Cultivos organotípicos de corteza humana adulta como modelo ex vivo para el trasplante y validación de células madre humanas

Resumen

Este protocolo describe cultivos organotípicos a largo plazo de la corteza humana adulta combinados con trasplante intracortical ex vivo de progenitores corticales derivados de células madre pluripotentes inducidas, que presentan una metodología novedosa para probar aún más las terapias basadas en células madre para trastornos neurodegenerativos humanos.

Resumen

Los trastornos neurodegenerativos son comunes y heterogéneos en cuanto a sus síntomas y afectación celular, lo que complica su estudio debido a la falta de modelos animales adecuados que imiten completamente las enfermedades humanas y la escasa disponibilidad de tejido cerebral humano post-mortem. El cultivo de tejido nervioso humano adulto ofrece la posibilidad de estudiar diferentes aspectos de los trastornos neurológicos. Los mecanismos moleculares, celulares y bioquímicos podrían abordarse fácilmente en este sistema, así como probar y validar medicamentos o diferentes tratamientos, como las terapias basadas en células. Este método combina cultivos organotípicos a largo plazo de la corteza humana adulta, obtenidos de pacientes epilépticos sometidos a cirugía resectiva, y trasplante intracortical ex vivo de progenitores corticales derivados de células madre pluripotentes inducidos. Este método permitirá el estudio de la supervivencia celular, la diferenciación neuronal, la formación de entradas y salidas sinápticas y las propiedades electrofisiológicas de las células derivadas del ser humano después del trasplante en tejido cortical humano adulto intacto. Este enfoque es un paso importante previo al desarrollo de una plataforma de modelado de enfermedades humanas en 3D que acercará la investigación básica a la traducción clínica de terapias basadas en células madre para pacientes con diferentes trastornos neurológicos y permitirá el desarrollo de nuevas herramientas para reconstruir circuitos neuronales dañados.

Introducción

Los trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o el accidente cerebrovascular isquémico, son un grupo de enfermedades que comparten la característica común del mal funcionamiento neuronal o la muerte. Son heterogéneos en cuanto al área cerebral y población neuronal afectada. Desafortunadamente, los tratamientos para estas enfermedades son escasos o de eficacia limitada debido a la falta de modelos animales que imiten lo que ocurre en el cerebro humano ^1,2. La terapia con células madre es una de las estrategias más prometedoras para la regeneración cerebral³. La generación de progenitores neuronales a partir de células madre de diferentes fuentes se ha desarrollado mucho en los últimos años ^4,5. Publicaciones recientes han demostrado que las células madre neuroepiteliales autorenovadoras a largo plazo (lt-NES) derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPS), siguiendo un protocolo de diferenciación cortical y después del trasplante intracortical en un modelo de rata con accidente cerebrovascular isquémico que afecta a la corteza somatosensorial, generan neuronas corticales maduras. Además, las neuronas derivadas del injerto recibieron conexiones sinápticas aferentes y eferentes de las neuronas huésped, mostrando su integración en la red neuronal de ratas ^6,7. Los axones derivados del injerto se mielinizaron y se encontraron en diferentes áreas del cerebro de la rata, incluida el área periinfarto, el cuerpo calloso y la corteza somatosensorial contralateral. Lo más importante es que el trasplante derivado de células iPS revirtió los déficits motores en animales con accidente cerebrovascular⁷.

Incluso si los modelos animales ayudan a estudiar la supervivencia del trasplante, la integración neuronal y el efecto de las células injertadas sobre las funciones motoras y cognitivas, la información sobre la interacción entre células humanas (injerto-huésped) falta en este sistema ^8,9. Por esta razón, aquí se describe un método combinado de cultivo organotípico del cerebro humano a largo plazo con el trasplante ex vivo de progenitores neuronales derivados de células iPS humanas. Los cultivos organotípicos del cerebro humano obtenidos de resecciones neuroquirúrgicas son modelos 3D fisiológicamente relevantes del cerebro que permiten a los investigadores aumentar su comprensión de los circuitos del sistema nervioso central humano y la forma más precisa de probar tratamientos para trastornos cerebrales humanos. Sin embargo, no se ha realizado suficiente investigación en este contexto, y en la mayoría de los casos, se han utilizado cultivos organotípicos del cerebro del hipocampo humano^10,11. La corteza cerebral se ve afectada por varios trastornos neurodegenerativos, como el ictus isquémico¹² o la enfermedad de Alzheimer¹³, por lo que es importante contar con un sistema 3D cortical humano que nos permita ampliar nuestros conocimientos y probar y validar diferentes estrategias terapéuticas. Varios estudios realizados en los últimos años han utilizado cultivos de tejido cortical humano adulto (hACtx) para modelar enfermedades cerebrales humanas 14,15,16,17,18,19; sin embargo, hay información limitada disponible en el contexto de la terapia con células madre. Dos estudios ya han demostrado la viabilidad del sistema descrito aquí. En 2018, se demostró que las células madre embrionarias humanas programadas con diferentes factores de transcripción y trasplantadas en tejido hACtx dan lugar a neuronas corticales maduras que podrían integrarse en redes corticales humanas adultas²⁰. En 2020, el trasplante de células lt-NES en el sistema organotípico humano reveló su capacidad para diferenciarse en neuronas corticales maduras y específicas de capa con las propiedades electrofisiológicas de las neuronas funcionales. Las neuronas injertadas establecieron contactos sinápticos aferentes y eferentes con las neuronas corticales humanas en los cortes cerebrales adultos, como lo corroboran el trazado monosináptico retrógrado del virus de la rabia, los registros de pinzas de parche de células enteras y la microscopía inmunoelectrónica²¹.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices aprobadas por el Comité Regional de Ética, Lund, Suecia (número de permiso ético 2021-07006-01). Se obtuvo tejido neocortical sano de pacientes sometidos a cirugía electiva para la epilepsia del lóbulo temporal. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.

NOTA: Todos los tejidos obtenidos fueron procesados independientemente de su tamaño. Sin embargo, los tejidos de menos de 1-1.5 mm³ de tamaño serán técnicamente difíciles de manejar y seccionar con un vibratomo.

1. Recolección de tejidos, mantenimiento, corte y recubrimiento

1. Preparaciones el día antes del corte de tejido
   1. Preparar 2 L de solución de corte (tabla 1) en un matraz aforado. Disuelva todos los ingredientes excepto MgCl 2 y CaCl₂ en ~ 1,800 ml de agua desionizada y burbujee con gas carbógeno durante 15 min. Luego agregue cantidades apropiadas de soluciones de 1 M de MgCl 2 y CaCl₂ y continúe burbujeando durante otros 15 minutos. Por último, llenar el matraz hasta la marca de 2 L; compruebe el pH y la osmolaridad y ajuste si es necesario. Congelar 2 x 350 ml de la solución preparada y almacenar el resto a 4 °C.
      NOTA: El pH y la osmolaridad son típicamente 7.3-7.4 y 295-300 mOsm, respectivamente.
   2. Preparar 100 ml de solución de enjuague (Tabla 2). Disuelva 476 mg de HEPES y 200,6 mg de glucosa en 100 ml de HBSS suplementado con 5 ml de penicilina/estreptomicina. Esto se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 10 días.
   3. Preparar el medio de cultivo cortical adulto humano (medio hACtx) (medio hACtx) (Tabla 3) y filtrarlo en el laboratorio de cultivo celular bajo una campana ventilada. El medio comprende medio neuronal sin rojo fenol (ver la Tabla de Materiales), suplemento B27, L-glutamina (ver la Tabla de Materiales) y gentamicina. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
2. Preparativos el día de la operación antes de la llegada de las muestras de tejido
   1. Verifique la disponibilidad del equipo necesario y el espacio de laboratorio, y limpie a fondo todas las herramientas quirúrgicas y el vibratomo (consulte la Tabla de materiales), así como el espacio de sobremesa, con agua destilada (sin detergente), seguido de etanol al 70%. Deje que el etanol se seque durante al menos 30 minutos antes de usar las herramientas y el equipo.
   2. Triture la solución de corte congelada y burbujee la "sopa" de hielo y líquido con gas carbógeno durante 30 minutos. Luego, cierre herméticamente uno de los recipientes con la solución triturada "sopa" y colóquelo en la nevera. Esto se usará para recolectar el tejido de la sala de operaciones.
   3. Calibre el vibratomo y ajuste los parámetros de corte: velocidad de 0,05 mm/s y vibración de 1,7 mm. Coloque la cámara de corte en una etapa de vibratomo y encienda el enfriador conectado a ella para que la cámara esté a una temperatura constante de -3 ° C.
   4. Prepare la cámara de recolección de rodajas con insertos para colocar las rodajas de tejido y la solución de corte, burbujeándola constantemente con gas carbógeno a temperatura ambiente (RT).
   5. En el laboratorio de cultivo celular y bajo una campana ventilada, coloque los insertos de cultivo en una placa de 6 pocillos usando fórceps. Añadir 5 mL de medio hACtx en la parte inferior del inserto hasta que entre en contacto con la membrana, evitando la formación de burbujas, y añadir 2 mL en la parte superior del inserto. Equilibrar en la incubadora a 37 °C y 5% de_CO2 durante al menos 2 h antes de transferir las rodajas de tejido a los insertos.
3. Procedimientos de recolección y corte de tejidos
   1. Inmediatamente después de la resección, recoja el tejido del paciente en la sala de operaciones, si es posible, directamente en un recipiente con solución de corte congelada, burbujeada y triturada. Transfiera el recipiente cerrado en hielo inmediatamente al área de corte del laboratorio.
   2. Inspeccionar el tejido y localizar la mejor superficie para pegarlo (ver paso 1.3.3) a la etapa de corte del vibratomo, teniendo en cuenta la orientación de las capas corticales. Si es necesario, corte la superficie irregular con un bisturí para que sea fácil colocar el tejido en el escenario para una orientación óptima del corte.
   3. Pegue el tejido a la plataforma con adhesivo tisular (consulte la Tabla de materiales), colóquelo en la cámara de corte e inmediatamente llene la cámara con una solución de corte con burbujas frías. Continúe el burbujeo durante todo el procedimiento de corte.
   4. Corte cortes coronales o sagitales, dependiendo de la orientación del tejido a la cuchilla, a un espesor de 300 μm para contener todas las capas corticales y, si es posible, la sustancia blanca. Coloque las rodajas en la cámara de recolección con solución de corte burbujeante en RT.
      NOTA: Corte desde el lado de la sustancia blanca hacia la superficie de la corteza. No retire las meninges, ya que esto puede dañar el tejido. La cuchilla de corte generalmente los corta fácilmente.
   5. Una vez que se haya cortado todo el tejido, transfiera las rodajas a una placa de Petri estéril con solución de enjuague en RT y transpórtelas al laboratorio de cultivo celular. Este paso es necesario para eliminar el exceso de sacarosa de las rodajas antes de transferirlas a la placa de cultivo.
      NOTA: Para transferir las rodajas (en este y los siguientes pasos), use una pipeta de vidrio invertido, rompa la parte más delgada y coloque una tetina de goma para succionar.
4. Cultivo y mantenimiento de cortes de tejido hACtx
   1. Coloque individualmente las rodajas de tejido sobre los insertos ya húmedos y sumergidos. Después de 24 h, cambie el medio para eliminar aún más cualquier resto de sacarosa u otras sustancias residuales de los procedimientos de corte.
   2. Reemplace el medio de cultivo con medio fresco cada 7 días. Después de 2 semanas, use hACtx medium sin gentamicina. El cultivo se puede mantener hasta por 2 meses.
      NOTA: Equilibrar el medio hACtx en la incubadora a 37 °C y 5% de_CO2 durante al menos 2 h antes de que el medio cambie. El medio fresco debe prepararse cada 2 semanas. Revise las rodajas cada 2-3 días y, si parte del medio se ha evaporado, agregue más a la parte superior del inserto.

Solución de corte	Concentración de existencias	Concentración final [mM]	Por 1 L
Sacarosa	Polvo	200	68,46 g
NaHCO3	Polvo	21	1,76 g
Kcl	Polvo	3	0,22 g
NaH2PO4	Polvo	1.25	0,17 g
Glucosa	Polvo	10	1,80 g
MgSO4	1 M	2	2 ml
CaCl2	1 M	1.6	1,6 ml
MgCl2	2 M	2	1 ml

Tabla 1: Composición de la solución de corte. MgCl 2 y CaCl₂ se utilizan como soluciones prepreparadas de 1 M en agua desionizada.

Solución de enjuague	Concentración de existencias	Concentración final	Por 100 ml
HBSS	1x		95 ml
PenStrep	10.000 U/ml	500 U/ml	5 ml
HEPES	Polvo	4,76 g/L	476 mg
Glucosa	Polvo	2 g/L	200.6 mg

Tabla 2: Composición de la solución de aclarado.

Medio hACtx	Concentración de existencias	Concentración final	Por 100 ml
Medio neuronal sin rojo fenol			97.4 ml	ver Tabla de Materiales
B27	50x	1:50	2 ml
L-Glutamina	100x	1:200	500 μL	ver Tabla de Materiales
Gentamicina	50 mg/ml	1:1000	100 μL

Tabla 3: Composición del medio hACtx.

2. Proliferación y diferenciación de células lt-NES

NOTA: Las células Lt-NES se generan como se describió anteriormente^21,22 y se transducen con un vector lentiviral que transporta proteína fluorescente verde (GFP) bajo un promotor constitutivo (células GFP-lt-NES). Los viales que contienen 3 x 10⁶ células se almacenan a -150 °C hasta su uso.

1. Preparación de las soluciones y medios de stock
   1. Diluir 100 μg de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en 10 ml de PBS-0,1% de BSA para tener una concentración madre de 10 μg/ml. Preparar alícuotas de 100 μL.
   2. Diluir 100 μg de factor de crecimiento epidérmico (EGF) en 10 ml de PBS-0,1% de BSA para tener una concentración madre de 10 μg/ml. Preparar alícuotas de 100 μL.
   3. Suplemento alícuota 50x B27 en un volumen de 100 μL por alícuota.
   4. Diluir 10 mg de poli-L-ornitina en 100 ml de agua desionizada para tener una concentración madre de 100 μg/ml. Hacer 1 ml de alícuotas.
   5. Preparar 30 μL de alícuotas de laminina de ratón de 1,20 mg/ml.
   6. Diluir 10 ml de tripsina-EDTA (0,25%) en 90 ml de PBS hasta una concentración madre de 0,025%. Preparar 1 ml de alícuotas.
   7. Diluir 0,025 g de inhibidor de tripsina en 50 ml de PBS hasta una concentración madre de 0,5 mg/ml. Preparar 1 ml de alícuotas.
   8. Diluir 10 μg de Wnt3a (miembro de la familia 3A del sitio de integración MMTV tipo sin alas) en 1 ml de PBS-0.1% BSA para tener una concentración de stock de 10 μg / ml. Prepare BMP4 (proteína morfogenética ósea 4) de la misma manera. Alícuota en un volumen de 100 μL.
   9. Diluir 1 mg de ciclopamina en 2,5 ml de DMSO hasta una concentración final de 400 μg/ml, y hacer 100 μL de alícuotas.
   10. Preparar el medio básico (Tabla 4) y el medio definido por diferenciación (DDM, Tabla 5), y almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
2. Recubrimiento de platos de cultivo
   1. Para pre-cubrir los platos para cultivar las células GFP-It-NES durante la proliferación o diferenciación, diluir poli-L-ornitina 1:100 en agua desionizada y añadir 5 ml de la solución a un matraz T25. Incubar durante la noche en RT.
   2. Lave las placas recubiertas de poli-L-ornitina 1x con agua desionizada y 1x con PBS.
   3. Para las células GFP-It-NES en proliferación, diluir la laminina de ratón a 1:500 en PBS e incubar durante al menos 2 h a 37 °C. Para las células GFP-It-NES en diferenciación, diluir la laminina de ratón a 1:100 en PBS e incubar durante al menos 2 h a 37 °C.
3. Proliferación de las células GFP-lt-NES
   1. Calentar 5 ml (para lavar) y 5 ml (para sembrar) de medio básico en dos tubos diferentes de 15 ml.
   2. Descongelar rápidamente un vial de células GFP-lt-NES a 37 °C, transferirlas al tubo de lavado y centrifugar a 300 x g durante 5 min.
   3. Aspirar el medio con cuidado sin tocar el pellet, y resuspender las células en 1 mL de medio básico precalentado. Transfiera la suspensión celular al tubo de siembra que contiene medio básico suplementado con factores de proliferación: EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) y B27 (10 ng/mL). Sembrar las células en un matraz T25 recubierto de poli-L-ornitina/laminina.
   4. Alimente las células con factores de proliferación todos los días. Reemplace el medio si se vuelve amarillo. Paso de las células cada tercer o cuarto día (1 día después de que alcancen el 100% de confluencia).
4. División de las células GFP-lt-NES para su proliferación y diferenciación
   1. Precaliente 5 ml de medio básico por matraz (para recoger las células), más el volumen total necesario para volver a sembrarlas.
      NOTA: El paso se realiza en una dilución 1:3 para mantener las células en proliferación, requiriendo 15 mL de medio básico, y una dilución 1:6 para iniciar la diferenciación, requiriendo 30 mL de medio básico.
   2. Retirar el medio del matraz de cultivo celular por aspiración y añadir 500 μL de tripsina al 0,025% precalentada. Incubar durante 5-10 min en RT. El desprendimiento de las células se puede confirmar bajo un microscopio óptico estándar con un aumento de 10x.
   3. Añadir un volumen igual de inhibidor de tripsina (0,5 mg/ml de concentración final) seguido de 5 ml de medio básico caliente. Separa y recoge las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Transfiera las células a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
   4. Para mantener las células en proliferación, repúltelas a una dilución 1:3 en medio básico fresco complementado con factores de proliferación, y repite el paso 2.3.4.
5. Diferenciación cortical de las células GFP-lt-NES
   1. El día 0, resuspender las células (que se utilizarán para la diferenciación) en 30 ml de medio básico suplementado con factores de proliferación, y colocarlas en seis matraces T25 recubiertos de diferenciación (divididos 1:6).
   2. El día 1, cambie la mitad del medio a DDM y agregue factores de proliferación a la mitad de su concentración.
   3. En el día 2, cambie completamente el medio a DDM suplementado con factores de diferenciación: BMP4 (10 ng / ml), Wnt3a (10 ng / ml) y ciclopamina (400 ng / ml).
   4. En el día 4, agregue solo los factores de diferenciación. Reemplace el medio si se vuelve amarillo.
   5. El día 6, cambie el medio a DDM suplementado con BMP4 y Wnt3a. La ciclopamina se elimina en este paso.
   6. El día 7, separe las celdas como se indica en los pasos 2.4.2 y 2.4.3.

Medio Básico	Concentración de existencias	Concentración final	Por 100 ml
DMEM/F12 con L-Glutamina	1x		98.7 mL
Suplemento N-2	100x	1:100	1 ml
Glucosa	45%	3.5 mL/L	350 μL

Tabla 4: Composición del medio de proliferación de células lt-NES (medio básico).

Medio DDM	Concentración de existencias	Concentración final	Por 100 ml
DMEM/F12 con L-Glutamina			96 ml
N2	100 x	1:100	1 ml
NEAA	100 x	1:100	1 ml
Piruvato de sodio	100 mM	1:100	1 ml
BSA V Fracción	7.5%	6,6 ml/l	660 μL
2-mercaptoetanol	50 nM	7 μL/L	0,7 μL
Glucosa	45%	3.2 mL/L	320 μL

Tabla 5: Composición del medio definido por diferenciación (DDM) de las células lt-NES.

3. Trasplante de las células GFP-lt-NES en rodajas organotípicas de hACtx

NOTA: El tejido hACtx debe cultivarse durante 1 semana antes del trasplante de células. Para facilitar el procedimiento de trasplante, es necesario extraer 2 ml del medio hACtx de la parte superior del inserto para evitar que el tejido flote.

1. Resuspender las células GFP-lt-NES preparadas corticalmente (a partir del paso 2.5.6) en una matriz de membrana basal pura fría (ver la Tabla de materiales) a una concentración de 1 x 10⁵ células/μL y transferir la solución a un tubo estéril más pequeño.
   NOTA: Durante el procedimiento de trasplante, todos los materiales (puntas de pipeta, tubos, capilar, etc.) deben enfriarse previamente para evitar la solidificación del gel. Descongele el gel de la matriz de membrana basal en hielo durante 30 minutos antes de su uso.
2. Recoja la suspensión celular en un capilar de vidrio frío conectado a una tetina de goma para succionar. Inyecte la suspensión celular como pequeñas gotas (aprox. 1 μL cada una) apuñalando el corte de tejido semiseco en varios sitios.
3. Incubar a 37 °C durante 30 minutos para que el gel se solidifique. Transfiera la placa de la incubadora a la campana y agregue cuidadosamente 2 ml de medio hACtx a la parte superior del inserto para sumergir completamente el tejido.
4. Reemplace el medio de cultivo con medio hACtx fresco una vez por semana.

4. Validación

1. Tinción de las rodajas hACtx
   1. En el momento deseado, saque las rodajas del laboratorio de cultivo celular y retírelas del inserto sumergiéndolas en una placa de Petri con PBS. A continuación, transfiera las rodajas a los viales de tinción utilizando una pipeta de vidrio invertido (véase la NOTA en el paso 1.3.5) y fíjelas con paraformaldehído al 4% (PFA) durante la noche a 4 °C.
   2. Enjuagar 3 veces con KPBS durante 15 min cada vez e incubar durante la noche a 4 °C con solución de permeabilización (0,02% BSA y 1% Triton X-100 en KPBS).
   3. Al día siguiente, añadir solución de bloqueo (KPBS con Triton X-100 al 0,2%, BSA al 1%, azida sódica [1:10.000] y suero de burro normal al 10%), e incubar durante la noche a 4 °C.
   4. Después del bloqueo, añadir los anticuerpos primarios (ver Tabla 6 para las diluciones) diluidos en la solución de bloqueo, e incubar durante 48 h a 4 °C.
   5. Lave 3 veces con solución bloqueante sin agregar suero durante 15 minutos cada una. Añadir los anticuerpos secundarios diluidos en solución bloqueante (ver Tabla 6 para las diluciones) e incubar durante 48 h a 4 °C.
   6. Lavar 3 veces con solución bloqueante sin suero, e incubar durante 2 h en RT en tinción Hoechst diluida en solución de permeabilización (1:1.000).
   7. Lave 3x con KPBS, monte las rodajas en portaobjetos de vidrio con un pincel y déjelas secar. Finalmente, enjuague los portaobjetos con agua desionizada, elimine el exceso de agua, agregue el medio de montaje y cubra con un cubreobjetos de vidrio. Conservar los portaobjetos durante al menos 24 h a RT y conservarlos a 4 °C hasta obtener imágenes.
      NOTA: Para el marcado de anticuerpos con epítopos nucleares, realizar la recuperación de antígenos antes de la permeabilización (paso 4.1.2) con citrato de sodio (10 mM, pH 6,0) durante 2 h a 65 °C.
2. Placa-pinza de célula entera
   1. El día de la grabación, prepare 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial humano (haCSF), modificado para que coincida mejor con el entorno del cerebro humano (Tabla 7). Similar a la solución de corte, hacer aproximadamente 900 ml de la solución con todos los ingredientes excepto CaCl 2 disuelto en agua desionizada, y burbujear con carbogen durante 15 minutos antes de agregar el volumen apropiado de solución de CaCl₂ 1 M. Llene el matraz volumétrico hasta la marca de 1 L y continúe burbujeando en RT durante 15 minutos adicionales antes de comenzar la grabación y durante todo el experimento.
   2. Transfiera los cortes de tejido de la placa de cultivo a la cámara de registro en la etapa de un microscopio vertical que se perfunde constantemente con haCSF burbujeante a una velocidad de perfusión de 2 ml / min y se calienta a 34 ° C utilizando un controlador de temperatura de baño.
   3. Tire de los capilares de vidrio con un extractor de pipeta a una resistencia promedio de 3-5 MΩ, y rellene los capilares con una solución interna a base de K-gluconato (Tabla 8) con 2-4 mg de biocitina recién agregados para la identificación post-hoc de las células registradas. El pH y la osmolaridad de esta solución interna son 7.2-7.3 y 285-295 mOsm, respectivamente.
   4. En el caso de la grabación de la célula huésped, obtenga una visión general aproximada de la rebanada con un objetivo 4x y encuentre una celda de aspecto saludable para parchear con un objetivo 40x. Luego, proceda con la abrazadera de parche estándar de celda completa.
   5. En el caso de la grabación de células injertadas, identifique el área de tejido con las células injertadas utilizando un objetivo 4x y un filtro de epifluorescencia en el rango azul (460 nm) mediante la expresión del reportero GFP en el injerto. Luego, acérquese al área ubicada con un objetivo de 40x y encuentre una célula injertada que exprese GFP para una pinza de parche de células enteras estándar.
   6. Verifique el potencial de membrana en reposo (RMP) inmediatamente después de entrar en la celda y asegúrese de que la calidad de la grabación sea buena. Registre todos los parámetros de interés (por ejemplo, resistencia de la membrana [Ri], parámetros AP, corrientes de sodio y potasio y actividad sináptica) en la configuración de voltaje de celda completa o pinza de corriente.
   7. Después de recopilar todos los datos necesarios, retraiga cuidadosamente la pipeta de registro sin dañar aún más la célula para que pueda identificarse con inmunotinción post-hoc.
   8. Transfiera la rebanada a la solución de PFA al 4% para su posterior fijación y tinción, como se describe en el paso 4.1. La estreptavidina se utiliza para inmunomarcar las células llenas de biocitina durante las grabaciones.

ANTICUERPOS	Dilución	Notas
Primario
Pollo anti-GFP	1:1000
Pollo anti-MAP2	1:1000
Cabra anti-AiF1	1:100
Ratón anti-MBP	1:1000	Se necesita recuperación de antígenos
Ratón anti-SC123	1:2000
Conejo anti-NeuN	1:1000
Conejo anti-Olig2	1:500
Conejo anti-Tmem119	1:200
Secundario
AffinityPure Donkey anti-ratón IgG conjugado con 488	1:500
488-conjugado AffinityPure Donkey anti-conejo IgG	1:500
488-conjugado AffinityPure Donkey anti-pollo IgG	1:500
Cy3-conjugado AffinityPure Donkey anti-pollo IgG	1:500
Cy3-conjugado AffinityPure Donkey anti-cabra IgG	1:500
Cy3-conjugado AffinityPure Donkey anti-ratón IgG	1:500
Estreptavidina conjugada con Alexa fluor 647	1:500

Tabla 6: Lista de anticuerpos primarios y secundarios para inmunohistoquímica.

haCSF	Concentración de existencias	Concentración final [mM]	Por 1 L
NaCl	Polvo	129	7,54 g
NaHCO3	Polvo	21	1,76 g
Glucosa	Polvo	10	1,80 g
Kcl	Polvo	3	0,22 g
NaH2PO4	Polvo	1.25	0,17 g
MgSO4	1 M	2	2 ml
CaCl2	1 M	1.6	1,6 ml

Tabla 7: Composición del líquido cefalorraquídeo artificial (haCSF).

Solución interna de K-gluconato	Concentración de existencias	Concentración final [mM]	Por 100 ml
K-gluconato	Polvo	122.5	2,87 g
Kcl	Polvo	12.5	93,18 mg
NaCl	Polvo	8	46,76 mg
HEPES	Polvo	10	238,32 mg
MgATP	Polvo	2	101.4 mg
Na3GTP	Polvo	0.3	17.0 mg
Nota: Ajuste el pH con KOH/HCl

Tabla 8: Composición de la solución interna a base de K-gluconato.

Resultados

Siguiendo el protocolo descrito, se recolectó y procesó tejido hACtx de un paciente con epilepsia del lóbulo temporal, como se explicó anteriormente. Se fijaron unas rodajas después de 24 h en cultivo para estudiar el punto de partida del tejido huésped. El análisis de diferentes poblaciones de células neuronales como neuronas (que expresan NeuN y Map2, Figura 1A), oligodendrocitos (Olig2 y MBP, Figura 1B) y astrocitos (GFAP específico para humanos, también llamado STEM123, Figura 1C

Discusión

La obtención de cortes hACtx de calidad suficiente es el paso más crítico en este protocolo. El tejido cortical se obtiene de pacientes epilépticos sometidos a cirugía resectiva²⁴. La calidad del tejido resecado, así como el tiempo de exposición del tejido entre la resección y el cultivo, es crítica; Cuanto más rápido se transfiera el tejido de la sala de cirugía al laboratorio y se corte, más óptimo será el cultivo organotípico. Idealmente, el tejido debe cortars...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Bath temperature controller	Luigs & Neumann	TC0511354
Calcium Chloride dihydrate	Merck	102382
Carbogen gas	Air Liquide	NA
Cooler	Julaba FL 300	9661012.03
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Double Patch-Clamp amplifier	HEKA electronic	EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt	Millipore	371701
HEPES	AppliChem	A1069
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Patchmaster	HEKA electronic	Patchmaster 2x91
Pipette Puller	Sutter	P-2000
Plastic Petri dish	Any suitable
Potassium chloride	Merck	104936
Potassium D-gluconate	ThermoFisher	B25135
Rubber teat + glass pipette	Any suitable
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue	Loctite	2062278
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Vibratome	Leica	VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)	ThermoFisher Scientific	14175095
HEPES	AppliChem	A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys without Phenol Red	StemCell technologies	#05791	Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forceps	Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Animal Free Recombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glucose solution (45%)	Sigma	G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Supplement (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poly-L-Ornithine	Merk	P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein	R&D Systems	5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterile deionized water	MilliQ		MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL	Eppendorf	Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuge	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Sterile tubes	Sarstedt	Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm	VWR	612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL	Biotix VWR	Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Various
T25 flasks Nunc	ThermoFisher Scientific	156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoReserach	711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin	Jackson ImmunoReserach	016-600-084
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoReserach	001-000-162
Chicken anti-GFP	Merk Millipore	AB16901
Chicken anti-MAP2	Abcam	ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG	Jackson ImmunoReserach	705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)	Sigma Aldrich	D27802	Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)	Biorad	AHP2024
Hoechst 33342	Molecular Probes		Nuclear staining
Mouse anti-MBP	BioLegend	808402
Mouse anti-SC123	Stem Cells Inc	AB-123-U-050
Normal Donkey Serum	Merk Millipore	S30-100
Paint brush	Any suitable
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
Distilled water
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)	Merk Millipore	104873
Potassium phospate dibasic (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S3014
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab104225
Rabbit anti-Olig2	Abcam	ab109186
Rabbit anti-TMEM119	Abcam	ab185333
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-5G
Sodium citrate
Distilled water
Tri-Sodium Citrate	Sigma Aldrich	S1804-500G
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	327371000
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope	Zeiss	LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm	VWR	630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm	Marienfeld	107242
Microscope Software	Zeiss	ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable