JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описываются долгосрочные органотипические культуры коры головного мозга взрослого человека в сочетании с интракортикальной трансплантацией ex vivo индуцированных плюрипотентных предшественников коры, полученных из стволовых клеток, которые представляют собой новую методологию для дальнейшего тестирования терапии нейродегенеративных заболеваний человека на основе стволовых клеток.

Аннотация

Нейродегенеративные расстройства распространены и неоднородны с точки зрения их симптомов и клеточного воздействия, что затрудняет их изучение из-за отсутствия надлежащих моделей животных, которые полностью имитируют заболевания человека, и плохой доступности посмертной ткани мозга человека. Культура нервной ткани взрослого человека дает возможность изучать различные аспекты неврологических расстройств. Молекулярные, клеточные и биохимические механизмы могут быть легко рассмотрены в этой системе, а также тестирование и проверка лекарств или различных методов лечения, таких как клеточная терапия. Этот метод сочетает в себе долгосрочные органотипические культуры коры головного мозга взрослого человека, полученные от пациентов с эпилепсией, перенесших резективную операцию, и интракортикальную трансплантацию ex vivo индуцированных плюрипотентных предшественников коры, полученных из стволовых клеток. Этот метод позволит изучать выживаемость клеток, дифференцировку нейронов, формирование синаптических входов и выходов, а также электрофизиологические свойства клеток человеческого происхождения после трансплантации в интактную корковую ткань взрослого человека. Этот подход является важным шагом перед разработкой 3D-платформы моделирования заболеваний человека, которая приблизит фундаментальные исследования к клиническому переводу терапии на основе стволовых клеток для пациентов с различными неврологическими расстройствами и позволит разработать новые инструменты для реконструкции поврежденных нейронных цепей.

Введение

Нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или ишемический инсульт, представляют собой группу заболеваний, которые имеют общую черту нарушения работы нейронов или смерти. Они неоднородны с точки зрения пораженной области мозга и популяции нейронов. К сожалению, методы лечения этих заболеваний скудны или имеют ограниченную эффективность из-за отсутствия животных моделей, имитирующих то, что происходит в человеческом мозге 1,2. Терапия стволовыми клетками является одной из наиболее перспективных стратегий регенерации мозга3. Генерация нейронных предшественников из стволовых клеток из разных источников получила значительное развитие в последние годы 4,5. Недавние публикации показали, что индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки человека, полученные из долгосрочных самообновляющихся нейроэпителиоподобных стволовых клеток (lt-NES), следуя протоколу корковой дифференцировки и после внутрикортикальной трансплантации в модели крысы с ишемическим инсультом, поражающим соматосенсорную кору, генерируют зрелые корковые нейроны. Кроме того, нейроны, полученные из трансплантата, получили афферентные и эфферентные синаптические связи от нейронов-хозяев, демонстрируя их интеграцию в нейронную сеть крысы 6,7. Аксоны, полученные из трансплантата, были миелинизированы и обнаружены в различных областях мозга крысы, включая периинфарктную область, мозолистое тело и контралатеральную соматосенсорную кору. Самое главное, что трансплантация iPS-клеток обратила вспять двигательный дефицит у животных, перенесших инсульт7.

Даже если животные модели помогают изучать выживаемость трансплантата, интеграцию нейронов и влияние трансплантированных клеток на двигательные и когнитивные функции, информация о взаимодействии между клетками человека (трансплантат-хозяин) в этой системе отсутствует 8,9. По этой причине здесь описан комбинированный метод длительного органотипического культивирования мозга человека с трансплантацией ex vivo нейронных предшественников, полученных из iPS-клеток человека. Органотипические культуры человеческого мозга, полученные в результате нейрохирургических резекций, являются физиологически значимыми 3D-моделями мозга, которые позволяют исследователям улучшить свое понимание схем центральной нервной системы человека и наиболее точного способа тестирования лечения заболеваний головного мозга человека. Однако в этом контексте было проведено недостаточно исследований, и в большинстве случаев использовались органотипические культуры мозга гиппокампа человека10,11. Кора головного мозга поражена несколькими нейродегенеративными расстройствами, такими как ишемический инсульт12 или болезнь Альцгеймера13, поэтому важно иметь 3D-систему коры головного мозга человека, которая позволяет нам расширять наши знания, а также тестировать и проверять различные терапевтические стратегии. В нескольких исследованиях, проведенных за последние несколько лет, использовались культуры из корковой ткани взрослого человека (hACtx) для моделирования заболеваний головного мозга человека 14,15,16,17,18,19; Тем не менее, ограниченная информация доступна в контексте терапии стволовыми клетками. Два исследования уже продемонстрировали осуществимость описанной здесь системы. В 2018 году было показано, что эмбриональные стволовые клетки человека, запрограммированные различными факторами транскрипции и трансплантированные в ткань hACtx, дают начало зрелым корковым нейронам, которые могут интегрироваться в корковые сети взрослого человека20. В 2020 году трансплантация клеток lt-NES в органотипическую систему человека выявила их способность дифференцироваться в зрелые слоеспецифические корковые нейроны с электрофизиологическими свойствами функциональных нейронов. Привитые нейроны установили как афферентные, так и эфферентные синаптические контакты с корковыми нейронами человека в срезах мозга взрослого человека, что подтверждается ретроградным моносинаптическим отслеживанием вируса бешенства, записями заклепов целых клеток и иммуноэлектронной микроскопией21.

протокол

Этот протокол соответствует руководящим принципам, утвержденным Региональным этическим комитетом, Лунд, Швеция (номер этического разрешения 2021-07006-01). Здоровая ткань неокортекса была получена от пациентов, перенесших плановую операцию по поводу височной эпилепсии. Информированное согласие было получено от всех пациентов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все полученные ткани были обработаны независимо от их размера. Тем не менее, ткани размером менее 1-1,5 мм3 будут технически сложными для обработки и разрезания с помощью вибратомы.

1. Сбор, уход, резка и покрытие тканей

  1. Препараты за день до среза тканей
    1. Приготовьте 2 л режущего раствора (табл. 1) в мерной колбе. Растворите все ингредиенты, кроме MgCl 2 и CaCl2, в ~ 1,800 мл деионизированной воды и пузыритесь с газообразным карбогеном в течение 15 минут. Затем добавьте соответствующее количество 1 М растворов MgCl2 иCaCl2 и продолжайте барботировать еще 15 минут. Наконец, наполните колбу до отметки 2 л; проверьте рН и осмолярность и при необходимости отрегулируйте. Заморозьте 2 x 350 мл приготовленного раствора, а остальное храните при температуре 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: pH и осмолярность обычно составляют 7,3-7,4 и 295-300 мОсм соответственно.
    2. Приготовьте 100 мл ополаскивающего раствора (табл. 2). Растворите 476 мг HEPES и 200,6 мг глюкозы в 100 мл HBSS с добавлением 5 мл пенициллина/стрептомицина. Его можно хранить при температуре 4 °C до 10 дней.
    3. Подготовьте питательную среду для взрослого человека (hACtx) (среда hACtx) (таблица 3) и отфильтруйте ее в лаборатории клеточных культур под вентилируемым колпаком. Среда содержит нейронную среду без фенольного красного (см. Таблицу материалов), добавку B27, L-глютамин (см. Таблицу материалов) и гентамицин. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  2. Подготовка в день операции до прибытия образцов тканей
    1. Проверьте наличие необходимого оборудования и лабораторных помещений и тщательно очистите все хирургические инструменты и вибратом (см. Таблицу материалов), а также рабочее пространство дистиллированной водой (без моющего средства), а затем 70% этанолом. Дайте этанолу высохнуть не менее 30 минут перед использованием инструментов и оборудования.
    2. Измельчите замороженный режущий раствор и взбейте «суп» изо льда и жидкости с газообразным карбогеном в течение 30 минут. Затем плотно закройте одну из емкостей с измельченным раствором «супа» и поместите ее в холодильник. Это будет использоваться для сбора ткани из операционной.
    3. Откалибруйте вибратому и установите параметры резки: скорость 0,05 мм/с и вибрацию 1,7 мм. Поместите режущую камеру на вибратомный столик и запустите подключенный к ней охладитель так, чтобы камера находилась при постоянной температуре −3 °C.
    4. Подготовьте камеру для сбора срезов со вставками для размещения срезов ткани и режущим раствором, постоянно пузыря его газообразным карбогеном при комнатной температуре (RT).
    5. В лаборатории клеточных культур и под вентилируемым колпаком поместите вкладыши для культивирования в 6-луночную пластину с помощью щипцов. Добавьте 5 мл среды hACtx в нижнюю часть вкладыша до тех пор, пока он не соприкоснется с мембраной, избегая образования пузырьков, и добавьте 2 мл в верхнюю часть вкладыша. Уравновесить в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2 в течение не менее 2 ч перед переносом срезов ткани во вкладыши.
  3. Процедуры по сбору и нарезке тканей
    1. Сразу после резекции соберите ткань у пациента в операционной, по возможности, непосредственно в емкость с замороженным, пузырящимся и измельченным режущим раствором. Немедленно перенесите закрытый контейнер на льду в зону резки лаборатории.
    2. Осмотрите ткань и найдите наилучшую поверхность для приклеивания (см. шаг 1.3.3) к стадии разрезания вибратомы, учитывая ориентацию кортикальных слоев. При необходимости разрежьте неровную поверхность скальпелем так, чтобы ткань можно было легко разместить на сцене для оптимальной ориентации среза.
    3. Приклейте ткань к сцене тканевым клеем (см. Таблицу материалов), поместите ее в камеру нарезки и сразу же заполните камеру холодным пузырчатым раствором для резки. Продолжайте барботирование в течение всей процедуры резки.
    4. Нарежьте корональные или сагиттальные срезы, в зависимости от ориентации ткани к лезвию, толщиной 300 мкм, чтобы они содержали все корковые слои и, если возможно, белое вещество. Поместите срезы в камеру сбора с барботажным режущим раствором при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте со стороны белого вещества по направлению к поверхности коры. Не удаляйте мозговые оболочки, так как это может повредить ткани. Режущее лезвие обычно легко разрезает их.
    5. После того, как вся ткань будет разрезана, перенесите срезы в стерильную чашку Петри с промывающим раствором при ЛТ и транспортируйте их в лабораторию клеточных культур. Этот шаг необходим для удаления излишков сахарозы со срезов перед переносом их на культуральную тарелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы перенести ломтики (на этом и следующих шагах), используйте перевернутую стеклянную пипетку, отломите более тонкую часть и поместите резиновую соску для всасывания.
  4. Культивирование и уход за срезами тканей hACtx
    1. По отдельности положите кусочки ткани поверх уже влажных и погруженных в воду вставок. Через 24 часа смените среду, чтобы дополнительно удалить оставшуюся сахарозу или другие остаточные вещества из процедур резки.
    2. Заменяйте питательную среду свежей средой каждые 7 дней. Через 2 недели используйте среднюю hACtx без гентамицина. Культуру можно выдерживать до 2 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновесьте среду hACtx в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 в течение не менее2 ч до смены среды. Свежую среду следует готовить каждые 2 недели. Проверяйте ломтики каждые 2-3 дня и, если часть среды испарилась, добавьте еще в верхнюю часть вкладыша.
Режущий растворКонцентрация запасовКонечная концентрация [мМ]На 1 л
СахарозаПорошок20068.46 г
NaHCO3Порошок211.76 г
KClПорошок30,22 г
NaH2PO4Порошок1.250,17 г
ГлюкозаПорошок101.80 г
MgSO41 м22 мл
CaCl21 м1.61,6 мл
MgCl22 М21 мл

Таблица 1: Состав режущего раствора. MgCl 2 и CaCl2 используются в качестве предварительно приготовленных 1 М растворов в деионизированной воде.

Ополаскивающий растворКонцентрация запасовКонечная концентрацияНа 100 мл
ГБСС1x95 мл
ПенСтрептококк10 000 ЕД/мл500 ЕД/мл5 мл
ХЕПЕСПорошок4,76 г/л476 мг
ГлюкозаПорошок2 г/л200,6 мг

Таблица 2: Состав ополаскивающего раствора.

hACtx среднийКонцентрация запасовКонечная концентрацияНа 100 мл
Нейронная среда без фенолового красного97,4 млсм. Таблица материалов
В27В 50 раз1:502 мл
L-глютаминВ 100 раз1:200500 мклсм. Таблица материалов
Гентамицин50 мг/мл1:1000100 мкл

Таблица 3: Состав среды hACtx.

2. Пролиферация и дифференцировка клеток lt-NES

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Lt-NES генерируются, как описаноранее 21,22, и трансдуцируются лентивирусным вектором, несущим зеленый флуоресцентный белок (GFP), под конститутивным промотором (клетки GFP-lt-NES). Флаконы, содержащие 3 x 106 ячеек, хранят при температуре -150 °C до использования.

  1. Подготовка исходных растворов и сред
    1. Разбавьте 100 мкг основного фактора роста фибробластов (bFGF) в 10 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить исходную концентрацию 10 мкг / мл. Приготовьте 100 мкл аликвот.
    2. Разбавьте 100 мкг эпидермального фактора роста (EGF) в 10 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить исходную концентрацию 10 мкг / мл. Приготовьте 100 мкл аликвот.
    3. Добавка Aliquot 50x B27 в объеме 100 мкл на аликвоту.
    4. Разведите 10 мг поли-L-орнитина в 100 мл деионизированной воды, чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг / мл. Сделайте аликвоты по 1 мл.
    5. Приготовьте 30 мкл аликвот 1,20 мг/мл мышиного ламинина.
    6. Разбавьте 10 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в 90 мл PBS до исходной концентрации 0,025%. Приготовьте 1 мл аликвот.
    7. Разбавьте 0,025 г ингибитора трипсина в 50 мл PBS до исходной концентрации 0,5 мг / мл. Приготовьте 1 мл аликвот.
    8. Разбавьте 10 мкг Wnt3a (член семейства сайтов интеграции MMTV бескрылого типа 3A) в 1 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить исходную концентрацию 10 мкг / мл. Таким же образом готовят BMP4 (костный морфогенетический белок 4). Аликвота в объеме 100 мкл.
    9. Разведите 1 мг циклопамина в 2,5 мл ДМСО до конечной концентрации 400 мкг / мл и сделайте 100 мкл аликвот.
    10. Подготовьте основную среду (таблица 4) и среду с дифференциацией (DDM, таблица 5) и храните при температуре 4 °C до 2 недель.
  2. Покрытие культуральной посуды
    1. Чтобы предварительно покрыть посуду для культивирования клеток GFP-It-NES во время пролиферации или дифференцировки, разведите поли-L-орнитин 1:100 в деионизированной воде и добавьте 5 мл раствора в колбу T25. Инкубация в течение ночи при RT.
    2. Вымойте пластины с поли-L-орнитиновым покрытием 1 раз деионизированной водой и 1 раз PBS.
    3. Для клеток GFP-It-NES в пролиферации разведите мышиный ламинин в соотношении 1:500 в PBS и инкубируйте не менее 2 ч при 37 ° C. Для дифференцировочных клеток GFP-It-NES разведите мышиный ламинин в соотношении 1:100 в PBS и инкубируйте не менее 2 ч при 37 ° C.
  3. Пролиферация клеток GFP-lt-NES
    1. Нагрейте 5 мл (для стирки) и 5 мл (для посева) основной среды в двух разных пробирках по 15 мл.
    2. Быстро разморозьте один флакон с ячейками GFP-lt-NES при 37 °C, перенесите их в промывочную трубку и центрифугу при 300 x g в течение 5 мин.
    3. Осторожно аспирируйте среду, не касаясь гранул, и ресуспендируйте клетки в 1 мл предварительно подогретой основной среды. Клеточную суспензию переносят в посевную трубку, содержащую основную среду с добавлением факторов пролиферации: EGF (10 нг/мл), bFGF (10 нг/мл) и B27 (10 нг/мл). Засейте клетки в колбу T25, покрытую поли-L-орнитином/ламинином.
    4. Подпитывайте клетки факторами пролиферации каждый день. Замените носитель, если он пожелтеет. Проходите клетки каждые третьи-четвертые сутки (через 1 день после того, как они достигнут 100% слияния).
  4. Расщепление клеток GFP-lt-NES для пролиферации и дифференцировки
    1. Предварительно разогрейте 5 мл основной среды на колбу (для сбора клеток) плюс общий объем, необходимый для их повторного посева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж осуществляется в разведении 1:3 для поддержания пролиферации клеток, требующем 15 мл основной среды, и разведении 1:6 для начала дифференцировки, требующем 30 мл основной среды.
    2. Удалите среду из колбы для клеточной культуры путем аспирации и добавьте 500 мкл предварительно подогретого 0,025% трипсина. Инкубировать 5-10 мин при РТ. Отрыв клеток может быть подтвержден под стандартным световым микроскопом при 10-кратном увеличении.
    3. Добавьте равный объем ингибитора трипсина (0,5 мг / мл конечной концентрации), а затем 5 мл теплой основной среды. Отделяйте и собирайте клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Переведите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугу в течение 5 мин при дозе 300 г .
    4. Чтобы сохранить пролиферацию клеток, переложите в разведение 1:3 в свежую основную среду, дополненную факторами пролиферации, и повторите шаг 2.3.4.
  5. Корковая дифференцировка клеток GFP-lt-NES
    1. На 0-й день ресуспендируют клетки (для дифференцировки) в 30 мл основной среды, дополненной факторами пролиферации, и помещают их в шесть колб T25 с дифференцировочным покрытием (разделенные 1:6).
    2. На 1-й день замените половину среды на DDM и добавьте факторы пролиферации в половине их концентрации.
    3. На 2-й день полностью смените среду на DDM с добавлением факторов дифференцировки: BMP4 (10 нг/мл), Wnt3a (10 нг/мл) и циклопамина (400 нг/мл).
    4. На 4-й день добавьте только факторы дифференциации. Замените носитель, если он пожелтеет.
    5. На 6-й день смените среду на DDM с добавлением BMP4 и Wnt3a. Циклопамин удаляется на этом этапе.
    6. На 7-й день отсоедините клетки, как указано в шагах 2.4.2 и 2.4.3.
Базовый среднийКонцентрация запасовКонечная концентрацияНа 100 мл
DMEM/F12 с L-глютамином1x98,7 мл
Доплата N-2В 100 раз1:1001 мл
Глюкоза45%3,5 мл/л350 мкл

Таблица 4: Состав пролиферативной среды клеток lt-NES (базовая среда).

Среда DDMКонцентрация запасовКонечная концентрацияНа 100 мл
DMEM/F12 с L-глютамином96 мл
Н2100 х1:1001 мл
NEAA100 х1:1001 мл
Пируват натрия100 мМ1:1001 мл
Фракция BSA V7.5%6,6 мл/л660 мкл
2-меркаптоэтанол50 нМ7 мкл/л0,7 мкл
Глюкоза45%3,2 мл/л320 мкл

Таблица 5: Состав дифференцировочной среды (DDM) клеток lt-NES.

3. Трансплантация клеток GFP-lt-NES в органотипические срезы hACtx

ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань hACtx следует культивировать в течение 1 недели до трансплантации клеток. Чтобы облегчить процедуру трансплантации, необходимо удалить 2 мл среды hACtx из верхней части вкладыша, чтобы предотвратить всплытие ткани.

  1. Ресуспендируют кортикально праймированные клетки GFP-lt-NES (с этапа 2.5.6) в матрице холодной чистой базальной мембраны (см. Таблицу материалов) в концентрации 1 x 10,5 клеток/мкл и переносят раствор в меньшую стерильную пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры трансплантации все материалы (наконечники пипеток, трубки, капилляры и т. д.) должны быть предварительно охлаждены, чтобы избежать затвердевания геля. Перед использованием разморозьте матричный гель базальной мембраны на льду в течение 30 минут.
  2. Соберите клеточную суспензию в холодный стеклянный капилляр, соединенный с резиновой соской для всасывания. Вводите клеточную суспензию в виде небольших капель (около 1 мкл каждая), втыкая полусухой срез ткани в различные места.
  3. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин, чтобы гель затвердел. Перенесите пластину из инкубатора обратно в капюшон и осторожно добавьте 2 мл среды hACtx в верхнюю часть вкладыша, чтобы полностью погрузить ткань.
  4. Заменяйте питательную среду свежей средой hACtx один раз в неделю.

4. Валидация

  1. Окрашивание срезов hACtx
    1. В нужный момент времени выньте срезы из лаборатории клеточных культур и извлеките их из вкладыша, погрузив его в чашку Петри с PBS. Затем переложите ломтики во флаконы для окрашивания с помощью пипетки из перевернутого стекла (см. ПРИМЕЧАНИЕ на шаге 1.3.5) и зафиксируйте их 4% параформальдегидом (PFA) на ночь при 4 ° C.
    2. Промыть 3 раза KPBS в течение 15 минут каждый раз и инкубировать в течение ночи при 4 ° C с пермеабилизирующим раствором (0,02% BSA и 1% Triton X-100 в KPBS).
    3. На следующий день добавьте блокирующий раствор (KPBS с 0,2% Triton X-100, 1% BSA, азидом натрия [1:10 000] и 10% нормальной ослиной сывороткой) и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
    4. После блокировки добавляют первичные антитела (см. Таблицу 6 для разведений), разведенные в блокирующем растворе, и инкубируют в течение 48 ч при 4 ° C.
    5. Промыть 3 раза блокирующим раствором без добавления сыворотки в течение 15 минут каждый. Добавляют вторичные антитела, разведенные в блокирующем растворе (см. Таблицу 6 для разведений), и инкубируют в течение 48 ч при 4 ° C.
    6. Промыть 3 раза блокирующим раствором без сыворотки и инкубировать в течение 2 ч при РТ в пятине Хёхста, разбавленном раствором для пермеабилизации (1:1 000).
    7. Вымойте 3x с помощью KPBS, закрепите ломтики на предметных стеклах с помощью кисти и дайте им высохнуть. Наконец, промойте предметные стекла деионизированной водой, удалите излишки воды, добавьте монтажную среду и накройте стеклянным покровным стеклом. Храните предметные стекла не менее 24 ч при RT и храните их при температуре 4 °C до получения изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для антител, мечущих ядерные эпитопы, проводят извлечение антигена перед пермеабилизацией (этап 4.1.2) цитратом натрия (10 мМ, рН 6,0) в течение 2 ч при 65 ° C.
  2. Цельноклеточный пластырь-зажим
    1. В день регистрации приготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости человека (haCSF), модифицированной для лучшего соответствия среде мозга человека (таблица 7). Подобно режущему раствору, сделайте приблизительно 900 мл раствора со всеми ингредиентами, кроме CaCl2, растворенного в деионизированной воде, и пузырите его карбогеном в течение 15 мин, прежде чем добавлять соответствующий объем 1М раствора CaCl2. Наполните мерную колбу до отметки 1 л и продолжайте барботировать при RT еще 15 минут перед началом записи и на протяжении всего эксперимента.
    2. Перенесите срезы ткани из культуральной пластины в регистрирующую камеру на столике вертикального микроскопа, который постоянно перфузируется пузырьковым галиквором со скоростью перфузии 2 мл / мин и нагревается до 34 ° C с помощью регулятора температуры в ванне.
    3. Вытяните стеклянные капилляры с помощью пипетки-съемника до среднего сопротивления 3-5 МОм и заполните капилляры внутренним раствором на основе K-глюконата (таблица 8) свежедобавленным 2-4 мг биоцитина для последующей идентификации зарегистрированных клеток. рН и осмолярность этого внутреннего раствора составляют 7,2-7,3 и 285-295 мОсм соответственно.
    4. В случае записи клетки-хозяина получите приблизительный обзор среза с 4-кратным объективом и найдите здоровую клетку для исправления с 40-кратным объективом. Затем приступайте к стандартному цельноклеточному пластырному зажиму.
    5. В случае записи трансплантированных клеток идентифицируйте область ткани с привитыми клетками, используя 4-кратный объектив и эпифлуоресцентный фильтр в синем диапазоне (460 нм) по экспрессии репортера GFP в трансплантате. Затем увеличьте масштаб до расположенной области с 40-кратным объективом и найдите привитую клетку, экспрессирующую GFP, для стандартного цельноклеточного пластыря.
    6. Проверьте мембранный потенциал покоя (RMP) сразу после взлома ячейки и убедитесь, что качество записи хорошее. Запишите все интересующие параметры (например, сопротивление мембраны [Ri], параметры AP, токи натрия и калия и синаптическую активность) в конфигурации напряжения целой ячейки или ток-зажима.
    7. После сбора всех необходимых данных осторожно втяните записывающую пипетку, не повреждая в дальнейшем клетку, чтобы ее можно было идентифицировать с помощью последующего иммуноокрашивания.
    8. Перенесите срез в 4% раствор PFA для дальнейшей фиксации и окрашивания, как описано на шаге 4.1. Стрептавидин используется для иммуномаркировки клеток, заполненных биоцитином во время записи.
АНТИТЕЛАРазбавлениеПримечания 
Первичный
Курица анти-GFP1:1000
Курица анти-MAP21:1000
Козел анти-АиФ11:100
Мышь с защитой от MBP1:1000Необходим поиск антигена
Мышь анти-SC1231:2000
Кролик анти-NeuN1:1000
Кролик анти-Olig21:500
Кролик анти-Tmem1191:200
Вторичный
488-конъюгированный антимышиный IgG AffinityPure Donkey1:500
488-конъюгированный AffinityPure Donkey против кроликов IgG1:500
488-конъюгированный AffinityPure Donkey против куриного IgG1:500
Cy3-конъюгированный AffinityPure Donkey против куриного IgG1:500
Cy3-конъюгированный AffinityPure Donkey против козьего IgG1:500
Cy3-конъюгированный антимышиный IgG AffinityPure Donkey1:500
Alexa флуор 647-конъюгированный стрептавидин1:500

Таблица 6: Список первичных и вторичных антител для иммуногистохимии.

haCSFКонцентрация запасовКонечная концентрация [мМ]На 1 л
NaClПорошок1297.54 г
NaHCO3Порошок211.76 г
ГлюкозаПорошок101.80 г
KClПорошок30,22 г
NaH2PO4Порошок1.250,17 г
MgSO41 м22 мл
CaCl21 м1.61,6 мл

Таблица 7: Состав искусственной спинномозговой жидкости (haCSF).

Внутренний раствор K-глюконатаКонцентрация запасовКонечная концентрация [мМ]На 100 мл
К-глюконатПорошок122.52.87 г
KClПорошок12.593.18 мг
NaClПорошок846,76 мг
ХЕПЕСПорошок10238,32 мг
МгАТФПорошок2101,4 мг
Na3GTPПорошок0.317,0 мг
Заметка: Отрегулируйте pH с помощью KOH/HCl

Таблица 8: Состав внутреннего раствора на основе К-глюконата.

Результаты

В соответствии с описанным протоколом ткань hACtx у пациента с височной эпилепсией была собрана и обработана, как описано выше. Несколько срезов фиксировали через 24 ч в культуре для изучения начальной точки ткани хозяина. Анализ различных популяций нервных клеток, таких как нейроны (эксп?...

Обсуждение

Получение срезов hACtx достаточно высокого качества является наиболее важным шагом в этом протоколе. Кортикальная ткань получают у пациентов с эпилепсией, перенесших резекционную операцию24. Качество резецированной ткани, а также время экспозиции ткани между резе?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантами Шведского исследовательского совета, Шведского фонда мозга, Шведского фонда борьбы с инсультом, Региона Сконе, Фонда Торстена и Эльзы Сегерфальк и Инициативы правительства Швеции по стратегическим исследованиям (StemTherapy).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Bath temperature controller Luigs & NeumannTC0511354
Calcium Chloride dihydrateMerck102382
Carbogen gasAir LiquideNA
CoolerJulaba FL 3009661012.03
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Double Patch-Clamp amplifierHEKA electronicEPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium saltMillipore371701
HEPESAppliChemA1069
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670
Magnesium Sulfate heptahydrateSigma-Aldrich230391
PatchmasterHEKA electronicPatchmaster 2x91
Pipette PullerSutterP-2000
Plastic Petri dishAny suitable
Potassium chlorideMerck104936
Potassium D-gluconateThermoFisherB25135
Rubber teat + glass pipetteAny suitable
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateMerck106346
SucroseSigma-AldrichS7903
Tissue adhesive: Acryl super glueLoctite2062278
Upright microscopeOlympusBX51WI 
Vibratome LeicaVT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)ThermoFisher Scientific14175095
HEPESAppliChemA1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plateThermoFisher Scientific140675
Alvetex scaffold 6 well insertReinnervate LtdAVP004-96
B27 Supplement (50x)ThermoFisher Scientific17504001
BrainPhys without Phenol RedStemCell technologies#05791Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mLCorning SigmaCLS431096/97
ForcepsAny suitable
Gentamicin (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific15750037
Glutamax Supplement (100x)ThermoFisher Scientific35050061Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipetteAny suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Animal Free Recombinant EGFPeprotechAF-100-15
B27 Suplemment (50x)Thermo Fisher Scientific17504001
bFGFPeprotechAF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)ThermoFisher Scientific15260037
Cyclopamine, V. calcifornicumCalbiochem# 239803
D (+) Glucose solution (45%)SigmaG8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2438-10mL
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-144Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, NaturalThermo Fisher Scientific23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)ThermoFisher Scientific11140050
N-2 Supplement (100 x)ThermoFisher Scientific17502001
Poly-L-OrnithineMerkP3655
Recombinant Human BMP-4 ProteinR&D Systems314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a ProteinR&D Systems5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powderThermo Fisher Scientific17075029
Sterile deionized waterMilliQMilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)SigmaT4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µLEppendorfVarious
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)CorningCLS354277-1EA
CentrifugeHettich CentrifugenRotina 420R5% CO2, 37 °C
IncubatorThermoForma Steri-Cult CO2HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mmVitrolife14601
Sterile tubesSarstedtVarious
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mmVWR612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µLBiotix VWRVarious
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mLCostarVarious
T25 flasks NuncThermoFisher Scientific156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoReserach715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoReserach711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgGJackson ImmunoReserach703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated StreptavidinJackson ImmunoReserach016-600-084
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoReserach001-000-162
Chicken anti-GFPMerk MilliporeAB16901
Chicken anti-MAP2 Abcamab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgGJackson ImmunoReserach703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgGJackson ImmunoReserach705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoReserach715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)Sigma AldrichD27802Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal) BioradAHP2024
Hoechst 33342Molecular ProbesNuclear staining
Mouse anti-MBP BioLegend808402
Mouse anti-SC123 Stem Cells IncAB-123-U-050
Normal Donkey SerumMerk MilliporeS30-100
Paint brushAny suitable
Paraformaldehyde (PFA)Sigma Aldrich150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
     Distilled water
     Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)Merk Millipore104873
     Potassium phospate dibasic (K2HPO4)Sigma AldrichP3786
     Sodium chloride (NaCl)Sigma AldrichS3014
Rabbit anti-NeuN Abcamab104225
Rabbit anti-Olig2 Abcamab109186
Rabbit anti-TMEM119 Abcamab185333
Sodium azideSigma AldrichS2002-5G
Sodium citrate
       Distilled water
       Tri-Sodium CitrateSigma AldrichS1804-500G
       Tween-20Sigma AldrichP1379
Triton X-100ThermoFisher Scientific327371000 
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscopeZeissLSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mmVWR630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mmMarienfeld107242
Microscope SoftwareZeissZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipetteAny suitable

Ссылки

  1. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
  2. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
  4. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
  5. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
  6. Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
  7. Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
  8. Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
  9. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  10. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
  11. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  12. Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
  13. Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
  14. Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  15. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  16. Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
  17. Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
  18. Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
  19. Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
  20. Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
  21. Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
  22. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
  23. Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
  24. Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
  25. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
  26. Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
  27. Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
  28. Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
  29. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  30. Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
  31. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  32. Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
  33. Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
  34. Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены