İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri

Özet

Bu protokol, yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonu ile birlikte tanımlamakta ve insan nörodejeneratif bozuklukları için kök hücre bazlı tedavileri daha fazla test etmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır.

Özet

Nörodejeneratif bozukluklar, semptomları ve hücresel etkileri açısından yaygın ve heterojendir, bu da insan hastalıklarını tamamen taklit eden uygun hayvan modellerinin bulunmaması ve ölüm sonrası insan beyin dokusunun zayıf mevcudiyeti nedeniyle çalışmalarını karmaşık hale getirmektedir. Yetişkin insan sinir dokusu kültürü, nörolojik bozuklukların farklı yönlerini inceleme imkanı sunar. Moleküler, hücresel ve biyokimyasal mekanizmalar bu sistemde kolayca ele alınabilir, ayrıca ilaçları veya hücre bazlı tedaviler gibi farklı tedavileri test edebilir ve doğrulayabilir. Bu yöntem, rezeksiyonel cerrahi geçiren epileptik hastalardan elde edilen yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini ve indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonunu birleştirir. Bu yöntem, hücre sağkalımı, nöronal farklılaşma, sinaptik girdi ve çıkışların oluşumu ve bozulmamış yetişkin insan kortikal dokusuna transplantasyondan sonra insan kaynaklı hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerinin incelenmesine izin verecektir. Bu yaklaşım, temel araştırmayı farklı nörolojik bozuklukları olan hastalar için kök hücre tabanlı tedavilerin klinik çevirisine yaklaştıracak ve hasarlı sinir devrelerini yeniden yapılandırmak için yeni araçların geliştirilmesine izin verecek bir 3D insan hastalığı modelleme platformunun geliştirilmesinden önce önemli bir adımdır.

Giriş

Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı veya iskemik inme gibi nörodejeneratif bozukluklar, nöronal fonksiyon bozukluğu veya ölümün ortak özelliğini paylaşan bir grup hastalıktır. Etkilenen beyin bölgesi ve nöronal popülasyon açısından heterojendirler. Ne yazık ki, bu hastalıkların tedavileri, insan beyninde meydana gelenleri taklit eden hayvan modellerinin eksikliği nedeniyle kıttır veya sınırlı etkinliğe sahiptir ^1,2. Kök hücre tedavisi, beyin yenilenmesi için en umut verici stratejilerden biridir³. Farklı kaynaklardan gelen kök hücrelerden nöronal progenitörlerin üretimi son yıllarda büyük ölçüde gelişmiştir ^4,5. Son yayınlar, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücre kaynaklı uzun süreli kendini yenileyen nöroepitel benzeri kök (lt-NES) hücrelerinin, kortikal bir farklılaşma protokolünü takiben ve somatosensoriyel korteksi etkileyen iskemik inme ile bir sıçan modelinde intrakortikal transplantasyondan sonra, olgun kortikal nöronlar ürettiğini göstermiştir. Ek olarak, greft kaynaklı nöronlar, konakçı nöronlardan afferent ve efferent sinaptik bağlantılar aldı ve sıçan nöronal ağına entegrasyonlarını gösterdi ^6,7. Greft kaynaklı aksonlar miyelinize edildi ve peri-enfarkt alanı, korpus kallozum ve kontralateral somatosensoriyel korteks dahil olmak üzere sıçan beyninin farklı bölgelerinde bulundu. En önemlisi, iPS hücre kaynaklı transplantasyon, inme hayvanlarında motor açıklarını tersine çevirdi⁷.

Hayvan modelleri, nakil sağkalımını, nöronal entegrasyonu ve aşılanmış hücrelerin motor ve bilişsel işlevler üzerindeki etkisini incelemeye yardımcı olsa bile, insan hücreleri (greft-konakçı) arasındaki etkileşim hakkında bilgi bu sistemde eksiktir ^8,9. Bu nedenle, uzun süreli insan beyni organotipik kültürünün, insan iPS hücresi kaynaklı nöronal progenitörlerin ex vivo transplantasyonu ile kombine bir yöntemi burada tanımlanmıştır. Nöroşirürji rezeksiyonlarından elde edilen insan beyni organotipik kültürleri, araştırmacıların insan merkezi sinir sistemi devresi ve insan beyin bozuklukları için tedavileri test etmenin en doğru yolu hakkındaki anlayışlarını arttırmalarını sağlayan fizyolojik olarak ilgili 3D beyin modelleridir. Bununla birlikte, bu bağlamda yeterli araştırma yapılmamıştır ve çoğu durumda, insan hipokampal beyin organotipik kültürleri kullanılmıştır^10,11. Serebral korteks, iskemik inme¹² veya Alzheimer hastalığı¹³ gibi çeşitli nörodejeneratif bozukluklardan etkilenir, bu nedenle bilgimizi genişletmemize ve farklı terapötik stratejileri test etmemize ve doğrulamamıza izin veren bir insan kortikal 3D sistemine sahip olmak önemlidir. Son birkaç yılda yapılan birçok çalışma, insan beyin hastalıklarını modellemek için yetişkin insan kortikal (hACtx) dokusundan kültürleri kullanmıştır 14,15,16,17,18,19; ancak kök hücre tedavisi bağlamında sınırlı bilgi mevcuttur. İki çalışma, burada açıklanan sistemin fizibilitesini zaten göstermiştir. 2018 yılında, farklı transkripsiyon faktörleriyle programlanan ve hACtx dokusuna nakledilen insan embriyonik kök hücrelerinin, yetişkin insan kortikal ağlarına entegre olabilen olgun kortikal nöronlara yol açtığı gösterilmiştir²⁰. 2020 yılında, lt-NES hücrelerinin insan organotipik sistemine transplantasyonu, fonksiyonel nöronların elektrofizyolojik özellikleri ile olgun, tabakaya özgü kortikal nöronlara farklılaşma kapasitelerini ortaya koydu. Aşılanmış nöronlar, kuduz virüsü retrograd monosinaptik izleme, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları ve immüno-elektron mikroskobu²¹ ile doğrulandığı gibi, yetişkin beyin dilimlerindeki insan kortikal nöronları ile hem afferent hem de efferent sinaptik temaslar kurdu.

Protokol

Bu protokol, Lund, İsveç Bölgesel Etik Komitesi tarafından onaylanan yönergeleri izler (etik izin numarası 2021-07006-01). Temporal lob epilepsisi nedeniyle elektif cerrahi uygulanan hastalardan sağlıklı neokortikal doku elde edildi. Tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.

NOT: Elde edilen tüm dokular boyutlarına bakılmaksızın işlenmiştir. Bununla birlikte, 1-1.5^mm3'ten daha küçük dokuların bir vibratomla işlenmesi ve kesilmesi teknik olarak zor olacaktır.

1. Doku toplama, bakım, kesme ve kaplama

1. Doku dilimlemeden önceki gün hazırlıklar
   1. Volumetrik bir şişede 2 L kesme çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. MgCl 2 ve CaCl₂ dışındaki tüm bileşenleri ~ 1.800 mL deiyonize suda çözün ve 15 dakika boyunca karbojen gazı ile kabarcık haline getirin. Daha sonra uygun miktarlarda 1 M MgCl 2 ve CaCl₂ çözeltileri ekleyin ve 15 dakika daha köpürmeye devam edin. Son olarak, şişeyi 2 L işaretine doldurun; pH ve ozmolariteyi kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Hazırlanan çözeltinin 2 x 350 mL'sini dondurun ve geri kalanını 4 ° C'de saklayın.
      NOT: pH ve ozmolarite sırasıyla sırasıyla 7.3-7.4 ve 295-300 mOsm'dur.
   2. 100 mL durulama çözeltisi hazırlayın (Tablo 2). 476 mg HEPES ve 200.6 mg glikozu, 5 mL penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 100 mL HBSS'de çözün. Bu, 4 ° C'de 10 güne kadar saklanabilir.
   3. İnsan yetişkin kortikal (hACtx) kültür ortamını (hACtx ortamı) (Tablo 3) hazırlayın ve havalandırmalı bir başlık altında hücre kültürü laboratuvarında filtreleyin. Ortam, fenol kırmızısı içermeyen nöronal ortamdan (Malzeme Tablosuna bakınız), B27 takviyesi, L-glutamin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gentamisin'den oluşur. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
2. Doku örneklerinin gelmesinden önce operasyon günü hazırlıklar
   1. Gerekli ekipmanın ve laboratuar alanının kullanılabilirliğini kontrol edin ve tüm cerrahi aletleri ve vibratomu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve tezgah üstü alanı, damıtılmış suyla (deterjansız) ve ardından% 70 etanol ile iyice temizleyin. Alet ve ekipmanı kullanmadan önce etanolün en az 30 dakika kurumasını bekleyin.
   2. Dondurulmuş kesme çözeltisini ezin ve buz ve sıvı "çorbasını" 30 dakika boyunca karbojen gazı ile kabartın. Ardından, kaplardan birini ezilmiş çözelti "çorba" ile sıkıca kapatın ve buz kutusuna yerleştirin. Bu, dokuyu ameliyathaneden toplamak için kullanılacaktır.
   3. Vibratomu kalibre edin ve kesme parametrelerini ayarlayın: 0,05 mm / s hız ve 1,7 mm titreşim. Kesme odasını bir vibratom aşamasına yerleştirin ve ona bağlı soğutucuyu çalıştırın, böylece oda -3 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta olur.
   4. Doku dilimlerini ve kesme solüsyonunu yerleştirmek için dilim toplama odasını kesici uçlarla hazırlayın, oda sıcaklığında (RT) karbojen gazı ile sürekli köpürtün.
   5. Hücre kültürü laboratuvarında ve havalandırmalı bir davlumbazın altında, kültür eklerini forseps kullanarak 6 delikli bir plakaya yerleştirin. Kesici ucun altına, membranla temas edene kadar 5 mL hACtx ortamı ekleyerek kabarcık oluşumunu önleyin ve kesici ucun üstüne 2 mL ekleyin. Doku dilimlerini eklere aktarmadan önce inkübatörde 37 °C ve %5 CO 2'de en az 2 saat dengeleyin.
3. Doku toplama ve dilimleme işlemleri
   1. Rezeksiyondan hemen sonra, mümkünse hastadan dokuyu doğrudan dondurulmuş, kabarcıklı ve ezilmiş kesme çözeltisi içeren bir kaba toplayın. Kapalı kabı buz üzerinde hemen laboratuvarın kesme alanına aktarın.
   2. Dokuyu inceleyin ve kortikal tabakaların yönünü göz önünde bulundurarak vibratomun kesme aşamasına yapıştırmak için en iyi yüzeyi bulun (bkz. adım 1.3.3). Gerekirse, düz olmayan yüzeyi bir neşterle kesin, böylece en uygun dilim oryantasyonu için dokuyu sahneye yerleştirmek kolaydır.
   3. Dokuyu doku yapıştırıcısı ile sahneye yapıştırın ( Malzeme Tablosuna bakınız), dilimleme odasına yerleştirin ve odayı hemen soğuk kabarcıklı kesme çözeltisi ile doldurun. Tüm kesme prosedürü boyunca köpürmeye devam edin.
   4. Koronal veya sagital dilimleri, dokudan bıçağa yönelime bağlı olarak, tüm kortikal tabakaları ve mümkünse beyaz maddeyi içerecek şekilde 300 μm kalınlığında kesin. Dilimleri RT'de köpüren kesme çözeltisi ile toplama odasına yerleştirin.
      NOT: Beyaz madde tarafından korteksin yüzeyine doğru kesin. Meninksleri çıkarmayın, çünkü bu dokuya zarar verebilir. Kesme bıçağı genellikle kolayca dilimler.
   5. Tüm doku kesildikten sonra, dilimleri RT'de durulama çözeltisi ile steril bir Petri kabına aktarın ve hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. Bu adım, fazla sakarozu kültür plakasına aktarmadan önce dilimlerden çıkarmak için gereklidir.
      NOT: Dilimleri aktarmak için (bu ve sonraki adımlarda), ters çevrilmiş bir cam pipet kullanın, daha ince kısmı kesin ve emme için kauçuk bir meme ucu yerleştirin.
4. hACtx doku dilimlerinin kültürü ve bakımı
   1. Doku dilimlerini ayrı ayrı ıslak ve batık eklerin üzerine yerleştirin. 24 saat sonra, kalan sakkaroz veya diğer artık maddeleri kesme prosedürlerinden daha fazla çıkarmak için ortamı değiştirin.
   2. Kültür ortamını her 7 günde bir taze ortamla değiştirin. 2 hafta sonra, gentamisinsiz hACtx ortamı kullanın. Kültür 2 aya kadar korunabilir.
      NOT: İnkübatördeki hACtx ortamını 37 °C'de ve %5 CO 2'de ortam değişiminden önce en az₂ saat dengeleyin. Her 2 haftada bir taze ortam hazırlanmalıdır. Dilimleri her 2-3 günde bir kontrol edin ve ortamın bir kısmı buharlaşmışsa, kesici ucun üstüne daha fazlasını ekleyin.

Kesme çözümü	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon [mM]	1 L başına
Sakaroz	Toz	200	68.46 gr
NaHCO3	Toz	21	1.76 gr
Kartal	Toz	3	0.22 gr
NaH2PO4	Toz	1.25	0.17 gr
Glikoz	Toz	10	1.80 gr
MgSO4	1 milyon	2	2 mL
CaCl2	1 milyon	1.6	1,6 mL
MgCl2	2 milyon	2	1 mL

Tablo 1: Kesme çözeltisinin bileşimi. MgCl 2 ve CaCl₂, deiyonize suda önceden hazırlanmış 1 M çözeltileri olarak kullanılır.

Durulama çözeltisi	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon	100 mL başına
HBSS	1 adet		95 mL
PenStrep	10.000 U/mL	500 U/mL	5 mL
HEPES	Toz	4,76 gr/l	476 mg
Glikoz	Toz	2 g/L	200,6 mg

Tablo 2: Durulama çözeltisinin bileşimi.

hACtx ortam	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon	100 mL başına
Fenol kırmızısı olmayan nöronal ortam			97,4 mL	Bkz. Malzeme Tablosu
B27 Serisi	50x	1:50	2 mL
L-Glutamin	100x	1:200	500 μL	Bkz. Malzeme Tablosu
Gentamisin	50 mg/mL	1:1000	100 μL

Tablo 3: hACtx ortamının bileşimi.

2. lt-NES hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması

NOT: Lt-NES hücreleri daha önce tarif edildiği gibi^21,22 üretilir ve kurucu bir promotör (GFP-lt-NES hücreleri) altında yeşil floresan protein (GFP) taşıyan bir lentiviral vektör ile dönüştürülür. 3 x 10⁶ hücre içeren şişeler kullanıma kadar -150 ° C'de saklanır.

1. Stok çözeltilerinin ve ortamın hazırlanması
   1. 10 mL PBS-%0.1 BSA'da 100 μg bazik fibroblast büyüme faktörünü (bFGF) 10 μg/mL stok konsantrasyonuna sahip olacak şekilde seyreltin. 100 μL aliquots hazırlayın.
   2. 10 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 10 mL PBS-0.1% BSA'da 100 μg epidermal büyüme faktörünü (EGF) seyreltin. 100 μL aliquots hazırlayın.
   3. Aliquot başına 100 μL hacimde Aliquot 50x B27 takviyesi.
   4. 100 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 100 mL deiyonize suda 10 mg poli-L-ornitin seyreltin. 1 mL aliquots yapın.
   5. 1.20 mg/mL fare laminininden 30 μL alikot hazırlayın.
   6. 90 mL PBS'de 10 mL tripsin-EDTA (%0,25) %0,025'lik bir stok konsantrasyonuna seyreltin. 1 mL aliquots hazırlayın.
   7. 0.025 g tripsin inhibitörünü 50 mL PBS'de 0.5 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna seyreltin. 1 mL aliquots hazırlayın.
   8. 10 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 1 mL PBS-0.1% BSA'da 10 μg Wnt3a (Kanatsız tip MMTV entegrasyon sitesi aile üyesi 3A) seyreltin. BMP4'ü (kemik morfogenetik protein 4) aynı şekilde hazırlayın. 100 μL'lik bir hacimde Aliquot.
   9. 2.5 mL DMSO'da 1 mg siklopamini 400 μg / mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin ve 100 μL alikotlar yapın.
   10. Temel ortamı (Tablo 4) ve farklılaşma tanımlı ortamı (DDM, Tablo 5) hazırlayın ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
2. Kültür tabaklarının kaplanması
   1. Proliferasyon veya farklılaşma sırasında GFP-It-NES hücrelerini kültürlemek için bulaşıkları önceden kaplamak için, poli-L-ornitin 1:100'ü deiyonize suda seyreltin ve bir T25 şişesine 5 mL çözelti ekleyin. RT'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
   2. Poli-L-ornitin kaplı plakaları 1x deiyonize su ile ve 1x PBS ile yıkayın.
   3. Proliferasyondaki GFP-It-NES hücreleri için, fare lamininini PBS'de 1:500'de seyreltin ve 37 ° C'de en az 2 saat inkübe edin. Farklılaşmadaki GFP-It-NES hücreleri için, fare lamininini PBS'de 1:100'de seyreltin ve 37 ° C'de en az 2 saat inkübe edin.
3. GFP-lt-NES hücrelerinin çoğalması
   1. İki farklı 15 mL tüpte 5 mL (yıkama için) ve 5 mL (tohumlama için) temel ortamın sıcak olması.
   2. Bir şişe GFP-lt-NES hücresini 37 ° C'de hızla çözün, yıkama tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
   3. Pelet dokunmadan ortamı dikkatlice aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış bazik ortamın 1 mL'sinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu, proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş temel ortamı içeren tohumlama tüpüne aktarın: EGF (10 ng / mL), bFGF (10 ng / mL) ve B27 (10 ng / mL). Hücreleri poli-L-ornitin / laminin kaplı T25 şişe üzerine tohumlayın.
   4. Hücreleri her gün proliferasyon faktörleri ile besleyin. Sararırsa ortamı değiştirin. Hücreleri her üç veya dördüncü günde bir geçirin (% 100 akıcılığa ulaştıktan 1 gün sonra).
4. GFP-lt-NES hücrelerinin proliferasyon ve farklılaşma için bölünmesi
   1. Şişe başına 5 mL temel ortamın önceden ısıtılması (hücreleri toplamak için), artı onları yeniden tohumlamak için gereken toplam hacim.
      NOT: Geçiş, hücreleri proliferasyonda tutmak için 15 mL bazik ortam gerektiren 1: 3 seyreltmede ve farklılaşmayı başlatmak için 30 mL bazik ortam gerektiren 1: 6 seyreltmede yapılır.
   2. Ortamı hücre kültürü şişesinden aspirasyonla çıkarın ve 500 μL önceden ısıtılmış% 0.025 tripsin ekleyin. RT'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücrelerin ayrılması, 10x büyütmede standart bir ışık mikroskobu altında doğrulanabilir.
   3. Eşit miktarda tripsin inhibitörü (0.5 mg / mL nihai konsantrasyon) ve ardından 5 mL ılık bazik ortam ekleyin. Hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın ve toplayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   4. Hücreleri proliferasyonda tutmak için, proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş taze bazik ortamda 1: 3 seyreltmede yeniden plakalayın ve adım 2.3.4'ü tekrarlayın.
5. GFP-lt-NES hücrelerinin kortikal farklılaşması
   1. 0. günde, hücreleri (farklılaşma için kullanılmak üzere) proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş 30 mL temel ortamda yeniden askıya alın ve altı farklılaşma kaplı T25 şişesinde (bölünmüş 1: 6) plakalayın.
   2. 1. günde, ortamın yarısını DDM'ye değiştirin ve konsantrasyonlarının yarısına proliferasyon faktörleri ekleyin.
   3. 2. günde, ortamı tamamen farklılaşma faktörleriyle desteklenen DDM'ye değiştirin: BMP4 (10 ng / mL), Wnt3a (10 ng / mL) ve siklopamin (400 ng / mL).
   4. 4. günde, yalnızca farklılaşma faktörlerini ekleyin. Sararırsa ortamı değiştirin.
   5. 6. günde, ortamı BMP4 ve Wnt3a ile desteklenmiş DDM olarak değiştirin. Ansiklopamin bu adımda kaldırılır.
   6. 7. günde, hücreleri adım 2.4.2 ve adım 2.4.3'te belirtildiği gibi ayırın.

Temel Orta	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon	100 mL başına
DMEM/F12 L-Glutamin ile	1 adet		98,7 milyon L
N-2 takviyesi	100x	1:100	1 mL
Glikoz	45%	3,5 mL/B	350 μL

Tablo 4: lt-NES hücrelerinin proliferasyon ortamının bileşimi (bazik ortam).

DDM ortamı	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon	100 mL başına
DMEM/F12 L-Glutamin ile			96 mL
N2	100 x	1:100	1 mL
cesaret	100 x	1:100	1 mL
Sodyum Piruvat	100 mM	1:100	1 mL
BSA V Fraksiyonu	7.5%	6,6 mL/B	660 μL
2-merkaptoetanol	50 nM	7 μL/L	0,7 μL
Glikoz	45%	3,2 mL/B	320 μL

Tablo 5: lt-NES hücrelerinin farklılaşma tanımlı ortamının (DDM) bileşimi.

3. GFP-lt-NES hücrelerinin organotipik hACtx dilimlerine nakli

NOT: hACtx dokusu, hücre naklinden 1 hafta önce kültüre alınmalıdır. Transplantasyon prosedürünü kolaylaştırmak için, dokunun kaymasını önlemek için hACtx ortamının 2 mL'sini kesici ucun üstünden çıkarmak gerekir.

1. Kortikal olarak astarlanmış GFP-lt-NES hücrelerini (adım 2.5.6'dan itibaren) soğuk saf bazal membran matrisinde ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 x 10⁵ hücre / μL konsantrasyonunda yeniden askıya alın ve çözeltiyi daha küçük bir steril tüpe aktarın.
   NOT: Transplantasyon prosedürü sırasında, jel katılaşmasını önlemek için tüm malzemeler (pipet uçları, tüpler, kılcal damarlar vb.) önceden soğutulmalıdır. Bodrum membran matris jelini kullanmadan önce 30 dakika boyunca buz üzerinde çözün.
2. Hücre süspansiyonunu, emme için kauçuk bir meme ucuna bağlı soğuk bir cam kılcal damara toplayın. Yarı kuru doku dilimini çeşitli bölgelerde bıçaklayarak hücre süspansiyonunu küçük damlalar halinde (her biri yaklaşık 1 μL) enjekte edin.
3. Jelin katılaşması için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Plakayı inkübatörden kaputa geri aktarın ve dokuyu tamamen suya batırmak için kesici ucun üstüne dikkatlice 2 mL hACtx ortamı ekleyin.
4. Kültür ortamını haftada bir kez taze hACtx ortamıyla değiştirin.

4. Doğrulama

1. hACtx dilimlerinin boyanması
   1. İstenilen zaman noktasında, dilimleri hücre kültürü laboratuvarından çıkarın ve PBS ile bir Petri kabına batırarak ekinden çıkarın. Ardından, ters çevrilmiş bir cam pipet kullanarak dilimleri boyama şişelerine aktarın (adım 1.3.5'teki Not'a bakın) ve bunları 4 ° C'de gece boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
   2. KPBS ile her seferinde 15 dakika boyunca 3 kat durulayın ve geçirgenleştirme çözeltisi (KPBS'de% 0.02 BSA ve% 1 Triton X-100) ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
   3. Ertesi gün, bloke edici çözelti (% 0.2 Triton X-100,% 1 BSA, sodyum azid [1: 10.000] ve% 10 normal eşek serumu içeren KPBS) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   4. Bloke ettikten sonra, blokaj çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorları (seyreltmeler için Tablo 6'ya bakınız) ekleyin ve 4 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
   5. Her biri 15 dakika boyunca serum eklemeden 3x'i bloke edici çözelti ile yıkayın. Bloke edici çözeltide seyreltilmiş ikincil antikorları ekleyin (seyreltmeler için Tablo 6'ya bakınız) ve 4 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
   6. Serumsuz bloke edici çözelti ile 3x yıkayın ve geçirgenlik çözeltisinde seyreltilmiş Hoechst lekesinde RT'de 2 saat inkübe edin (1:1.000).
   7. KPBS ile 3x yıkayın, dilimleri bir boya fırçası kullanarak cam slaytlara monte edin ve kurumaya bırakın. Son olarak, slaytları deiyonize suyla durulayın, fazla suyu çıkarın, montaj ortamını ekleyin ve bir cam kapak kayması ile örtün. Slaytları RT'de en az 24 saat saklayın ve görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Nükleer epitopları etiketleyen antikorlar için, 65 °C'de 2 saat boyunca sodyum sitrat (10 mM, pH 6.0) ile geçirgenleşmeden önce (adım 4.1.2) antijen alımı gerçekleştirin.
2. Tüm hücre yama kelepçesi
   1. Kayıt gününde, insan beyni ortamına daha iyi uyacak şekilde modifiye edilmiş 1 L insan yapay beyin omurilik sıvısı (haCSF) hazırlayın (Tablo 7). Kesme çözeltisine benzer şekilde, deiyonize suda çözünmüş CaCl 2 dışındaki tüm bileşenlerle yaklaşık 900 mL çözelti yapın ve uygun hacimde 1 M CaCl₂ çözeltisi eklemeden önce 15 dakika boyunca karbojenle kabartın. Volumetrik şişeyi 1 L işaretine kadar doldurun ve kayda başlamadan önce ve deney boyunca RT'de 15 dakika daha köpürmeye devam edin.
   2. Doku dilimlerini kültür plakasından 2 mL/dak perfüzyon hızında kabarcıklı haCSF ile sürekli perfüze edilen ve bir banyo sıcaklığı kontrol cihazı kullanılarak 34 °C'ye ısıtılan dik bir mikroskop sahnesindeki kayıt odasına aktarın.
   3. Cam kılcal damarları pipet çektirme ile ortalama 3-5 MΩ dirence çekin ve kılcal damarları, kaydedilen hücrelerin post-hoc tanımlanması için yeni eklenmiş 2-4 mg biyositin ile K-glukonat bazlı iç çözelti (Tablo 8) ile doldurun. Bu iç çözeltinin pH ve ozmolaritesi sırasıyla 7.2-7.3 ve 285-295 mOsm'dur.
   4. Konakçı hücre kaydı durumunda, 4x hedefli dilime kabaca genel bir bakış elde edin ve 40x hedefiyle yama yapmak için sağlıklı görünümlü bir hücre bulun. Ardından, standart tüm hücre yama kelepçesi ile devam edin.
   5. Aşılanmış hücre kaydı durumunda, greftteki GFP muhabir ekspresyonu ile 4x objektif ve mavi aralıkta (460 nm) bir epifloresan filtre kullanarak aşılanmış hücrelerle doku alanını tanımlayın. Ardından, 40x hedefi ile bulunan alana yakınlaştırın ve standart bir tüm hücre yama kelepçesi için GFP'yi eksprese eden aşılanmış bir hücre bulun.
   6. Hücreye girdikten hemen sonra dinlenme membranı potansiyelini (RMP) kontrol edin ve kaydın kalitesinin iyi olduğundan emin olun. İlgilenilen tüm parametreleri (örneğin, membran direnci [Ri], AP parametreleri, sodyum ve potasyum akımları ve sinaptik aktivite) tüm hücre voltajına veya akım kelepçesi konfigürasyonuna kaydedin.
   7. Gerekli tüm verileri topladıktan sonra, kayıt pipetini hücreye daha fazla zarar vermeden dikkatlice geri çekin, böylece post-hoc immün boyama ile tanımlanabilir.
   8. Adım 4.1'de açıklandığı gibi daha fazla sabitleme ve boyama için dilimi% 4 PFA çözeltisine aktarın. Streptavidin, kayıtlar sırasında biyositin ile doldurulmuş hücreleri immünoetiketlemek için kullanılır.

ANTİKOR	Seyreltme	Notlar
Birincil
Tavuk anti-GFP	1:1000
Tavuk anti-MAP2	1:1000
Keçi anti-AiF1	1:100
Fare anti-MBP	1:1000	Antijen alımı gerekli
Fare anti-SC123	1:2000
Tavşan anti-NeuN	1:1000
Tavşan anti-Olig2	1:500
Tavşan anti-Tmem119	1:200
İkincil
488-konjuge AffinitySaf Eşek anti-fare IgG	1:500
488-konjuge AffinitySaf Eşek tavşan karşıtı IgG	1:500
488-konjuge AffinitySaf Eşek anti-tavuk IgG	1:500
Cy3-konjuge AffinitySaf Eşek anti-tavuk IgG	1:500
Cy3-konjuge AffinitySaf Eşek anti-keçi IgG	1:500
Cy3-konjuge AffinitySaf Eşek anti-fare IgG	1:500
Alexa flor 647-konjuge Streptavidin	1:500

Tablo 6: İmmünohistokimya için primer ve sekonder antikorların listesi.

haCSF	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon [mM]	1 L başına
Arjantin	Toz	129	7.54 gr
NaHCO3	Toz	21	1.76 gr
Glikoz	Toz	10	1.80 gr
Kartal	Toz	3	0.22 gr
NaH2PO4	Toz	1.25	0.17 gr
MgSO4	1 milyon	2	2 mL
CaCl2	1 milyon	1.6	1,6 mL

Tablo 7: Suni beyin omurilik sıvısının (haCSF) bileşimi.

K-Glukonat iç çözeltisi	Stok konsantrasyonu	Son konsantrasyon [mM]	100 mL başına
K-glukonat	Toz	122.5	2.87 gr
Kartal	Toz	12.5	93.18 mg
Arjantin	Toz	8	46,76 mg
HEPES	Toz	10	238,32 mg
MgATP	Toz	2	101.4 mg
Na3GTP	Toz	0.3	17,0 mg
Not: KOH/HCl ile pH'ı ayarlayın

Tablo 8: K-glukonat bazlı iç çözeltinin bileşimi.

Sonuçlar

Tarif edilen protokolü takiben, temporal lob epilepsisi olan bir hastadan hACtx dokusu yukarıda açıklandığı gibi toplandı ve işlendi. Konakçı dokunun başlangıç noktasını incelemek için kültürde 24 saat sonra birkaç dilim sabitlendi. Nöronlar (NeuN ve Map2, Şekil 1A'yı ifade eden), oligodendrositler (Olig2 ve MBP, Şekil 1B) ve astrositler (insana özgü GFAP, ayrıca STEM123, Şekil 1C olarak da adlandırılı...

Tartışmalar

Yeterince yüksek kalitede hACtx dilimleri elde etmek, bu protokoldeki en kritik adımdır. Rezeksiyon cerrahisi uygulanan epileptik hastalardan kortikal doku elde edilir²⁴. Rezeke edilen dokunun kalitesi ve rezeksiyon ile kültür arasındaki dokunun maruz kalma süresi kritiktir; doku ameliyathaneden laboratuvara ne kadar hızlı aktarılır ve kesilirse, organotipik kültür o kadar optimal olur. İdeal olarak, doku kesilmeli ve toplandıktan sonraki ilk birkaç saat içinde h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Bath temperature controller	Luigs & Neumann	TC0511354
Calcium Chloride dihydrate	Merck	102382
Carbogen gas	Air Liquide	NA
Cooler	Julaba FL 300	9661012.03
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Double Patch-Clamp amplifier	HEKA electronic	EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt	Millipore	371701
HEPES	AppliChem	A1069
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Patchmaster	HEKA electronic	Patchmaster 2x91
Pipette Puller	Sutter	P-2000
Plastic Petri dish	Any suitable
Potassium chloride	Merck	104936
Potassium D-gluconate	ThermoFisher	B25135
Rubber teat + glass pipette	Any suitable
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue	Loctite	2062278
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Vibratome	Leica	VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)	ThermoFisher Scientific	14175095
HEPES	AppliChem	A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys without Phenol Red	StemCell technologies	#05791	Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forceps	Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Animal Free Recombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glucose solution (45%)	Sigma	G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Supplement (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poly-L-Ornithine	Merk	P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein	R&D Systems	5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterile deionized water	MilliQ		MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL	Eppendorf	Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuge	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Sterile tubes	Sarstedt	Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm	VWR	612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL	Biotix VWR	Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Various
T25 flasks Nunc	ThermoFisher Scientific	156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoReserach	711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin	Jackson ImmunoReserach	016-600-084
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoReserach	001-000-162
Chicken anti-GFP	Merk Millipore	AB16901
Chicken anti-MAP2	Abcam	ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG	Jackson ImmunoReserach	705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)	Sigma Aldrich	D27802	Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)	Biorad	AHP2024
Hoechst 33342	Molecular Probes		Nuclear staining
Mouse anti-MBP	BioLegend	808402
Mouse anti-SC123	Stem Cells Inc	AB-123-U-050
Normal Donkey Serum	Merk Millipore	S30-100
Paint brush	Any suitable
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
Distilled water
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)	Merk Millipore	104873
Potassium phospate dibasic (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S3014
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab104225
Rabbit anti-Olig2	Abcam	ab109186
Rabbit anti-TMEM119	Abcam	ab185333
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-5G
Sodium citrate
Distilled water
Tri-Sodium Citrate	Sigma Aldrich	S1804-500G
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	327371000
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope	Zeiss	LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm	VWR	630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm	Marienfeld	107242
Microscope Software	Zeiss	ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable