135
Rubber teat + glass pipetteAny suitable
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateMerck106346
SucroseSigma-AldrichS7903
Tissue adhesive: Acryl super glueLoctite2062278
Upright microscopeOlympusBX51WI 
Vibratome LeicaVT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)ThermoFisher Scientific14175095
HEPESAppliChemA1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plateThermoFisher Scientific140675
Alvetex scaffold 6 well insertReinnervate LtdAVP004-96
B27 Supplement (50x)ThermoFisher Scientific17504001
BrainPhys without Phenol RedStemCell technologies#05791Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mLCorning SigmaCLS431096/97
ForcepsAny suitable
Gentamicin (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific15750037
Glutamax Supplement (100x)ThermoFisher Scientific35050061Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipetteAny suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Animal Free Recombinant EGFPeprotechAF-100-15
B27 Suplemment (50x)Thermo Fisher Scientific17504001
bFGFPeprotechAF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)ThermoFisher Scientific15260037
Cyclopamine, V. calcifornicumCalbiochem# 239803
D (+) Glucose solution (45%)SigmaG8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2438-10mL
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-144Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, NaturalThermo Fisher Scientific23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)ThermoFisher Scientific11140050
N-2 Supplement (100 x)ThermoFisher Scientific17502001
Poly-L-OrnithineMerkP3655
Recombinant Human BMP-4 ProteinR&D Systems314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a ProteinR&D Systems5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powderThermo Fisher Scientific17075029
Sterile deionized waterMilliQMilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)SigmaT4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µLEppendorfVarious
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)CorningCLS354277-1EA
CentrifugeHettich CentrifugenRotina 420R5% CO2, 37 °C
IncubatorThermoForma Steri-Cult CO2HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mmVitrolife14601
Sterile tubesSarstedtVarious
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mmVWR612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µLBiotix VWRVarious
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mLCostarVarious
T25 flasks NuncThermoFisher Scientific156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoReserach715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoReserach711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgGJackson ImmunoReserach703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated StreptavidinJackson ImmunoReserach016-600-084
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoReserach001-000-162
Chicken anti-GFPMerk MilliporeAB16901
Chicken anti-MAP2 Abcamab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgGJackson ImmunoReserach703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgGJackson ImmunoReserach705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoReserach715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)Sigma AldrichD27802Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal) BioradAHP2024
Hoechst 33342Molecular ProbesNuclear staining
Mouse anti-MBP BioLegend808402
Mouse anti-SC123 Stem Cells IncAB-123-U-050
Normal Donkey SerumMerk MilliporeS30-100
Paint brushAny suitable
Paraformaldehyde (PFA)Sigma Aldrich150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
     Distilled water
     Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)Merk Millipore104873
     Potassium phospate dibasic (K2HPO4)Sigma AldrichP3786
     Sodium chloride (NaCl)Sigma AldrichS3014
Rabbit anti-NeuN Abcamab104225
Rabbit anti-Olig2 Abcamab109186
Rabbit anti-TMEM119 Abcamab185333
Sodium azideSigma AldrichS2002-5G
Sodium citrate
       Distilled water
       Tri-Sodium CitrateSigma AldrichS1804-500G
       Tween-20Sigma AldrichP1379
Triton X-100ThermoFisher Scientific327371000 
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscopeZeissLSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mmVWR630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mmMarienfeld107242
Microscope SoftwareZeissZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipetteAny suitable

References

  1. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
  2. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
  4. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
  5. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
  6. Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
  7. Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
  8. Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
  9. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  10. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
  11. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  12. Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
  13. Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
  14. Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  15. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  16. Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
  17. Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
  18. Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
  19. Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
  20. Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
  21. Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
  22. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
  23. Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
  24. Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
  25. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
  26. Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
  27. Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
  28. Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
  29. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  30. Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
  31. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  32. Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
  33. Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
  34. Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved