Colture organotipiche della corteccia umana adulta come modello ex vivo per il trapianto e la validazione di cellule staminali umane

Riepilogo

Questo protocollo descrive colture organotipiche a lungo termine di corteccia umana adulta combinate con trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, che presentano una nuova metodologia per testare ulteriormente terapie basate su cellule staminali per malattie neurodegenerative umane.

Abstract

Le malattie neurodegenerative sono comuni ed eterogenee in termini di sintomi e affettività cellulare, rendendo il loro studio complicato a causa della mancanza di modelli animali adeguati che imitano completamente le malattie umane e della scarsa disponibilità di tessuto cerebrale umano post-mortem. La coltura del tessuto nervoso umano adulto offre la possibilità di studiare diversi aspetti dei disturbi neurologici. I meccanismi molecolari, cellulari e biochimici potrebbero essere facilmente affrontati in questo sistema, così come testare e convalidare farmaci o trattamenti diversi, come le terapie cellulari. Questo metodo combina colture organotipiche a lungo termine della corteccia umana adulta, ottenute da pazienti epilettici sottoposti a chirurgia resettiva, e trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo consentirà lo studio della sopravvivenza cellulare, della differenziazione neuronale, della formazione di input e output sinaptici e delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule derivate dall'uomo dopo il trapianto in tessuto corticale umano adulto intatto. Questo approccio è un passo importante prima dello sviluppo di una piattaforma 3D di modellazione delle malattie umane che avvicinerà la ricerca di base alla traduzione clinica delle terapie basate su cellule staminali per pazienti con diversi disturbi neurologici e consentirà lo sviluppo di nuovi strumenti per la ricostruzione dei circuiti neurali danneggiati.

Introduzione

I disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer o l'ictus ischemico, sono un gruppo di malattie che condividono la caratteristica comune del malfunzionamento o della morte neuronale. Sono eterogenei in termini di area cerebrale e popolazione neuronale interessata. Sfortunatamente, i trattamenti per queste malattie sono scarsi o di efficacia limitata a causa della mancanza di modelli animali che imitano ciò che accade nel cervello umano ^1,2. La terapia con cellule staminali è una delle strategie più promettenti per la rigenerazione cerebrale³. La generazione di progenitori neuronali da cellule staminali provenienti da diverse fonti è stata notevolmente sviluppata negli ultimi anni ^4,5. Recenti pubblicazioni hanno dimostrato che cellule staminali pluripotenti (iPS) derivate da cellule staminali neuroepiteliali autorinnovanti (lt-NES) derivate da cellule staminali neuroepiteliali autorinnovanti umane, seguendo un protocollo di differenziazione corticale e dopo trapianto intracorticale in un modello di ratto con ictus ischemico che colpisce la corteccia somatosensoriale, generano neuroni corticali maturi. Inoltre, i neuroni derivati dall'innesto hanno ricevuto connessioni sinaptiche afferenti ed efferenti dai neuroni ospiti, mostrando la loro integrazione nella rete neuronale del ratto ^6,7. Gli assoni derivati dall'innesto erano mielinizzati e trovati in diverse aree del cervello del ratto, tra cui l'area peri-infartuale, il corpo calloso e la corteccia somatosensoriale controlaterale. Ancora più importante, il trapianto derivato da cellule iPS ha invertito i deficit motori negli animali colpiti da ictus⁷.

Anche se i modelli animali aiutano a studiare la sopravvivenza del trapianto, l'integrazione neuronale e l'effetto delle cellule innestate sulle funzioni motorie e cognitive, in^{questo sistema mancano} informazioni sull'interazione tra cellule umane (graft-host) ^8,9. Per questo motivo, viene descritto un metodo combinato di coltura organotipica del cervello umano a lungo termine con il trapianto ex vivo di progenitori neuronali derivati da cellule iPS umane. Le colture organotipiche del cervello umano ottenute da resezioni neurochirurgiche sono modelli 3D fisiologicamente rilevanti del cervello che consentono ai ricercatori di aumentare la loro comprensione dei circuiti del sistema nervoso centrale umano e del modo più accurato di testare i trattamenti per i disturbi cerebrali umani. Tuttavia, non sono state fatte abbastanza ricerche in questo contesto e, nella maggior parte dei casi, sono state utilizzate colture organotipiche del cervello ippocampale umano^10,11. La corteccia cerebrale è affetta da diverse malattie neurodegenerative, come l'ictus ischemico¹² o il morbo di Alzheimer¹³, quindi è importante avere un sistema 3D corticale umano che ci permetta di espandere le nostre conoscenze e di testare e convalidare diverse strategie terapeutiche. Diversi studi negli ultimi anni hanno utilizzato colture di tessuto corticale umano adulto (hACtx) per modellare le malattie del cervello umano 14,15,16,17,18,19; Tuttavia, sono disponibili informazioni limitate nel contesto della terapia con cellule staminali. Due studi hanno già dimostrato la fattibilità del sistema qui descritto. Nel 2018, le cellule staminali embrionali umane programmate con diversi fattori di trascrizione e trapiantate nel tessuto hACtx hanno dimostrato di dare origine a neuroni corticali maturi che potrebbero integrarsi nelle reti corticali umane adulte²⁰. Nel 2020, il trapianto di cellule lt-NES nel sistema organotipico umano ha rivelato la loro capacità di differenziarsi in neuroni corticali maturi e stratificati specifici con le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni funzionali. I neuroni innestati hanno stabilito contatti sinaptici sia afferenti che efferenti con i neuroni corticali umani nelle fette di cervello adulto, come confermato dal tracciamento monosinaptico retrogrado del virus della rabbia, dalle registrazioni di patch-clamp a cellule intere e dalla microscopia immunoelettronica²¹.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida approvate dal Comitato etico regionale, Lund, Svezia (numero di permesso etico 2021-07006-01). Il tessuto neocorticale sano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva per l'epilessia del lobo temporale. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.

NOTA: Tutti i tessuti ottenuti sono stati lavorati indipendentemente dalle loro dimensioni. Tuttavia, i tessuti di dimensioni inferiori a 1-1,5 mm³ saranno tecnicamente difficili da maneggiare e sezionare con un vibratomo.

1. Raccolta, manutenzione, taglio e placcatura dei tessuti

1. Preparazioni il giorno prima dell'affettatura dei tessuti
   1. Preparare 2 L di soluzione di taglio (tabella 1) in un matraccio tarato. Sciogliere tutti gli ingredienti tranne MgCl 2 e CaCl₂ in ~1.800 ml di acqua deionizzata e bolle con gas carbogeno per 15 minuti. Quindi aggiungere quantità appropriate di soluzioni 1 M MgCl 2 e CaCl₂ e continuare a gorgogliare per altri 15 minuti. Infine, riempire il matraccio fino al segno 2 L; controllare il pH e l'osmolarità e regolare se necessario. Congelare 2 x 350 mL della soluzione preparata e conservare il resto a 4 °C.
      NOTA: Il pH e l'osmolarità sono tipicamente 7,3-7,4 e 295-300 mOsm, rispettivamente.
   2. Preparare 100 ml di soluzione di risciacquo (Tabella 2). Sciogliere 476 mg di HEPES e 200,6 mg di glucosio in 100 ml di HBSS integrati con 5 ml di penicillina / streptomicina. Questo può essere conservato a 4 °C per un massimo di 10 giorni.
   3. Preparare il terreno di coltura corticale adulto umano (hACtx) (hACtx medium) (Tabella 3) e filtrarlo nel laboratorio di coltura cellulare sotto una cappa ventilata. Il mezzo comprende il mezzo neuronale senza rosso fenolo (vedi la tabella dei materiali), l'integratore di B27, la L-glutammina (vedi la tabella dei materiali) e la gentamicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Preparativi il giorno dell'operazione prima dell'arrivo dei campioni di tessuto
   1. Verificare la disponibilità delle attrezzature necessarie e dello spazio di laboratorio e pulire accuratamente tutti gli strumenti chirurgici e il vibratomo (vedere la tabella dei materiali), nonché lo spazio del banco, con acqua distillata (senza detergente), seguita da etanolo al 70%. Lasciare asciugare l'etanolo per almeno 30 minuti prima di utilizzare gli strumenti e le attrezzature.
   2. Schiacciare la soluzione di taglio congelata e far bollire la "zuppa" di ghiaccio e liquido con gas carbogen per 30 minuti. Quindi, chiudere ermeticamente uno dei contenitori con la soluzione schiacciata "zuppa" e metterlo nella ghiacciaia. Questo sarà utilizzato per raccogliere il tessuto dalla sala operatoria.
   3. Calibrare il vibratomo e impostare i parametri di taglio: velocità 0,05 mm/s e vibrazione 1,7 mm. Posizionare la camera di taglio su uno stadio di vibratomo e avviare il dispositivo di raffreddamento collegato ad essa in modo che la camera sia a una temperatura costante di -3 °C.
   4. Preparare la camera di raccolta delle fette con inserti per posizionare le fette di tessuto e la soluzione di taglio, gorgogliandola costantemente con gas carbogeno a temperatura ambiente (RT).
   5. Nel laboratorio di coltura cellulare e sotto un cappuccio ventilato, posizionare gli inserti di coltura in una piastra a 6 pozzetti usando una pinza. Aggiungere 5 mL di mezzo hACtx sul fondo dell'inserto fino a quando non entra in contatto con la membrana, evitando la formazione di bolle, e aggiungere 2 mL sulla parte superiore dell'inserto. Equilibrare nell'incubatore a 37 °C e 5% CO 2 per almeno₂ ore prima di trasferire le fette di tessuto negli inserti.
3. Procedure di raccolta e affettamento dei tessuti
   1. Immediatamente dopo la resezione, raccogliere il tessuto dal paziente nella sala operatoria, se possibile, direttamente in un contenitore con soluzione di taglio congelata, bollata e schiacciata. Trasferire immediatamente il contenitore chiuso sul ghiaccio nell'area di taglio del laboratorio.
   2. Ispezionare il tessuto e individuare la superficie migliore per incollarlo (vedi punto 1.3.3) alla fase di taglio del vibratomo, considerando l'orientamento degli strati corticali. Se necessario, tagliare la superficie irregolare con un bisturi in modo che sia facile posizionare il tessuto sul palco per un orientamento ottimale delle fette.
   3. Incollare il tessuto al palco con adesivo per tessuti (vedere la tabella dei materiali), posizionarlo nella camera di affettatura e riempire immediatamente la camera con una soluzione di taglio a bolle fredde. Continuare la gorgogliatura durante tutta la procedura di taglio.
   4. Tagliare fette coronali o sagittali, a seconda dell'orientamento tessuto-lama, ad uno spessore di 300 μm per contenere tutti gli strati corticali e, se possibile, la sostanza bianca. Posizionare le fette nella camera di raccolta con soluzione di taglio gorgogliante a RT.
      NOTA: Tagliare dal lato della sostanza bianca verso la superficie della corteccia. Non rimuovere le meningi, in quanto ciò potrebbe danneggiare il tessuto. La lama da taglio di solito li taglia facilmente.
   5. Una volta che tutto il tessuto è stato tagliato, trasferire le fette in una capsula di Petri sterile con soluzione di risciacquo a RT e trasportarle al laboratorio di coltura cellulare. Questo passaggio è necessario per rimuovere il saccarosio in eccesso dalle fette prima di trasferirle nella piastra di coltura.
      NOTA: Per trasferire le fette (in questa e nei passaggi seguenti), utilizzare una pipetta di vetro rovesciata, rompere la parte più sottile e posizionare una tettarella di gomma per l'aspirazione.
4. Coltura e mantenimento di fette di tessuto hACtx
   1. Posizionare individualmente le fette di tessuto sopra gli inserti già bagnati e sommersi. Dopo 24 ore, cambiare il mezzo per rimuovere ulteriormente eventuali residui di saccarosio o altre sostanze residue dalle procedure di taglio.
   2. Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco ogni 7 giorni. Dopo 2 settimane, utilizzare hACtx medium senza gentamicina. La coltura può essere mantenuta per un massimo di 2 mesi.
      NOTA: Equilibrare il mezzo hACtx nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO 2 per almeno₂ ore prima del cambio del fluido. Il mezzo fresco dovrebbe essere preparato ogni 2 settimane. Controllare le fette ogni 2-3 giorni e, se parte del mezzo è evaporato, aggiungerne altro nella parte superiore dell'inserto.

Soluzione di taglio	Concentrazione delle scorte	Concentrazione finale [mM]	Per 1 L
Saccarosio	Polvere	200	68,46 g
NaHCO3	Polvere	21	1,76 g
Kcl	Polvere	3	0,22 g
NaH2PO4	Polvere	1.25	0,17 g
Glucosio	Polvere	10	1,80 g
MgSO4	1 m	2	2 ml
CaCl2	1 m	1.6	1,6 ml
MgCl2	2 m	2	1 mL

Tabella 1: Composizione della soluzione di taglio. MgCl 2 e CaCl₂ sono usati come soluzioni 1 M prepreparate in acqua deionizzata.

Soluzione di risciacquo	Concentrazione delle scorte	Concentrazione finale	Per 100 mL
HBSS	1x		95 ml
PenStrep	10.000 U/mL	500 U/mL	5 ml
HEPES	Polvere	4,76 g/L	476 mg
Glucosio	Polvere	2 g/L	200,6 mg

Tabella 2: Composizione della soluzione di risciacquo.

hACtx medio	Concentrazione delle scorte	Concentrazione finale	Per 100 mL
Mezzo neuronale senza rosso fenolo			97,4 ml	vedi Tabella dei Materiali
B27	50x	1:50	2 ml
L-Glutammina	100x	1:200	500 μL	vedi Tabella dei Materiali
Gentamicina	50 mg/ml	1:1000	100 μL

Tabella 3: Composizione del mezzo hACtx.

2. Proliferazione e differenziamento di cellule lt-NES

NOTA: Le cellule Lt-NES sono generate come precedentemente descritto^21,22 e trasdotte con un vettore lentivirale che trasporta la proteina fluorescente verde (GFP) sotto un promotore costitutivo (cellule GFP-lt-NES). I flaconcini contenenti 3 x 10⁶ cellule vengono conservati a -150 °C fino all'uso.

1. Preparazione delle soluzioni stock e dei supporti
   1. Diluire 100 μg di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) in 10 mL di PBS-0,1% BSA per ottenere una concentrazione stock di 10 μg/mL. Preparare 100 μL di aliquote.
   2. Diluire 100 μg di fattore di crescita epidermico (EGF) in 10 mL di PBS-0,1% BSA per avere una concentrazione di stock di 10 μg/mL. Preparare 100 μL di aliquote.
   3. Aliquot 50x B27 supplemento in un volume di 100 μL per aliquota.
   4. Diluire 10 mg di poli-L-ornitina in 100 mL di acqua deionizzata per ottenere una concentrazione di riserva di 100 μg/mL. Fare 1 mL di aliquote.
   5. Preparare 30 μL di aliquote di 1,20 mg/mL di laminina di topo.
   6. Diluire 10 mL di tripsina-EDTA (0,25%) in 90 mL di PBS fino a una concentrazione stock dello 0,025%. Preparare 1 mL di aliquote.
   7. Diluire 0,025 g di inibitore della tripsina in 50 mL di PBS ad una concentrazione stock di 0,5 mg/ml. Preparare 1 mL di aliquote.
   8. Diluire 10 μg di Wnt3a (membro della famiglia 3A del sito di integrazione MMTV senza ali) in 1 mL di PBS-0,1% BSA per ottenere una concentrazione di stock di 10 μg/mL. Preparare BMP4 (proteina morfogenetica ossea 4) allo stesso modo. Aliquote in volume di 100 μL.
   9. Diluire 1 mg di ciclopamina in 2,5 mL di DMSO ad una concentrazione finale di 400 μg/mL ed effettuare 100 μL di aliquote.
   10. Preparare il terreno di base (Tabella 4) e il terreno definito dalla differenziazione (DDM, Tabella 5) e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Rivestimento di piatti di cultura
   1. Per pre-rivestire i piatti per coltivare le cellule GFP-It-NES durante la proliferazione o la differenziazione, diluire la poli-L-ornitina 1:100 in acqua deionizzata e aggiungere 5 ml della soluzione in un matraccio T25. Incubare durante la notte a RT.
   2. Lavare le piastre rivestite di poli-L-ornitina 1x con acqua deionizzata e 1x con PBS.
   3. Per le cellule GFP-It-NES in proliferazione, diluire la laminina di topo a 1:500 in PBS e incubare per almeno 2 ore a 37 °C. Per le cellule GFP-It-NES in differenziamento, diluire la laminina di topo a 1:100 in PBS e incubare per almeno 2 ore a 37 °C.
3. Proliferazione delle cellule GFP-lt-NES
   1. Riscaldare 5 mL (per il lavaggio) e 5 mL (per la semina) di terreno di base in due diverse provette da 15 mL.
   2. Scongelare rapidamente un flaconcino di cellule GFP-lt-NES a 37 °C, trasferirle nel tubo di lavaggio e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
   3. Aspirare il mezzo con attenzione senza toccare il pellet e risospendere le celle in 1 ml di terreno di base preriscaldato. Trasferire la sospensione cellulare nel tubo di semina contenente terreno di base integrato con fattori di proliferazione: EGF (10 ng / mL), bFGF (10 ng / mL) e B27 (10 ng / mL). Seminare le cellule su un matraccio T25 rivestito di poli-L-ornitina / laminina.
   4. Nutrire le cellule con fattori di proliferazione ogni giorno. Sostituire il mezzo se diventa giallo. Passare le cellule ogni terzo o quarto giorno (1 giorno dopo che hanno raggiunto il 100% di confluenza).
4. Divisione delle cellule GFP-lt-NES per la proliferazione e la differenziazione
   1. Preriscaldare 5 ml di terreno di base per matraccio (per raccogliere le cellule), più il volume totale necessario per riseminarle.
      NOTA: Il passaggio viene eseguito ad una diluizione 1:3 per mantenere le cellule in proliferazione, richiedendo 15 ml di terreno basico, e una diluizione 1:6 per iniziare la differenziazione, che richiede 30 mL di terreno basico.
   2. Rimuovere il mezzo dal pallone per coltura cellulare mediante aspirazione e aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,025% preriscaldata. Incubare per 5-10 minuti a RT. Il distacco delle cellule può essere confermato al microscopio ottico standard con un ingrandimento 10x.
   3. Aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina (concentrazione finale 0,5 mg/ml) seguito da 5 ml di terreno basico caldo. Staccare e raccogliere le cellule facendo delicatamente pipettare su e giù. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
   4. Per mantenere le cellule in proliferazione, riplaccare ad una diluizione 1:3 in terreno di base fresco integrato con fattori di proliferazione e ripetere il punto 2.3.4.
5. Differenziazione corticale delle cellule GFP-lt-NES
   1. Il giorno 0, risospendere le cellule (da utilizzare per la differenziazione) in 30 ml di terreno di base integrato con fattori di proliferazione e placcarle in sei palloni T25 rivestiti di differenziazione (divisi 1:6).
   2. Il giorno 1, cambiare metà del terreno in DDM e aggiungere fattori di proliferazione a metà della loro concentrazione.
   3. Il giorno 2, cambiare completamente il terreno in DDM integrato con fattori di differenziazione: BMP4 (10 ng / mL), Wnt3a (10 ng / mL) e ciclopamina (400 ng / mL).
   4. Il giorno 4, aggiungi solo i fattori di differenziazione. Sostituire il mezzo se diventa giallo.
   5. Il giorno 6, cambia il mezzo in DDM integrato con BMP4 e Wnt3a. La ciclopamina viene rimossa in questa fase.
   6. Il giorno 7, staccare le celle come indicato nei punti 2.4.2 e 2.4.3.

Medio di base	Concentrazione delle scorte	Concentrazione finale	Per 100 mL
DMEM/F12 con L-Glutammina	1x		98,7 ml
Supplemento N-2	100x	1:100	1 mL
Glucosio	45%	3,5 ml/L	350 μL

Tabella 4: Composizione del mezzo di proliferazione delle cellule lt-NES (terreno di base).

DDM medio	Concentrazione delle scorte	Concentrazione finale	Per 100 mL
DMEM/F12 con L-Glutammina			96 ml
N2	100 x	1:100	1 mL
NEAA	100 x	1:100	1 mL
Piruvato di sodio	100 mM	1:100	1 mL
Frazione BSA V	7.5%	6,6 ml/L	660 μL
2-mercaptoetanolo	50 nM	7 μL/L	0,7 μL
Glucosio	45%	3,2 ml/L	320 μL

Tabella 5: Composizione del mezzo definito dalla differenziazione (DDM) delle celle lt-NES.

3. Trapianto delle cellule GFP-lt-NES in fette organotipiche di hACtx

NOTA: Il tessuto hACtx deve essere coltivato per 1 settimana prima del trapianto di cellule. Per facilitare la procedura di trapianto, è necessario rimuovere 2 ml del mezzo hACtx dalla parte superiore dell'inserto per evitare che il tessuto fluttui.

1. Risospendere le celle GFP-lt-NES innescate corticamente (dal punto 2.5.6) in una matrice basale pura fredda (vedere la Tabella dei materiali) ad una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/μL e trasferire la soluzione in un tubo sterile più piccolo.
   NOTA: Durante la procedura di trapianto, tutti i materiali (punte di pipette, tubi, capillari, ecc.) devono essere pre-raffreddati per evitare la solidificazione del gel. Scongelare il gel della matrice della membrana basale sul ghiaccio per 30 minuti prima del suo utilizzo.
2. Raccogliere la sospensione cellulare in un capillare di vetro freddo collegato a una tettarella di gomma per l'aspirazione. Iniettare la sospensione cellulare sotto forma di piccole gocce (circa 1 μL ciascuna) pugnalando la fetta di tessuto semisecco in vari siti.
3. Incubare a 37 °C per 30 minuti affinché il gel si solidifichi. Trasferire la piastra dall'incubatore alla cappa e aggiungere con cautela 2 ml di terreno hACtx nella parte superiore dell'inserto per immergere completamente il tessuto.
4. Sostituire il terreno di coltura con terreno hACtx fresco una volta alla settimana.

4. Convalida

1. Colorazione delle fette hACtx
   1. Al momento desiderato, estrarre le fette dal laboratorio di coltura cellulare e rimuoverle dall'inserto immergendolo in una capsula di Petri con PBS. Quindi, trasferire le fette in flaconcini di colorazione utilizzando una pipetta di vetro rovesciata (vedere la NOTA al punto 1.3.5) e fissarle con paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C.
   2. Risciacquare 3 volte con KPBS per 15 minuti ogni volta e incubare per una notte a 4 °C con soluzione di permeabilizzazione (0,02% BSA e 1% Triton X-100 in KPBS).
   3. Il giorno successivo, aggiungere la soluzione bloccante (KPBS con Triton X-100 allo 0,2%, BSA all'1%, azoturo di sodio [1:10.000] e siero d'asino normale al 10%) e incubare per una notte a 4 °C.
   4. Dopo il blocco, aggiungere gli anticorpi primari (vedere Tabella 6 per le diluizioni) diluiti nella soluzione bloccante e incubare per 48 ore a 4 °C.
   5. Lavare 3 volte con soluzione bloccante senza aggiungere siero per 15 minuti ciascuno. Aggiungere gli anticorpi secondari diluiti in soluzione bloccante (vedere tabella 6 per le diluizioni) e incubare per 48 ore a 4 °C.
   6. Lavare 3 volte con soluzione bloccante senza siero e incubare per 2 ore a RT in colorazione Hoechst diluita in soluzione di permeabilizzazione (1:1.000).
   7. Lavare 3 volte con KPBS, montare le fette su vetrini con un pennello e lasciarle asciugare. Infine, sciacquare i vetrini con acqua deionizzata, rimuovere l'acqua in eccesso, aggiungere il mezzo di montaggio e coprire con un vetrino. Conservare i vetrini per almeno 24 ore a RT e conservarli a 4 °C fino all'imaging.
      NOTA: Per la marcatura degli anticorpi che marcano epitopi nucleari, eseguire il prelievo dell'antigene prima della permeabilizzazione (fase 4.1.2) con citrato di sodio (10 mM, pH 6,0) per 2 ore a 65 °C.
2. Patch-clamp a cellule intere
   1. Il giorno della registrazione, preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale umano (haCSF), modificato per adattarsi meglio all'ambiente cerebrale umano (Tabella 7). Analogamente alla soluzione di taglio, preparare circa 900 ml di soluzione con tutti gli ingredienti tranne CaCl 2 sciolto in acqua deionizzata e bollire con carbogen per 15 minuti prima di aggiungere il volume appropriato di soluzione 1 M CaCl₂ . Riempire il pallone volumetrico fino al segno di 1 L e continuare a gorgogliare a RT per altri 15 minuti prima di iniziare la registrazione e durante l'esperimento.
   2. Trasferire le fette di tessuto dalla piastra di coltura alla camera di registrazione sul palco di un microscopio verticale che viene costantemente perfuso con haCSF a bolle ad una velocità di perfusione di 2 ml / min e riscaldato a 34 ° C utilizzando un regolatore di temperatura del bagno.
   3. Tirare i capillari di vetro con un estrattore di pipette ad una resistenza media di 3-5 MΩ e riempire i capillari con una soluzione interna a base di K-gluconato (Tabella 8) con 2-4 mg di biocitina appena aggiunti per l'identificazione post-hoc delle cellule registrate. Il pH e l'osmolarità di questa soluzione interna sono rispettivamente 7,2-7,3 e 285-295 mOsm.
   4. Nel caso della registrazione della cellula ospite, ottieni una panoramica approssimativa della fetta con un obiettivo 4x e trova una cellula dall'aspetto sano da correggere con un obiettivo 40x. Quindi, procedere con il morsetto standard per cerotti a celle intere.
   5. Nel caso della registrazione delle cellule innestate, identificare l'area del tessuto con le cellule innestate utilizzando un obiettivo 4x e un filtro di epifluorescenza nell'intervallo blu (460 nm) mediante l'espressione del reporter GFP nell'innesto. Quindi, ingrandisci l'area localizzata con un obiettivo 40x e trova una cellula innestata che esprime GFP per un morsetto patch a cellule intere standard.
   6. Controllare il potenziale di membrana a riposo (RMP) immediatamente dopo l'irruzione nella cella e assicurarsi che la qualità della registrazione sia buona. Registrare tutti i parametri di interesse (ad esempio, resistenza della membrana [Ri], parametri AP, correnti di sodio e potassio e attività sinaptica) nella configurazione della tensione dell'intera cella o della pinza di corrente.
   7. Dopo aver raccolto tutti i dati necessari, ritrarre con attenzione la pipetta di registrazione senza danneggiare ulteriormente la cellula in modo che possa essere identificata con immunocolorazione post-hoc.
   8. Trasferire la fetta nella soluzione di PFA al 4% per un'ulteriore fissazione e colorazione, come descritto al punto 4.1. La streptavidina viene utilizzata per immunomarcare le cellule piene di biocitina durante le registrazioni.

ANTICORPI	Diluizione	Note
Primario
Pollo anti-GFP	1:1000
Pollo anti-MAP2	1:1000
Capra anti-AiF1	1:100
Mouse anti-MBP	1:1000	Recupero dell'antigene necessario
Mouse anti-SC123	1:2000
Coniglio anti-NeuN	1:1000
Coniglio anti-Olig2	1:500
Coniglio anti-Tmem119	1:200
Secondario
488-coniugato AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	1:500
488-coniugato AffinityPure Donkey anti-coniglio IgG	1:500
488-coniugato AffinityPure Donkey anti-pollo IgG	1:500
Cy3-coniugato AffinityPure Donkey anti-pollo IgG	1:500
Cy3-coniugato AffinityPure Donkey anti-capra IgG	1:500
Cy3-coniugato AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	1:500
Alexa fluor 647-coniugata streptavidina	1:500

Tabella 6: Elenco degli anticorpi primari e secondari per l'immunoistochimica.

haCSF	Concentrazione delle scorte	Concentrazione finale [mM]	Per 1 L
NaCl	Polvere	129	7,54 g
NaHCO3	Polvere	21	1,76 g
Glucosio	Polvere	10	1,80 g
Kcl	Polvere	3	0,22 g
NaH2PO4	Polvere	1.25	0,17 g
MgSO4	1 m	2	2 ml
CaCl2	1 m	1.6	1,6 ml

Tabella 7: Composizione del liquido cerebrospinale artificiale (haCSF).

Soluzione interna di K-gluconato	Concentrazione delle scorte	Concentrazione finale [mM]	Per 100 mL
K-gluconato	Polvere	122.5	2,87 g
Kcl	Polvere	12.5	93,18 mg
NaCl	Polvere	8	46,76 mg
HEPES	Polvere	10	238,32 mg
MgATP	Polvere	2	101,4 mg
Na3GTP	Polvere	0.3	17,0 mg
Nota: Regolare il pH con KOH/HCl

Tabella 8: Composizione della soluzione interna a base di K-gluconato.

Risultati

Seguendo il protocollo descritto, è stato raccolto ed elaborato il tessuto hACtx di un paziente con epilessia del lobo temporale, come spiegato sopra. Alcune fette sono state fissate dopo 24 ore in coltura per studiare il punto di partenza del tessuto ospite. L'analisi di diverse popolazioni di cellule neurali come neuroni (che esprimono NeuN e Map2, Figura 1A), oligodendrociti (Olig2 e MBP, Figura 1B) e astrociti (GFAP umano-specifico, chiamato anche STEM123, Figura 1C) ha

Discussione

Ottenere fette hACtx di qualità sufficientemente elevata è il passaggio più critico in questo protocollo. Il tessuto corticale è ottenuto da pazienti epilettici sottoposti a chirurgia resettiva²⁴. La qualità del tessuto resecato, così come il tempo di esposizione del tessuto tra la resezione e la coltura, è fondamentale; Più velocemente il tessuto viene trasferito dalla sala operatoria al laboratorio e tagliato, più ottimale sarà la coltura organotipica. Idealmente, il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Bath temperature controller	Luigs & Neumann	TC0511354
Calcium Chloride dihydrate	Merck	102382
Carbogen gas	Air Liquide	NA
Cooler	Julaba FL 300	9661012.03
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Double Patch-Clamp amplifier	HEKA electronic	EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt	Millipore	371701
HEPES	AppliChem	A1069
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Patchmaster	HEKA electronic	Patchmaster 2x91
Pipette Puller	Sutter	P-2000
Plastic Petri dish	Any suitable
Potassium chloride	Merck	104936
Potassium D-gluconate	ThermoFisher	B25135
Rubber teat + glass pipette	Any suitable
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue	Loctite	2062278
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Vibratome	Leica	VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)	ThermoFisher Scientific	14175095
HEPES	AppliChem	A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys without Phenol Red	StemCell technologies	#05791	Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forceps	Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Animal Free Recombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glucose solution (45%)	Sigma	G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Supplement (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poly-L-Ornithine	Merk	P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein	R&D Systems	5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterile deionized water	MilliQ		MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL	Eppendorf	Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuge	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Sterile tubes	Sarstedt	Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm	VWR	612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL	Biotix VWR	Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Various
T25 flasks Nunc	ThermoFisher Scientific	156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoReserach	711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin	Jackson ImmunoReserach	016-600-084
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoReserach	001-000-162
Chicken anti-GFP	Merk Millipore	AB16901
Chicken anti-MAP2	Abcam	ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG	Jackson ImmunoReserach	705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)	Sigma Aldrich	D27802	Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)	Biorad	AHP2024
Hoechst 33342	Molecular Probes		Nuclear staining
Mouse anti-MBP	BioLegend	808402
Mouse anti-SC123	Stem Cells Inc	AB-123-U-050
Normal Donkey Serum	Merk Millipore	S30-100
Paint brush	Any suitable
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
Distilled water
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)	Merk Millipore	104873
Potassium phospate dibasic (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S3014
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab104225
Rabbit anti-Olig2	Abcam	ab109186
Rabbit anti-TMEM119	Abcam	ab185333
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-5G
Sodium citrate
Distilled water
Tri-Sodium Citrate	Sigma Aldrich	S1804-500G
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	327371000
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope	Zeiss	LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm	VWR	630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm	Marienfeld	107242
Microscope Software	Zeiss	ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable