תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת בשילוב עם השתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קורטיקליים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע, אשר מציגים מתודולוגיה חדשנית לבדיקה נוספת של טיפולים מבוססי תאי גזע להפרעות נוירודגנרטיביות אנושיות.

Abstract

הפרעות נוירודגנרטיביות נפוצות והטרוגניות מבחינת הסימפטומים שלהן וההשפעה התאית, מה שהופך את המחקר שלהם למסובך בשל היעדר מודלים נכונים של בעלי חיים המחקים באופן מלא מחלות אנושיות והזמינות הירודה של רקמת המוח האנושית לאחר המוות. תרבית רקמת העצבים האנושית למבוגרים מציעה את האפשרות לחקור היבטים שונים של הפרעות נוירולוגיות. מנגנונים מולקולריים, תאיים וביוכימיים יכולים להיות מטופלים בקלות במערכת זו, כמו גם בדיקה ותיקוף של תרופות או טיפולים שונים, כגון טיפולים מבוססי תאים. שיטה זו משלבת תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת, המתקבלות מחולי אפילפסיה שעברו ניתוח כריתה, והשתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קליפת המוח המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע. שיטה זו תאפשר לחקור את הישרדות התא, התמיינות עצבית, היווצרות קלטים ויציאות סינפטיים, ואת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאים שמקורם בבני אדם לאחר השתלה ברקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת השלמה. גישה זו היא צעד חשוב לפני פיתוח פלטפורמה תלת-ממדית למידול מחלות אנושיות שתקרב את המחקר הבסיסי לתרגום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע לחולים עם הפרעות נוירולוגיות שונות ותאפשר פיתוח כלים חדשים לשחזור מעגלים עצביים פגועים.

Introduction

הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או שבץ איסכמי, הן קבוצה של מחלות החולקות את התכונה המשותפת של תפקוד עצבי או מוות. הם הטרוגניים במונחים של אזור המוח והאוכלוסייה העצבית מושפעת. למרבה הצער, טיפולים למחלות אלה הם נדירים או בעלי יעילות מוגבלת בשל היעדר מודלים של בעלי חיים המחקים את מה שקורה במוח האנושי ^1,2. טיפול בתאי גזע הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר להתחדשות המוח³. הדור של אבות עצביים מתאי גזע ממקורות שונים התפתח מאוד בשנים האחרונות ^4,5. פרסומים אחרונים הראו כי תאי גזע דמויי נוירואפיתל (lt-NES) המושרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע ארוכי טווח המתחדשים מעצמם, בעקבות פרוטוקול התמיינות קליפת המוח ולאחר השתלה תוך-קורטיקלית במודל חולדה עם שבץ איסכמי המשפיע על קליפת המוח הסומטוסנסורית, מייצרים נוירונים בוגרים בקליפת המוח. בנוסף, תאי העצב שמקורם בשתלים קיבלו קשרים סינפטיים afferent ו-efferent מהנוירונים המארחים, והראו את השתלבותם ברשת העצבית של החולדה ^6,7. האקסונים שמקורם בשתלים עברו מיאלינציה ונמצאו באזורים שונים במוח החולדה, כולל אזור הפרי-אוטם, כפיס המוח וקליפת המוח הסומטוסנסורית. והכי חשוב, השתלת תאי iPS הפכה ליקויים מוטוריים בחיות שבץ⁷.

גם אם מודלים של בעלי חיים עוזרים לחקור הישרדות השתלות, אינטגרציה עצבית והשפעת התאים המושתלים על תפקודים מוטוריים וקוגניטיביים, מידע על אינטראקציה בין תאים אנושיים (שתל-מארח) חסר במערכת זו ^8,9. מסיבה זו, מתוארת כאן שיטה משולבת של תרבית אורגנוטיפית ארוכת טווח במוח האנושי עם השתלת ex vivo של אבות עצביים אנושיים שמקורם בתאי iPS. תרביות אורגנוטיפיות של המוח האנושי המתקבלות מכריתות נוירוכירורגיות הן מודלים תלת-ממדיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של המוח, המאפשרים לחוקרים להגביר את הבנתם את המעגלים החשמליים של מערכת העצבים המרכזית האנושית ואת הדרך המדויקת ביותר לבחון טיפולים להפרעות במוח האנושי. עם זאת, לא נעשה מספיק מחקר בהקשר זה, וברוב המקרים, תרביות אורגנוטיפיות של מוח ההיפוקמפוס האנושי שימשו^10,11. קליפת המוח מושפעת ממספר הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון שבץ איסכמי¹² או מחלת אלצהיימר¹³, ולכן חשוב שתהיה לנו מערכת תלת ממדית קליפת המוח האנושית המאפשרת לנו להרחיב את הידע שלנו ולבדוק ולאמת אסטרטגיות טיפוליות שונות. מספר מחקרים בשנים האחרונות השתמשו בתרביות מרקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת (hACtx) כדי למדל מחלות מוח אנושיות 14,15,16,17,18,19; עם זאת, מידע מוגבל זמין בהקשר של טיפול בתאי גזע. שני מחקרים כבר הוכיחו את היתכנות המערכת המתוארת כאן. בשנת 2018, תאי גזע עובריים אנושיים שתוכנתו עם גורמי שעתוק שונים והושתלו ברקמת hACtx הוכחו כמולידים נוירונים קליפתיים בוגרים שיכולים להשתלב ברשתות קליפת המוח האנושיות הבוגרות²⁰. בשנת 2020, השתלת תאי LT-NES במערכת האורגנוטיפית האנושית חשפה את יכולתם להתמיין לנוירונים קליפתיים בוגרים וספציפיים לשכבה עם התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירונים פונקציונליים. תאי העצב המושתלים יצרו מגעים סינפטיים משפיעים ותוססים עם תאי העצב בקליפת המוח האנושית בפרוסות המוח הבוגרות, כפי שאומתו על ידי מעקב מונוסינפטי מדרדר של נגיף הכלבת, רישומי טלאי של תאים שלמים ומיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני²¹.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות שאושרו על ידי הוועדה האתית המחוזית, לונד, שבדיה (היתר אתי מספר 2021-07006-01). רקמה ניאוקורטיקלית בריאה התקבלה מחולים שעברו ניתוח אלקטיבי לאפילפסיה של האונה הרקתית. הסכמה מדעת התקבלה מכל החולים.

הערה: כל הרקמות שהתקבלו עובדו ללא קשר לגודלן. עם זאת, רקמות קטנות מ 1-1.5 מ"מ³ בגודל יהיה מאתגר מבחינה טכנית לטפל לחתוך עם ויברטום.

1. איסוף, תחזוקה, חיתוך וציפוי רקמות

1. הכנות ביום שלפני חיתוך רקמות
   1. מכינים 2 ליטר של תמיסת חיתוך (טבלה 1) בצלוחית נפחית. יש להמיס את כל המרכיבים למעט MgCl 2 ו-CaCl₂ ב~1,800 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ולבעבע בגז קרבוגן למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסיפו כמויות מתאימות של 1 M MgCl 2 ו-CaCl₂ והמשיכו לבעבע במשך 15 דקות נוספות. לבסוף, למלא את הבקבוק עד סימן 2 L; בדוק את ה- pH והאוסמולריות והתאם במידת הצורך. להקפיא 2 x 350 מ"ל של פתרון מוכן ולאחסן את השאר ב 4 °C.
      הערה: ה- pH והאוסמולריות הם בדרך כלל 7.3-7.4 ו- 295-300 mOsm, בהתאמה.
   2. הכינו 100 מ"ל של תמיסת שטיפה (טבלה 2). להמיס 476 מ"ג HEPES ו-200.6 מ"ג גלוקוז ב-100 מ"ל HBSS בתוספת 5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין. זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C עד 10 ימים.
   3. הכינו מדיום תרבית קליפת המוח האנושית הבוגרת (hACtx) (מדיום hACtx) (טבלה 3) וסננו אותו במעבדה לתרביות תאים מתחת למכסה מנוע מאוורר. התווך מורכב מתווך עצבי ללא אדום פנול (ראה טבלת חומרים), תוסף B27, L-גלוטמין (ראה טבלת חומרים) וגנטמיצין. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
2. הכנות ביום הניתוח לפני הגעת דגימות הרקמה
   1. בדקו את זמינות הציוד הדרוש וחלל המעבדה, ונקו היטב את כל כלי הניתוח ואת הוויברטומה (ראו טבלת חומרים), כמו גם את חלל הספסל, במים מזוקקים (ללא חומר ניקוי), ולאחר מכן 70% אתנול. תן אתנול להתייבש לפחות 30 דקות לפני השימוש בכלים ובציוד.
   2. מרסקים את תמיסת החיתוך הקפואה ומבעבעים את "מרק" הקרח והנוזל בגז קרבוגן למשך 30 דקות. לאחר מכן, סגור היטב את אחד המיכלים עם תמיסה כתוש "מרק" ומניחים אותו בתיבת הקרח. זה ישמש לאיסוף הרקמה מחדר הניתוח.
   3. כיילו את הוויברטום וקבעו את פרמטרי החיתוך: מהירות 0.05 מ"מ לשנייה ורטט 1.7 מ"מ. מניחים את תא החיתוך על במת ויברטומה ומתחילים את הצידנית המחוברת אליה כך שהתא יהיה בטמפרטורה קבועה של -3 מעלות צלזיוס.
   4. הכינו את תא איסוף הפרוסות עם תוספות כדי להניח את פרוסות הרקמה ותמיסת החיתוך, מבעבעים אותה כל הזמן עם גז קרבוגן בטמפרטורת החדר (RT).
   5. במעבדה לתרביות תאים ומתחת למכסה מנוע מאוורר, מניחים את תוספות התרבית בצלחת בעלת 6 בארות באמצעות מלקחיים. הוסף 5 מ"ל של מדיום hACtx בתחתית העלון עד שהוא בא במגע עם הממברנה, תוך הימנעות מהיווצרות בועות, והוסף 2 מ"ל בחלק העליון של העלון. יש לאזן באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך שעתיים לפחות לפני העברת פרוסות הרקמה לתוספות.
3. הליכי איסוף וחיתוך רקמות
   1. מיד לאחר הכריתה, יש לאסוף את הרקמה מהמטופל בחדר הניתוח, במידת האפשר, ישירות לתוך מיכל עם תמיסת חיתוך קפואה, מבעבעת ומרוסקת. מעבירים מיד את המיכל הסגור על קרח לאזור החיתוך של המעבדה.
   2. בדוק את הרקמה ואתר את המשטח הטוב ביותר להדבקה (ראה שלב 1.3.3) אותה לשלב החיתוך של הוויברטום, בהתחשב בכיוון של שכבות קליפת המוח. במידת הצורך, חותכים את המשטח הלא אחיד עם אזמל כך שיהיה קל להניח את הרקמה על הבמה לכיוון פרוסה אופטימלי.
   3. מדביקים את הרקמה לשלב בדבק רקמות (ראו טבלת חומרים), מניחים אותה בתא החיתוך וממלאים מיד את החדר בתמיסת חיתוך בועות קרות. המשיכו את המבעבעים במהלך כל הליך החיתוך.
   4. חותכים פרוסות קורונליות או קשת, בהתאם לכיוון הרקמה ללהב, בעובי של 300 מיקרומטר כדי להכיל את כל שכבות קליפת המוח, ואם אפשר, את החומר הלבן. מניחים את הפרוסות בתא האיסוף עם תמיסת חיתוך מבעבעת ב- RT.
      הערה: חתכו מצד החומר הלבן לכיוון פני השטח של קליפת המוח. אין להסיר את קרומי המוח, שכן הדבר עלול לפגוע ברקמה. להב החיתוך בדרך כלל פורס אותם בקלות.
   5. לאחר שכל הרקמה נחתכה, העבירו את הפרוסות לצלחת פטרי סטרילית עם תמיסת שטיפה ב-RT והעבירו אותן למעבדה לתרביות תאים. שלב זה יש צורך להסיר עודפי סוכרוז מן הפרוסות לפני העברתם לצלחת התרבית.
      הערה: כדי להעביר את הפרוסות (בשלב זה ובשלבים הבאים), השתמשו בפיפטת זכוכית הפוכה, שברו את החלק הדק יותר והניחו טיט גומי לשאיבה.
4. תרבית ותחזוקה של פרוסות רקמת hACtx
   1. הניחו בנפרד את פרוסות הרקמה על גבי התוספות שכבר היו רטובות ושקועות. לאחר 24 שעות, שנה את המדיום כדי להסיר עוד יותר את שאריות הסוכרוז או חומרים שיוריים אחרים מהליכי החיתוך.
   2. החליפו את מדיום התרבית במדיום טרי כל 7 ימים. לאחר שבועיים, יש להשתמש במדיום hACtx ללא גנטמיצין. התרבות יכולה להישמר עד חודשיים.
      הערה: יש לאזן את מדיום ה-hACtx באינקובטור ב-37°C וב-5%_CO2 למשך שעתיים לפחות לפני השינוי הבינוני. מדיום טרי צריך להיות מוכן כל שבועיים. בדקו את הפרוסות כל 2-3 ימים, ואם חלק מהמדיום התאדה, הוסיפו עוד לחלק העליון של העלון.

פתרון חיתוך	ריכוז מלאי	ריכוז סופי [mM]	לכל 1 ליטר
סוכרוז	אבקה	200	68.46 גרם
NaHCO3	אבקה	21	1.76 גרם
KCl	אבקה	3	0.22 גרם
NaH2PO4	אבקה	1.25	0.17 גרם
גלוקוז	אבקה	10	1.80 גרם
MgSO4	1 מטר	2	2 מ"ל
CaCl2	1 מטר	1.6	1.6 מ"ל
MgCl2	2 מטר	2	1 מ"ל

טבלה 1: הרכב תמיסת החיתוך. MgCl 2 ו-CaCl₂ משמשים כתמיסות מוכנות מראש של 1 M במים נטולי יונים.

תמיסת שטיפה	ריכוז מלאי	ריכוז סופי	לכל 100 מ"ל
HBSS	1x		95 מ"ל
PenStrep	10,000 U/מ"ל	500 U / מ"ל	5 מ"ל
HEPES	אבקה	4.76 גרם/ליטר	476 מ"ג
גלוקוז	אבקה	2 גרם/ליטר	200.6 מ"ג

טבלה 2: הרכב תמיסת שטיפה.

hACtx בינוני	ריכוז מלאי	ריכוז סופי	לכל 100 מ"ל
תווך עצבי ללא פנול אדום			97.4 מ"ל	ראה טבלת חומרים
B27	פי 50	1:50	2 מ"ל
ל-גלוטמין	פי 100	1:200	500 μL	ראה טבלת חומרים
גנטמיצין	50 מ"ג/מ"ל	1:1000	100 מיקרוליטר

טבלה 3: הרכב מדיום hACtx.

2. התרבות והתמיינות של תאי lt-NES

הערה: תאי Lt-NES נוצרים כפי שתואר קודם לכן^21,22 ומומרים באמצעות וקטור לנטי-ויראלי הנושא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת מקדם מכונן (תאי GFP-lt-NES). בקבוקונים המכילים 3 x 10⁶ תאים מאוחסנים ב -150 ° C עד לשימוש.

1. הכנת פתרונות מלאי ומדיה
   1. לדלל 100 מיקרוגרם של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) ב 10 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. להכין 100 μL aliquots.
   2. לדלל 100 מיקרוגרם של גורם גדילה אפידרמיס (EGF) ב 10 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. להכין 100 μL aliquots.
   3. תוספת Aliquot 50x B27 בנפח של 100 μL לכל aliquot.
   4. לדלל 10 מ"ג של poly-L-ornithine ב 100 מ"ל של מים deionized יש ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל. הפוך 1 מ"ל aliquots.
   5. הכן 30 μL aliquots של 1.20 מ"ג / מ"ל למינין עכבר.
   6. לדלל 10 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%) ב 90 מ"ל של PBS לריכוז מלאי של 0.025%. הכן 1 מ"ל aliquots.
   7. לדלל 0.025 גרם של מעכב טריפסין ב 50 מ"ל של PBS לריכוז מלאי של 0.5 מ"ג / מ"ל. הכן 1 מ"ל aliquots.
   8. יש לדלל 10 מיקרוגרם של Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family member 3A) ב-1 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. הכינו BMP4 (חלבון מורפוגנטי עצם 4) באותו אופן. Aliquot בנפח של 100 μL.
   9. לדלל 1 מ"ג של ציקלופמין ב 2.5 מ"ל של DMSO לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם / מ"ל, ולעשות 100 μL aliquots.
   10. הכינו מדיום בסיסי (טבלה 4) ומדיום מוגדר בידול (DDM, טבלה 5), ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
2. ציפוי של כלי תרבות
   1. כדי לצפות מראש את הכלים לתרבית תאי GFP-It-NES במהלך התרבות או התמיינות, לדלל פולי-L-אורניתין 1:100 במים נטולי יונים, ולהוסיף 5 מ"ל של התמיסה לצלוחית T25. לדגור לילה ב-RT.
   2. שטפו את הצלחות מצופות הפולי-L-אורניתין 1x עם מים נטולי יונים, ו-1x עם PBS.
   3. עבור תאי GFP-It-NES בהתפשטות, יש לדלל את למינין העכבר בשעה 1:500 ב-PBS ולדגור במשך שעתיים לפחות ב-37°C. עבור תאי GFP-It-NES בהתמיינות, יש לדלל את למינין העכבר בשעה 1:100 ב-PBS ולדגור במשך שעתיים לפחות ב-37°C.
3. התפשטות תאי GFP-lt-NES
   1. חם 5 מ"ל (לשטיפה) ו 5 מ"ל (לזריעה) של מדיום בסיסי בשני צינורות שונים 15 מ"ל.
   2. הפשירו במהירות בקבוקון אחד של תאי GFP-lt-NES בטמפרטורה של 37°C, העבירו אותם לצינור הכביסה ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות.
   3. שאפו את המדיום בזהירות מבלי לגעת בכדור, והשעו מחדש את התאים ב -1 מ"ל של מדיום בסיסי שחומם מראש. העבירו את תרחיף התא לצינור הזריעה המכיל תווך בסיסי בתוספת גורמי התפשטות: EGF (10 ננוגרם/מ"ל), bFGF (10 ננוגרם/מ"ל) ו-B27 (10 ננוגרם/מ"ל). זרעו את התאים על בקבוק T25 מצופה פולי-L-אורניתין/למינין.
   4. להאכיל את התאים עם גורמי התרבות כל יום. החלף את המדיום אם הוא הופך לצהוב. מעבר התאים כל יום שלישי או רביעי (יום אחד לאחר שהם מגיעים 100% מפגש).
4. פיצול תאי GFP-lt-NES לצורך התרבות והתמיינות
   1. חימום מראש של 5 מ"ל של מדיום בסיסי לכל בקבוק (כדי לאסוף את התאים), בתוספת הנפח הכולל הדרוש כדי לזרוע אותם מחדש.
      הערה: המעבר נעשה בדילול של 1:3 כדי לשמור על התאים בהתפשטות, הדורש 15 מ"ל של תווך בסיסי, ודילול של 1:6 כדי להתחיל התמיינות, הדורש 30 מ"ל של תווך בסיסי.
   2. הסר את המדיום מבקבוק תרבית התאים על ידי שאיפה, והוסף 500 μL של 0.025% טריפסין שחומם מראש. יש לדגור במשך 5-10 דקות ב-RT. ניתן לאשר את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי בהגדלה של פי 10.
   3. הוסף נפח שווה של מעכב טריפסין (ריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל) ואחריו 5 מ"ל של מדיום בסיסי חם. נתקו ואספו את התאים על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה. מעבירים את התאים לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
   4. כדי לשמור על התאים בהתפשטות, יש לבצע דילול של 1:3 בתווך בסיסי טרי בתוספת גורמי התפשטות, ולחזור על שלב 2.3.4.
5. התמיינות קורטיקלית של תאי GFP-lt-NES
   1. ביום 0, יש להשהות מחדש את התאים (שישמשו להתמיינות) ב-30 מ"ל של תווך בסיסי בתוספת גורמי התפשטות, ולחלוף אותם בשש צלוחיות T25 מצופות התמיינות (פיצול 1:6).
   2. ביום הראשון, שנו מחצית מהתווך ל-DDM, והוסיפו גורמי התפשטות במחצית מהריכוז שלהם.
   3. ביום השני, שנה את המדיום לחלוטין ל- DDM בתוספת גורמי התמיינות : BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל), Wnt3a (10 נ"ג/מ"ל) וציקלופמין (400 נ"ג/מ"ל).
   4. ביום הרביעי, הוסף את גורמי הבידול בלבד. החלף את המדיום אם הוא הופך לצהוב.
   5. ביום השישי, שנה את המדיום ל- DDM בתוספת BMP4 ו- Wnt3a. הציקלופמין מוסר בשלב זה.
   6. ביום השביעי, נתק את התאים כאמור בשלב 2.4.2 ובשלב 2.4.3.

מדיום בסיסי	ריכוז מלאי	ריכוז סופי	לכל 100 מ"ל
DMEM/F12 עם L-גלוטמין	1x		98.7 מ"ל
תוספת N-2	פי 100	1:100	1 מ"ל
גלוקוז	45%	3.5 מ"ל/ליטר	350 מיקרוליטר

טבלה 4: הרכב מדיום ההתרבות של תאי lt-NES (תווך בסיסי).

DDM בינוני	ריכוז מלאי	ריכוז סופי	לכל 100 מ"ל
DMEM/F12 עם L-גלוטמין			96 מ"ל
N2	פי 100	1:100	1 מ"ל
NEAA	פי 100	1:100	1 מ"ל
נתרן פירובט	100 מ"מ	1:100	1 מ"ל
שבר BSA V	7.5%	6.6 מ"ל/ליטר	660 μL
2-מרקפטואתנול	50 נאנומטר	7 מיקרוליטר/ליטר	0.7 מיקרוליטר
גלוקוז	45%	3.2 מ"ל/ליטר	320 μL

טבלה 5: הרכב תווך מוגדר התמיינות (DDM) של תאי lt-NES.

3. השתלת תאי GFP-lt-NES בפרוסות hACtx אורגנוטיפיות

הערה: רקמת hACtx צריכה להיות בתרבית במשך שבוע לפני השתלת תאים. כדי להקל על הליך ההשתלה, יש צורך להסיר 2 מ"ל של מדיום hACtx מהחלק העליון של הכנס כדי למנוע את הרקמה לצוף.

1. יש להשהות מחדש את תאי GFP-lt-NES (החל משלב 2.5.6) במטריצת קרום מרתף טהורה קרה (ראה טבלת חומרים) בריכוז של 1 x 10⁵ תאים/μL ולהעביר את התמיסה לצינור סטרילי קטן יותר.
   הערה: במהלך הליך ההשתלה, יש לקרר מראש את כל החומרים (קצוות פיפטה, צינורות, נימים וכו ') כדי למנוע התמצקות ג'ל. הפשירו את ג'ל מטריצת קרום המרתף על קרח למשך 30 דקות לפני השימוש בו.
2. אספו את מתלה התא לתוך נימי זכוכית קרים המחוברים לטיט גומי לשאיבה. הזריקו את תרחיף התאים כטיפות קטנות (כ-1 מיקרוליטר כל אחת) על ידי דקירה של פרוסת הרקמה החצי יבשה באתרים שונים.
3. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי שהג'ל יתמצק. מעבירים את הצלחת מהאינקובטור בחזרה למכסה המנוע, ומוסיפים בזהירות 2 מ"ל של מדיום hACtx לחלק העליון של האינקובטור כדי לטבול לחלוטין את הרקמה.
4. החליפו את מדיום התרבית במדיום hACtx טרי פעם בשבוע.

4. אימות

1. צביעת פרוסות hACtx
   1. בנקודת הזמן הרצויה, הוציאו את הפרוסות מהמעבדה לתרביות תאים, והוציאו אותן מהחדרה על ידי טבילתה בצלחת פטרי עם PBS. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לבקבוקוני צביעה באמצעות פיפטת זכוכית הפוכה (ראו הערה בשלב 1.3.5), וקבעו אותן עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
   2. יש לשטוף 3 פעמים עם KPBS במשך 15 דקות בכל פעם, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם תמיסת חדירה (0.02% BSA ו-1% Triton X-100 ב-KPBS).
   3. למחרת, הוסיפו תמיסת חסימה (KPBS עם 0.2% טריטון X-100, 1% BSA, נתרן אזיד [1:10,000], ו-10% סרום חמורים רגיל), ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
   4. לאחר החסימה, מוסיפים את הנוגדנים הראשוניים (ראה טבלה 6 לדילול) המדוללים בתמיסת החסימה, ודגרים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. יש לשטוף 3 פעמים בתמיסת חסימה מבלי להוסיף סרום למשך 15 דקות כל אחד. מוסיפים את הנוגדנים המשניים המדוללים בתמיסת חסימה (ראו טבלה 6 לדילול), ודגרים במשך 48 שעות ב-4°C.
   6. יש לשטוף 3x בתמיסת חסימה ללא סרום, ולדגור במשך שעתיים ב-RT בכתם Hoechst מדולל בתמיסת חדירה (1:1,000).
   7. שטפו 3x עם KPBS, הרכיבו את הפרוסות על שקופיות זכוכית באמצעות מברשת צבע, והניחו להן להתייבש. לבסוף, שטפו את המגלשות במים נטולי יונים, הסירו עודפי מים, הוסיפו את אמצעי ההרכבה וכסו בכיסוי זכוכית. שמור את השקופיות למשך 24 שעות לפחות ב- RT, ואחסן אותן ב- 4 ° C עד להדמיה.
      הערה: עבור נוגדנים המסמנים אפיטופים גרעיניים, בצע שליפת אנטיגן לפני חדירה (שלב 4.1.2) עם נתרן ציטראט (10 mM, pH 6.0) במשך 2 שעות ב 65 ° C.
2. מהדק טלאי של תא שלם
   1. ביום ההקלטה, הכינו ליטר אחד של נוזל מוחי מלאכותי אנושי (haCSF), שעבר שינוי כדי להתאים טוב יותר לסביבת המוח האנושי (טבלה 7). בדומה לתמיסת החיתוך, הכינו כ-900 מ"ל של התמיסה עם כל המרכיבים למעט CaCl 2 מומסים במים נטולי יונים, ובעבעו אותה עם קרבוגן למשך 15 דקות לפני הוספת הנפח המתאים של תמיסת CaCl₂ 1 M. ממלאים את הבקבוק הנפחי עד לסימן 1 ליטר, וממשיכים לבעבע ב-RT במשך 15 דקות נוספות לפני תחילת ההקלטה ולאורך כל הניסוי.
   2. מעבירים את פרוסות הרקמה מצלחת התרבית לתא ההקלטה על במת מיקרוסקופ זקוף המחורר כל הזמן עם haCSF מבעבע בקצב זילוח של 2 מ"ל/דקה ומחומם ל-34 מעלות צלזיוס באמצעות בקר טמפרטורת אמבטיה.
   3. משוך נימי זכוכית עם מושך פיפטה להתנגדות ממוצעת של 3-5 MΩ, ומלא את הנימים בתמיסה פנימית מבוססת K-gluconate (טבלה 8) בתוספת טרייה של 2-4 מ"ג ביוציטין לזיהוי פוסט-הוק של התאים המתועדים. ה- pH והאוסמולריות של פתרון פנימי זה הם 7.2-7.3 ו- 285-295 mOsm, בהתאמה.
   4. במקרה של הקלטת תא מארח, קבל סקירה גסה של הפרוסה עם מטרה 4x, ומצא תא בריא לתיקון עם מטרה 40x. לאחר מכן, המשך עם מהדק תיקון סטנדרטי של תא שלם.
   5. במקרה של רישום תאים מושתלים, זהה את אזור הרקמה עם התאים המושתלים באמצעות מטרה 4x ומסנן אפיפלואורסצנטי בטווח הכחול (460 ננומטר) על ידי ביטוי כתב GFP בשתל. לאחר מכן, התקרבו לאזור הממוקם עם מטרה של 40x, ומצאו תא מושתל המבטא GFP עבור מהדק תיקון סטנדרטי של תא שלם.
   6. בדקו את פוטנציאל קרום המנוחה (RMP) מיד לאחר הפריצה לתא, וודאו שאיכות ההקלטה טובה. רשום את כל הפרמטרים המעניינים (לדוגמה, התנגדות הממברנה [Ri], פרמטרי AP, זרמי נתרן ואשלגן ופעילות סינפטית) בתצורת מתח התא כולו או מהדק הזרם.
   7. לאחר איסוף כל הנתונים הדרושים, בזהירות למשוך פיפטה ההקלטה מבלי לפגוע עוד יותר התא, כך שניתן לזהות עם immunostaining פוסט-הוק.
   8. העבירו את הפרוסה לתמיסת 4% PFA להמשך קיבוע וצביעה, כמתואר בשלב 4.1. סטרפטאבידין משמש לסימון חיסוני של התאים המלאים בביוציטין במהלך ההקלטות.

נוגדנים	דילול	הערות
הראשי
עוף נגד GFP	1:1000
עוף נגד MAP2	1:1000
עז נגד AiF1	1:100
עכבר נגד MBP	1:1000	יש צורך בשליפת אנטיגן
עכבר נגד SC123	1:2000
ארנב אנטי NeuN	1:1000
ארנב אנטי-אוליג2	1:500
ארנב נגד Tmem119	1:200
משני
488-זיקה מצומדתחמור טהור נגד עכבר IgG	1:500
488-זיקה מצומדתחמור טהור נגד ארנב IgG	1:500
488-זיקה מצומדתחמור טהור נגד עוף IgG	1:500
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey נגד עוף IgG	1:500
Cy3-conjugated Affinityחמור טהור נגד עז IgG	1:500
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey נגד עכבר IgG	1:500
אלקסה פלואור 647-מצומד סטרפטאבידין	1:500

טבלה 6: רשימת נוגדנים ראשוניים ומשניים לאימונוהיסטוכימיה.

haCSF	ריכוז מלאי	ריכוז סופי [mM]	לכל 1 ליטר
NaCl	אבקה	129	7.54 גרם
NaHCO3	אבקה	21	1.76 גרם
גלוקוז	אבקה	10	1.80 גרם
KCl	אבקה	3	0.22 גרם
NaH2PO4	אבקה	1.25	0.17 גרם
MgSO4	1 מטר	2	2 מ"ל
CaCl2	1 מטר	1.6	1.6 מ"ל

טבלה 7: הרכב נוזל מוחי מלאכותי (haCSF).

פתרון פנימי K-Gluconate	ריכוז מלאי	ריכוז סופי [mM]	לכל 100 מ"ל
קיי-גלוקונאט	אבקה	122.5	2.87 גרם
KCl	אבקה	12.5	93.18 מ"ג
NaCl	אבקה	8	46.76 מ"ג
HEPES	אבקה	10	238.32 מ"ג
MgATP	אבקה	2	101.4 מ"ג
Na3GTP	אבקה	0.3	17.0 מ"ג
הערה: התאמת pH עם KOH/HCl

טבלה 8: הרכב תמיסה פנימית מבוססת K-gluconate.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול המתואר, רקמת hACtx מחולה עם אפילפסיה של האונה הרקתית נאספה ועובדה, כפי שהוסבר לעיל. כמה פרוסות נקבעו לאחר 24 שעות בתרבית כדי לחקור את נקודת ההתחלה של הרקמה המארחת. ניתוח של אוכלוסיות תאים עצביים שונות כמו תאי עצב (המבטאים NeuN ו-Map2, איור 1A), אוליגודנדרוציטים (Olig2 ו-MBP, איור 1B) ואסטרו...

Discussion

השגת פרוסות hACtx באיכות גבוהה מספיק היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. רקמת קליפת המוח מתקבלת מחולים אפילפטיים שעברו ניתוח כריתה²⁴. איכות הרקמה המנותחת, כמו גם זמן החשיפה של הרקמה בין כריתה לתרבית, היא קריטית; ככל שהרקמה מועברת מהר יותר מחדר הניתוח למעבדה ונחתכת, כך הת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Bath temperature controller	Luigs & Neumann	TC0511354
Calcium Chloride dihydrate	Merck	102382
Carbogen gas	Air Liquide	NA
Cooler	Julaba FL 300	9661012.03
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Double Patch-Clamp amplifier	HEKA electronic	EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt	Millipore	371701
HEPES	AppliChem	A1069
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Patchmaster	HEKA electronic	Patchmaster 2x91
Pipette Puller	Sutter	P-2000
Plastic Petri dish	Any suitable
Potassium chloride	Merck	104936
Potassium D-gluconate	ThermoFisher	B25135
Rubber teat + glass pipette	Any suitable
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue	Loctite	2062278
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Vibratome	Leica	VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)	ThermoFisher Scientific	14175095
HEPES	AppliChem	A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys without Phenol Red	StemCell technologies	#05791	Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forceps	Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Animal Free Recombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glucose solution (45%)	Sigma	G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Supplement (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poly-L-Ornithine	Merk	P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein	R&D Systems	5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterile deionized water	MilliQ		MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL	Eppendorf	Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuge	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Sterile tubes	Sarstedt	Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm	VWR	612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL	Biotix VWR	Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Various
T25 flasks Nunc	ThermoFisher Scientific	156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoReserach	711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin	Jackson ImmunoReserach	016-600-084
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoReserach	001-000-162
Chicken anti-GFP	Merk Millipore	AB16901
Chicken anti-MAP2	Abcam	ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG	Jackson ImmunoReserach	705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)	Sigma Aldrich	D27802	Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)	Biorad	AHP2024
Hoechst 33342	Molecular Probes		Nuclear staining
Mouse anti-MBP	BioLegend	808402
Mouse anti-SC123	Stem Cells Inc	AB-123-U-050
Normal Donkey Serum	Merk Millipore	S30-100
Paint brush	Any suitable
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
Distilled water
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)	Merk Millipore	104873
Potassium phospate dibasic (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S3014
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab104225
Rabbit anti-Olig2	Abcam	ab109186
Rabbit anti-TMEM119	Abcam	ab185333
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-5G
Sodium citrate
Distilled water
Tri-Sodium Citrate	Sigma Aldrich	S1804-500G
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	327371000
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope	Zeiss	LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm	VWR	630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm	Marienfeld	107242
Microscope Software	Zeiss	ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable