Cultures organotypiques du cortex humain adulte comme modèle ex vivo pour la transplantation et la validation de cellules souches humaines

Résumé

Ce protocole décrit des cultures organotypiques à long terme du cortex humain adulte combinées à la transplantation intracorticale ex vivo de progéniteurs corticaux induits dérivés de cellules souches pluripotentes, qui présentent une nouvelle méthodologie pour tester davantage les thérapies à base de cellules souches pour les troubles neurodégénératifs humains.

Résumé

Les troubles neurodégénératifs sont courants et hétérogènes en termes de symptômes et d’affectation cellulaire, ce qui rend leur étude compliquée en raison du manque de modèles animaux appropriés qui imitent pleinement les maladies humaines et de la faible disponibilité du tissu cérébral humain post-mortem. La culture de tissus nerveux humains adultes offre la possibilité d’étudier différents aspects des troubles neurologiques. Les mécanismes moléculaires, cellulaires et biochimiques pourraient être facilement abordés dans ce système, ainsi que tester et valider des médicaments ou différents traitements, tels que les thérapies cellulaires. Cette méthode combine des cultures organotypiques à long terme du cortex humain adulte, obtenues à partir de patients épileptiques subissant une chirurgie résécante, et la transplantation intracorticale ex vivo de progéniteurs corticaux induits dérivés de cellules souches pluripotentes. Cette méthode permettra d’étudier la survie cellulaire, la différenciation neuronale, la formation d’entrées et de sorties synaptiques et les propriétés électrophysiologiques de cellules d’origine humaine après transplantation dans un tissu cortical humain adulte intact. Cette approche est une étape importante avant le développement d’une plateforme 3D de modélisation des maladies humaines qui rapprochera la recherche fondamentale de la traduction clinique des thérapies à base de cellules souches pour les patients atteints de différents troubles neurologiques et permettra le développement de nouveaux outils pour reconstruire les circuits neuronaux endommagés.

Introduction

Les troubles neurodégénératifs, tels que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou l’accident vasculaire cérébral ischémique, sont un groupe de maladies qui partagent la caractéristique commune d’un dysfonctionnement neuronal ou de la mort. Ils sont hétérogènes en termes de zone cérébrale et de population neuronale affectée. Malheureusement, les traitements pour ces maladies sont rares ou d’une efficacité limitée en raison du manque de modèles animaux qui imitent ce qui se passe dans le cerveau humain ^1,2. La thérapie par cellules souches est l’une des stratégies les plus prometteuses pour la régénération du cerveau³. La génération de progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches provenant de différentes sources a été grandement développée ces dernières années ^4,5. Des publications récentes ont montré que les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPS) à long terme auto-renouvelées neuroépithéliales (lt-NES), suivant un protocole de différenciation corticale et après transplantation intracorticale dans un modèle de rat avec accident vasculaire cérébral ischémique affectant le cortex somatosensoriel, génèrent des neurones corticaux matures. De plus, les neurones issus de greffes ont reçu des connexions synaptiques afférentes et efférentes des neurones hôtes, montrant leur intégration dans le réseau neuronal du rat ^6,7. Les axones dérivés de la greffe ont été myélinisés et trouvés dans différentes zones du cerveau du rat, y compris la zone péri-infarctus, le corps calleux et le cortex somatosensoriel controlatéral. Plus important encore, la transplantation dérivée de cellules iPS a inversé les déficits moteurs chez les animaux victimes d’un AVC⁷.

Même si les modèles animaux permettent d’étudier la survie à la transplantation, l’intégration neuronale et l’effet des cellules greffées sur les fonctions motrices et cognitives, les informations sur l’interaction entre cellules humaines (greffon-hôte) font défaut dans^{ce système8,9}. Pour cette raison, une méthode combinée de culture organotypique du cerveau humain à long terme avec la transplantation ex vivo de progéniteurs neuronaux humains dérivés de cellules iPS est décrite ici. Les cultures organotypiques du cerveau humain obtenues à partir de résections neurochirurgicales sont des modèles 3D physiologiquement pertinents du cerveau qui permettent aux chercheurs d’améliorer leur compréhension des circuits du système nerveux central humain et de la façon la plus précise de tester les traitements pour les troubles cérébraux humains. Cependant, pas assez de recherches ont été faites dans ce contexte, et dans la plupart des cas, les cultures organotypiques du cerveau de l’hippocampe humain ont été utilisées^10,11. Le cortex cérébral est affecté par plusieurs troubles neurodégénératifs, tels que l’AVC ischémique¹² ou la maladie d’Alzheimer¹³, il est donc important d’avoir un système 3D cortical humain qui nous permet d’élargir nos connaissances et de tester et valider différentes stratégies thérapeutiques. Au cours des dernières années, plusieurs études ont utilisé des cultures de tissus corticaux humains adultes (hACtx) pour modéliser les maladies du cerveau humain 14,15,16,17,18,19; Cependant, les informations disponibles dans le contexte de la thérapie par cellules souches sont limitées. Deux études ont déjà démontré la faisabilité du système décrit ici. En 2018, il a été démontré que des cellules souches embryonnaires humaines programmées avec différents facteurs de transcription et transplantées dans du tissu hACtx donnaient naissance à des neurones corticaux matures capables de s’intégrer dans les réseaux corticaux humains adultes²⁰. En 2020, la transplantation de cellules lt-NES dans le système organotypique humain a révélé leur capacité à se différencier en neurones corticaux matures et spécifiques à une couche présentant les propriétés électrophysiologiques des neurones fonctionnels. Les neurones greffés ont établi des contacts synaptiques afférents et efférents avec les neurones corticaux humains dans les tranches de cerveau adultes, comme corroboré par le traçage monosynaptique rétrograde du virus de la rage, les enregistrements de patch-clamp à cellules entières et la microscopie immunoélectronique²¹.

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices approuvées par le Comité régional d’éthique de Lund, Suède (numéro de permis éthique 2021-07006-01). Le tissu néocortical sain a été obtenu chez des patients subissant une chirurgie élective pour l’épilepsie du lobe temporal. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.

NOTE: Tous les tissus obtenus ont été traités quelle que soit leur taille. Cependant, les tissus d’une taille inférieure à 1-1,5 mm³ seront techniquement difficiles à manipuler et à sectionner avec un vibratome.

1. Collecte, entretien, coupe et placage de tissus

1. Préparations la veille du tranchage des tissus
   1. Préparer 2 L de solution de coupe (tableau 1) dans une fiole jaugée. Dissoudre tous les ingrédients sauf MgCl 2 et CaCl₂ dans ~1 800 mL d’eau désionisée et faire des bulles avec du gaz carbogen pendant 15 min. Ajouter ensuite les quantités appropriées de solutions de 1 M MgCl 2 et CaCl₂ et continuer à bouillonner pendant encore 15 minutes. Enfin, remplir la fiole jusqu’au repère de 2 L; vérifier le pH et l’osmolarité et ajuster si nécessaire. Congeler 2 x 350 mL de la solution préparée et conserver le reste à 4 °C.
      REMARQUE: Le pH et l’osmolarité sont généralement de 7,3-7,4 et 295-300 mOsm, respectivement.
   2. Préparer 100 mL de solution de rinçage (tableau 2). Dissoudre 476 mg de HEPES et 200,6 mg de glucose dans 100 mL de HBSS complété par 5 mL de pénicilline / streptomycine. Celui-ci peut être conservé à 4 °C jusqu’à 10 jours.
   3. Préparer le milieu de culture corticale chez l’adulte humain (hACtx) (milieu hACtx) (tableau 3) et le filtrer dans le laboratoire de culture cellulaire sous une hotte ventilée. Le milieu comprend un milieu neuronal sans rouge de phénol (voir le tableau des matériaux), un supplément de vitamine B27, de la L-glutamine (voir le tableau des matériaux) et de la gentamicine. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
2. Préparations le jour de l’opération avant l’arrivée des échantillons de tissus
   1. Vérifiez la disponibilité de l’équipement et de l’espace de laboratoire nécessaires, et nettoyez soigneusement tous les outils chirurgicaux et le vibratome (voir le tableau des matériaux), ainsi que l’espace de paillasse, avec de l’eau distillée (sans détergent), suivie d’éthanol à 70%. Laissez sécher l’éthanol pendant au moins 30 minutes avant d’utiliser les outils et l’équipement.
   2. Écraser la solution de coupe congelée et faire bouillonner la « soupe » de glace et de liquide avec du gaz carbogen pendant 30 min. Ensuite, fermez hermétiquement l’un des contenants avec la solution broyée ''soupe'' et placez-le dans la glacière. Cela sera utilisé pour prélever les tissus de la salle d’opération.
   3. Calibrez le vibratome et réglez les paramètres de coupe : vitesse de 0,05 mm/s et vibration de 1,7 mm. Placez la chambre de coupe sur un étage de vibratome et démarrez le refroidisseur qui y est connecté de manière à ce que la chambre soit à une température constante de −3 °C.
   4. Préparez la chambre de collecte des tranches avec des inserts pour placer les tranches de tissu et la solution de coupe, en la faisant bouillonner constamment avec du gaz carbogen à température ambiante (RT).
   5. Dans le laboratoire de culture cellulaire et sous une hotte ventilée, placez les inserts de culture dans une plaque à 6 puits à l’aide d’une pince. Ajouter 5 mL de milieu hACtx au bas de l’insert jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la membrane, en évitant la formation de bulles, et ajouter 2 mL sur le dessus de l’insert. Équilibrer dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO 2 pendant au moins₂ h avant de transférer les tranches de tissu dans les inserts.
3. Procédures de collecte et de tranchage des tissus
   1. Immédiatement après la résection, prélever le tissu du patient dans la salle d’opération, si possible, directement dans un récipient avec une solution de coupe congelée, bouillonnée et écrasée. Transférez immédiatement le contenant fermé sur de la glace dans la zone de coupe du laboratoire.
   2. Inspectez le tissu et localisez la meilleure surface pour le coller (voir étape 1.3.3) jusqu’au stade de coupe du vibratome, en tenant compte de l’orientation des couches corticales. Si nécessaire, coupez la surface inégale avec un scalpel afin qu’il soit facile de placer le tissu sur la scène pour une orientation optimale de la tranche.
   3. Collez le tissu à la scène avec de l’adhésif pour tissu (voir le tableau des matériaux), placez-le dans la chambre de tranchage et remplissez immédiatement la chambre avec une solution de coupe à bulles. Continuez le barbotage pendant toute la procédure de coupe.
   4. Couper les tranches coronales ou sagittales, selon l’orientation tissu-lame, à une épaisseur de 300 μm pour contenir toutes les couches corticales et, si possible, la substance blanche. Placez les tranches dans la chambre de collecte avec une solution de coupe bouillonnante à TA.
      REMARQUE: Couper du côté de la substance blanche vers la surface du cortex. Ne retirez pas les méninges, car cela pourrait endommager les tissus. La lame de coupe les tranche généralement facilement.
   5. Une fois que tout le tissu a été coupé, transférer les tranches dans une boîte de Petri stérile avec une solution de rinçage à TA et les transporter au laboratoire de culture cellulaire. Cette étape est nécessaire pour éliminer l’excès de saccharose des tranches avant de les transférer sur la plaque de culture.
      REMARQUE: Pour transférer les tranches (dans cette étape et les suivantes), utilisez une pipette en verre inversé, cassez la partie la plus mince et placez une tétine en caoutchouc pour l’aspiration.
4. Culture et entretien de tranches de tissu hACtx
   1. Placez individuellement les tranches de tissu sur les inserts déjà humides et immergés. Après 24 heures, changer le milieu pour éliminer davantage le saccharose ou d’autres substances résiduelles des procédures de coupe.
   2. Remplacer le milieu de culture par un milieu frais tous les 7 jours. Après 2 semaines, utilisez le milieu hACtx sans gentamicine. La culture peut être maintenue jusqu’à 2 mois.
      NOTE: Équilibrer le milieu hACtx dans l’incubateur à 37 °C et 5% CO 2 pendant au moins₂ h avant le changement de milieu. Le milieu frais doit être préparé toutes les 2 semaines. Vérifiez les tranches tous les 2-3 jours et, si une partie du milieu s’est évaporée, ajoutez-en plus dans le haut de l’insert.

Solution de coupe	Concentration des stocks	Concentration finale [mM]	Pour 1 L
Saccharose	Poudre	200	68,46 g
NaHCO3	Poudre	21	1,76 g
Kcl	Poudre	3	0,22 g
NaH2PO4	Poudre	1.25	0,17 g
Glucose	Poudre	10	1,80 g
MgSO4	1 M	2	2 mL
CaCl2	1 M	1.6	1,6 mL
MgCl2	2 M	2	1 mL

Tableau 1 : Composition de la solution de coupe. MgCl 2 et CaCl₂ sont utilisés comme solutions 1 M prépréparées dans l’eau désionisée.

Solution de rinçage	Concentration des stocks	Concentration finale	Par 100 mL
HBSS	1x		95 mL
PenStrep	10 000 U/ml	500 U/ml	5 mL
HEPES	Poudre	4,76 g/L	476 mg
Glucose	Poudre	2 g/L	200,6 mg

Tableau 2: Composition de la solution de rinçage.

hACtx moyen	Concentration des stocks	Concentration finale	Par 100 mL
Milieu neuronal sans rouge de phénol			97,4 mL	voir le tableau des matières
B27	50x	1:50	2 mL
L-Glutamine	100x	1:200	500 μL	voir le tableau des matières
Gentamicine	50 mg/mL	1:1000	100 μL

Tableau 3 : Composition du milieu hACtx.

2. Prolifération et différenciation des cellules lt-NES

NOTE: Les cellules Lt-NES sont générées comme décrit précédemment^21,22 et transduites avec un vecteur lentiviral portant la protéine fluorescente verte (GFP) sous un promoteur constitutif (cellules GFP-lt-NES). Les flacons contenant 3 x 10⁶ cellules sont conservés à −150 °C jusqu’à utilisation.

1. Préparation des solutions de stock et des supports
   1. Diluer 100 μg de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb) dans 10 mL de PBS-0,1% BSA pour obtenir une concentration mère de 10 μg/mL. Préparer des aliquotes de 100 μL.
   2. Diluer 100 μg de facteur de croissance épidermique (EGF) dans 10 mL de PBS-0,1% BSA pour obtenir une concentration mère de 10 μg/mL. Préparer des aliquotes de 100 μL.
   3. Aliquote 50x B27 supplément dans un volume de 100 μL par aliquote.
   4. Diluer 10 mg de poly-L-ornithine dans 100 mL d’eau désionisée pour obtenir une concentration stock-mère de 100 μg/mL. Faire 1 mL d’aliquotes.
   5. Préparer 30 μL d’aliquotes de 1,20 mg/mL de laminine de souris.
   6. Diluer 10 mL de trypsine-EDTA (0,25 %) dans 90 mL de PBS jusqu’à une concentration mère de 0,025 %. Préparer 1 mL d’aliquotes.
   7. Diluer 0,025 g d’inhibiteur de la trypsine dans 50 mL de PBS à une concentration mère de 0,5 mg/mL. Préparer 1 mL d’aliquotes.
   8. Diluer 10 μg de Wnt3a (membre 3A du site d’intégration MMTV de type sans ailes) dans 1 mL de PBS-0,1 % de BSA pour obtenir une concentration stock-mère de 10 μg/mL. Préparer BMP4 (bone morphogenetic protein 4) de la même manière. Aliquote dans un volume de 100 μL.
   9. Diluer 1 mg de cyclopamine dans 2,5 mL de DMSO jusqu’à une concentration finale de 400 μg/mL et obtenir 100 μL d’aliquotes.
   10. Préparer le milieu basique (tableau 4) et le milieu défini par la différenciation (DDM, tableau 5) et conserver à 4 °C pendant 2 semaines au maximum.
2. Enrobage de plats de culture
   1. Pour pré-enduire les plats de culture des cellules GFP-It-NES pendant la prolifération ou la différenciation, diluer la poly-L-ornithine 1:100 dans de l’eau désionisée et ajouter 5 mL de la solution dans une fiole T25. Incuber pendant la nuit chez RT.
   2. Laver les plaques revêtues de poly-L-ornithine 1x avec de l’eau désionisée et 1x avec du PBS.
   3. Pour les cellules GFP-It-NES en prolifération, diluer la laminine de souris à 1:500 dans du PBS et incuber pendant au moins 2 h à 37 °C. Pour les cellules GFP-It-NES en différenciation, diluer la laminine de souris à 1:100 dans du PBS et incuber pendant au moins 2 h à 37 °C.
3. Prolifération des cellules GFP-lt-NES
   1. Réchauffer 5 mL (pour le lavage) et 5 mL (pour l’ensemencement) de milieu basique dans deux tubes différents de 15 mL.
   2. Décongeler rapidement un flacon de cellules GFP-lt-NES à 37 °C, les transférer dans le tube de lavage et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
   3. Aspirer le milieu avec précaution sans toucher la pastille et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu basique préchauffé. Transférer la suspension cellulaire dans le tube d’ensemencement contenant le milieu basique complété par des facteurs de prolifération : EGF (10 ng/mL), FGFb (10 ng/mL) et B27 (10 ng/mL). Ensemencer les cellules dans une fiole T25 enrobée de poly-L-ornithine/laminine.
   4. Nourrissez les cellules avec des facteurs de prolifération tous les jours. Remplacez le milieu s’il devient jaune. Passez les cellules tous les trois ou quatre jours (1 jour après qu’elles atteignent 100% de confluence).
4. Fractionnement des cellules GFP-lt-NES pour la prolifération et la différenciation
   1. Préchauffer 5 mL de milieu basique par fiole (pour recueillir les cellules), plus le volume total nécessaire pour les réensemencer.
      NOTE: Le passage est effectué à une dilution de 1:3 pour maintenir les cellules en prolifération, nécessitant 15 mL de milieu basique, et une dilution de 1:6 pour commencer la différenciation, nécessitant 30 mL de milieu basique.
   2. Retirer le milieu du ballon de culture cellulaire par aspiration et ajouter 500 μL de trypsine préchauffée à 0,025 %. Incuber pendant 5-10 min à TA. Le détachement des cellules peut être confirmé au microscope optique standard à un grossissement de 10x.
   3. Ajouter un volume égal d’inhibiteur de la trypsine (concentration finale de 0,5 mg/mL) suivi de 5 mL de milieu basique chaud. Détachez et recueillez les cellules en les pipetant doucement de haut en bas. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
   4. Pour maintenir les cellules en prolifération, replaquer à une dilution de 1:3 dans un milieu basique frais complété par des facteurs de prolifération, et répéter l’étape 2.3.4.
5. Différenciation corticale des cellules GFP-lt-NES
   1. Au jour 0, remettre les cellules en suspension (à utiliser pour la différenciation) dans 30 mL de milieu basique additionné de facteurs de prolifération, et les plaquer dans six flacons T25 enrobés de différenciation (fractionnés 1:6).
   2. Le jour 1, changer la moitié du milieu en DDM et ajouter des facteurs de prolifération à la moitié de leur concentration.
   3. Le jour 2, changer complètement le milieu en DDM complété par des facteurs de différenciation: BMP4 (10 ng / mL), Wnt3a (10 ng / mL) et cyclopamine (400 ng / mL).
   4. Le jour 4, ajoutez uniquement les facteurs de différenciation. Remplacez le milieu s’il devient jaune.
   5. Le jour 6, changez le milieu en DDM complété par BMP4 et Wnt3a. La cyclopamine est retirée à cette étape.
   6. Le jour 7, détachez les cellules comme indiqué aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.

Support de base	Concentration des stocks	Concentration finale	Par 100 mL
DMEM/F12 avec L-glutamine	1x		98,7 mL
Supplément N-2	100x	1:100	1 mL
Glucose	45%	3,5 mL/L	350 μL

Tableau 4 : Composition du milieu de prolifération des cellules lt-NES (milieu basique).

Milieu DDM	Concentration des stocks	Concentration finale	Par 100 mL
DMEM/F12 avec L-glutamine			96 mL
N2	100 x	1:100	1 mL
L’AENA	100 x	1:100	1 mL
Sodium Pyruvate	100 mM	1:100	1 mL
BSA V Fraction	7.5%	6,6 mL/L	660 μL
2-mercaptoéthanol	50 nM	7 μL/L	0,7 μL
Glucose	45%	3,2 mL/L	320 μL

Tableau 5 : Composition du milieu défini par différenciation (DDM) des cellules lt-NES.

3. Transplantation des cellules GFP-lt-NES en tranches organotypiques hACtx

REMARQUE: Le tissu hACtx doit être cultivé pendant 1 semaine avant la greffe de cellule. Pour faciliter la procédure de transplantation, il est nécessaire de retirer 2 mL du milieu hACtx du haut de l’insert pour empêcher le tissu de flotter.

1. Resuspendre les cellules GFP-lt-NES amorcées corticalement (à partir de l’étape 2.5.6) dans une matrice membranaire basale pure et froide (voir le tableau des matériaux) à une concentration de 1 x 10⁵ cellules/μL et transférer la solution dans un tube stérile plus petit.
   REMARQUE: Pendant la procédure de transplantation, tous les matériaux (embouts de pipettes, tubes, capillaires, etc.) doivent être pré-refroidis pour éviter la solidification du gel. Décongeler le gel de matrice membranaire basale sur de la glace pendant 30 minutes avant son utilisation.
2. Recueillir la suspension cellulaire dans un capillaire en verre froid relié à une tétine en caoutchouc pour l’aspiration. Injectez la suspension cellulaire sous forme de petites gouttes (environ 1 μL chacune) en poignardant la tranche de tissu semi-sèche à différents endroits.
3. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour que le gel se solidifie. Transférez la plaque de l’incubateur à la hotte et ajoutez soigneusement 2 ml de milieu hACtx sur le dessus de l’insert pour immerger complètement le tissu.
4. Remplacer le milieu de culture par un milieu hACtx frais une fois par semaine.

4. Validation

1. Coloration des tranches hACtx
   1. Au moment souhaité, sortez les tranches du laboratoire de culture cellulaire et retirez-les de l’insert en l’immergeant dans une boîte de Petri avec du PBS. Ensuite, transférer les tranches dans des flacons de coloration à l’aide d’une pipette en verre inversé (voir le NOTA à l’étape 1.3.5) et les fixer avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant une nuit à 4 °C.
   2. Rincer 3x avec KPBS pendant 15 min à chaque fois, et incuber toute la nuit à 4 °C avec une solution de perméabilisation (0,02% BSA et 1% Triton X-100 dans KPBS).
   3. Le lendemain, ajouter une solution de blocage (KPBS avec 0,2% de Triton X-100, 1% de BSA, azoture de sodium [1:10 000] et 10% de sérum d’âne normal) et incuber toute la nuit à 4 °C.
   4. Après blocage, ajouter les anticorps primaires (voir tableau 6 pour les dilutions) dilués dans la solution de blocage et incuber pendant 48 h à 4 °C.
   5. Laver 3x avec une solution bloquante sans ajouter de sérum pendant 15 min chacun. Ajouter les anticorps secondaires dilués dans une solution de blocage (voir tableau 6 pour les dilutions) et incuber pendant 48 h à 4 °C.
   6. Laver 3x avec une solution bloquante sans sérum, et incuber pendant 2 h à TA dans une coloration Hoechst diluée dans une solution de perméabilisation (1:1 000).
   7. Lavez 3x avec KPBS, montez les tranches sur des lames de verre à l’aide d’un pinceau et laissez-les sécher. Enfin, rincez les lames avec de l’eau désionisée, enlevez l’excès d’eau, ajoutez le support de montage et recouvrez avec un couvercle en verre. Conserver les lames pendant au moins 24 h à TA et les conserver à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
      NOTE: Pour les anticorps marquant les épitopes nucléaires, effectuer le prélèvement d’antigène avant la perméabilisation (étape 4.1.2) avec du citrate de sodium (10 mM, pH 6,0) pendant 2 h à 65 °C.
2. Pince patch-clamp à cellules entières
   1. Le jour de l’enregistrement, préparer 1 L de liquide céphalorachidien artificiel humain (haCSF), modifié pour mieux correspondre à l’environnement cérébral humain (tableau 7). Comme pour la solution de coupe, faire environ 900 mL de la solution avec tous les ingrédients sauf CaCl 2 dissous dans de l’eau désionisée, et faire des bulles avec du carbogène pendant 15 minutes avant d’ajouter le volume approprié de solution de CaCl₂ 1 M. Remplir la fiole jaugée jusqu’à la marque 1 L et continuer à bouillonner à TA pendant 15 minutes supplémentaires avant de commencer l’enregistrement et tout au long de l’expérience.
   2. Transférer les tranches de tissu de la plaque de culture à la chambre d’enregistrement sur la scène d’un microscope droit qui est constamment perfusé avec du haCSF à bulles à un taux de perfusion de 2 mL/min et chauffé à 34 °C à l’aide d’un régulateur de température de bain.
   3. Tirer les capillaires en verre avec un extracteur de pipette à une résistance moyenne de 3-5 MΩ, et remplir les capillaires avec une solution interne à base de K-gluconate (tableau 8) avec un 2-4 mg de biocytine fraîchement ajouté pour l’identification post-hoc des cellules enregistrées. Le pH et l’osmolarité de cette solution interne sont respectivement de 7,2-7,3 et 285-295 mOsm.
   4. Dans le cas de l’enregistrement de la cellule hôte, obtenez une vue d’ensemble approximative de la tranche avec un objectif 4x et trouvez une cellule d’apparence saine à patcher avec un objectif 40x. Ensuite, procédez avec la pince patch à cellules entières standard.
   5. Dans le cas de l’enregistrement des cellules greffées, identifier la zone tissulaire avec les cellules greffées à l’aide d’un objectif 4x et d’un filtre d’épifluorescence dans la gamme bleue (460 nm) par expression de rapporteur GFP dans la greffe. Ensuite, zoomez sur la zone située avec un objectif 40x et trouvez une cellule greffée exprimant la GFP pour une pince patch standard à cellules entières.
   6. Vérifiez le potentiel de membrane au repos (RMP) immédiatement après avoir pénétré dans la cellule et assurez-vous que la qualité de l’enregistrement est bonne. Enregistrer tous les paramètres d’intérêt (p. ex., résistance de la membrane [Ri], paramètres AP, courants de sodium et de potassium et activité synaptique) dans la configuration tension ou pince de courant de la cellule entière.
   7. Après avoir recueilli toutes les données nécessaires, rétractez soigneusement la pipette d’enregistrement sans endommager davantage la cellule afin qu’elle puisse être identifiée par immunomarquage post-hoc.
   8. Transférer la tranche dans la solution de PFA à 4 % pour une fixation et une coloration ultérieures, comme décrit à l’étape 4.1. La streptavidine est utilisée pour immunomarquer les cellules remplies de biocytine pendant les enregistrements.

ANTICORPS	Dilution	Notes
Primaire
Poulet anti-GFP	1:1000
Poulet anti-MAP2	1:1000
Chèvre anti-AiF1	1:100
Souris anti-MBP	1:1000	Récupération d’antigène nécessaire
Souris anti-SC123	1:2000
Lapin anti-NeuN	1:1000
Lapin anti-Olig2	1:500
Lapin anti-Tmem119	1:200
Secondaire
488-conjugué AffinityPure Donkey anti-souris IgG	1:500
488-conjugué AffinityPure Donkey anti-lapin IgG	1:500
AffinityPure Donkey 488-conjugué IgG anti-poulet	1:500
Affinité conjuguée Cy3Pure Donkey Anti-poulet IgG	1:500
Cy3-conjugué AffinityPure Donkey anti-chèvre IgG	1:500
Cy3-conjugué AffinityPure Donkey anti-souris IgG	1:500
Alexa fluor 647-conjugué streptavidine	1:500

Tableau 6 : Liste des anticorps primaires et secondaires pour l’immunohistochimie.

haCSF	Concentration des stocks	Concentration finale [mM]	Pour 1 L
NaCl	Poudre	129	7,54 g
NaHCO3	Poudre	21	1,76 g
Glucose	Poudre	10	1,80 g
Kcl	Poudre	3	0,22 g
NaH2PO4	Poudre	1.25	0,17 g
MgSO4	1 M	2	2 mL
CaCl2	1 M	1.6	1,6 mL

Tableau 7 : Composition du liquide céphalorachidien artificiel (haCSF).

Solution interne de K-gluconate	Concentration des stocks	Concentration finale [mM]	Par 100 mL
K-gluconate	Poudre	122.5	2,87 g
Kcl	Poudre	12.5	93,18 mg
NaCl	Poudre	8	46,76 mg
HEPES	Poudre	10	238,32 mg
MgATP	Poudre	2	101,4 mg
Na3GTP	Poudre	0.3	17,0 mg
Note: Ajustez le pH avec KOH/HCl

Tableau 8 : Composition de la solution interne à base de K-gluconate.

Résultats

Conformément au protocole décrit, le tissu hACtx d’un patient atteint d’épilepsie du lobe temporal a été prélevé et traité, comme expliqué ci-dessus. Quelques tranches ont été fixées après 24 h en culture pour étudier le point de départ du tissu hôte. L’analyse de différentes populations de cellules neurales telles que les neurones (exprimant NeuN et Map2, Figure 1A), les oligodendrocytes (Olig2 et MBP, Figure 1B) et les astrocytes (GFAP spécifique à l’homme, également appelé STEM123,

Discussion

L’obtention de tranches hACtx de qualité suffisante est l’étape la plus critique de ce protocole. Le tissu cortical est obtenu à partir de patients épileptiques subissant une chirurgie résécante²⁴. La qualité du tissu réséqué, ainsi que le temps d’exposition du tissu entre la résection et la culture, sont critiques; Plus vite le tissu est transféré de la salle d’opération au laboratoire et coupé, plus la culture organotypique sera optimale. Idéalement, le ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Bath temperature controller	Luigs & Neumann	TC0511354
Calcium Chloride dihydrate	Merck	102382
Carbogen gas	Air Liquide	NA
Cooler	Julaba FL 300	9661012.03
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Double Patch-Clamp amplifier	HEKA electronic	EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt	Millipore	371701
HEPES	AppliChem	A1069
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Patchmaster	HEKA electronic	Patchmaster 2x91
Pipette Puller	Sutter	P-2000
Plastic Petri dish	Any suitable
Potassium chloride	Merck	104936
Potassium D-gluconate	ThermoFisher	B25135
Rubber teat + glass pipette	Any suitable
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue	Loctite	2062278
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Vibratome	Leica	VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)	ThermoFisher Scientific	14175095
HEPES	AppliChem	A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys without Phenol Red	StemCell technologies	#05791	Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forceps	Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Animal Free Recombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glucose solution (45%)	Sigma	G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Supplement (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poly-L-Ornithine	Merk	P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein	R&D Systems	5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterile deionized water	MilliQ		MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL	Eppendorf	Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuge	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Sterile tubes	Sarstedt	Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm	VWR	612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL	Biotix VWR	Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Various
T25 flasks Nunc	ThermoFisher Scientific	156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoReserach	711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin	Jackson ImmunoReserach	016-600-084
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoReserach	001-000-162
Chicken anti-GFP	Merk Millipore	AB16901
Chicken anti-MAP2	Abcam	ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG	Jackson ImmunoReserach	705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)	Sigma Aldrich	D27802	Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)	Biorad	AHP2024
Hoechst 33342	Molecular Probes		Nuclear staining
Mouse anti-MBP	BioLegend	808402
Mouse anti-SC123	Stem Cells Inc	AB-123-U-050
Normal Donkey Serum	Merk Millipore	S30-100
Paint brush	Any suitable
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
Distilled water
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)	Merk Millipore	104873
Potassium phospate dibasic (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S3014
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab104225
Rabbit anti-Olig2	Abcam	ab109186
Rabbit anti-TMEM119	Abcam	ab185333
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-5G
Sodium citrate
Distilled water
Tri-Sodium Citrate	Sigma Aldrich	S1804-500G
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	327371000
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope	Zeiss	LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm	VWR	630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm	Marienfeld	107242
Microscope Software	Zeiss	ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable