Culturas organotípicas do córtex humano adulto como modelo ex vivo para transplante e validação de células-tronco humanas

Resumo

Este protocolo descreve culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto combinadas com transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas, que apresentam uma nova metodologia para testar ainda mais terapias baseadas em células-tronco para distúrbios neurodegenerativos humanos.

Resumo

Os distúrbios neurodegenerativos são comuns e heterogêneos em termos de sintomas e afetação celular, tornando seu estudo complicado devido à falta de modelos animais adequados que imitam totalmente as doenças humanas e a baixa disponibilidade de tecido cerebral humano post-mortem. A cultura de tecido nervoso humano adulto oferece a possibilidade de estudar diferentes aspectos de distúrbios neurológicos. Mecanismos moleculares, celulares e bioquímicos poderiam ser facilmente abordados neste sistema, bem como testar e validar drogas ou diferentes tratamentos, como terapias baseadas em células. Este método combina culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto, obtidas de pacientes epilépticos submetidos a cirurgia ressectiva, e transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Este método permitirá o estudo da sobrevivência celular, diferenciação neuronal, a formação de entradas e saídas sinápticas e as propriedades eletrofisiológicas de células derivadas de humanos após o transplante em tecido cortical humano adulto intacto. Essa abordagem é um passo importante antes do desenvolvimento de uma plataforma de modelagem de doenças humanas 3D que aproximará a pesquisa básica da tradução clínica de terapias baseadas em células-tronco para pacientes com diferentes distúrbios neurológicos e permitirá o desenvolvimento de novas ferramentas para a reconstrução de circuitos neurais danificados.

Introdução

Distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer ou o acidente vascular cerebral isquêmico, são um grupo de doenças que compartilham a característica comum de mau funcionamento neuronal ou morte. Eles são heterogêneos em termos de área do cérebro e população neuronal afetada. Infelizmente, os tratamentos para essas doenças são escassos ou de eficácia limitada devido à falta de modelos animais que imitem o que ocorre no cérebro humano ^1,2. A terapia com células-tronco é uma das estratégias mais promissoras para a regeneração cerebral³. A geração de progenitores neuronais a partir de células-tronco de diferentes fontes tem sido muito desenvolvida nos últimos anos ^4,5. Publicações recentes mostraram que células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS) derivadas de células neuroepiteliais auto-renovadoras a longo prazo (lt-NES), seguindo um protocolo de diferenciação cortical e após transplante intracortical em um modelo de rato com acidente vascular cerebral isquêmico afetando o córtex somatossensorial, geram neurônios corticais maduros. Além disso, os neurônios derivados do enxerto receberam conexões sinápticas aferentes e eferentes dos neurônios hospedeiros, mostrando sua integração na rede neuronal de ratos ^6,7. Os axônios derivados do enxerto foram mielinizados e encontrados em diferentes áreas do cérebro de ratos, incluindo a área peri-infarto, corpo caloso e córtex somatossensorial contralateral. Mais importante ainda, o transplante derivado de células iPS reverteu déficits motores em animais com AVC⁷.

Mesmo que os modelos animais ajudem a estudar a sobrevivência do transplante, a integração neuronal e o efeito das células enxertadas nas funções motoras e cognitivas, faltam informações sobre a interação entre as células humanas (enxerto-hospedeiro) nesse sistema ^8,9. Por esta razão, um método combinado de cultura organotípica do cérebro humano a longo prazo com o transplante ex vivo de progenitores neuronais derivados de células iPS humanas é descrito aqui. As culturas organotípicas do cérebro humano obtidas a partir de ressecções neurocirúrgicas são modelos 3D fisiologicamente relevantes do cérebro que permitem aos pesquisadores aumentar sua compreensão dos circuitos do sistema nervoso central humano e a maneira mais precisa de testar tratamentos para distúrbios cerebrais humanos. No entanto, não foram realizadas pesquisas suficientes nesse contexto e, na maioria dos casos, culturas organotípicas cerebrais do hipocampo humano têm sido utilizadas^10,11. O córtex cerebral é afetado por diversos distúrbios neurodegenerativos, como o AVC isquêmico¹² ou a doença de Alzheimer¹³, por isso é importante ter um sistema 3D cortical humano que nos permita expandir nossos conhecimentos e testar e validar diferentes estratégias terapêuticas. Vários estudos nos últimos anos têm utilizado culturas de tecido cortical humano adulto (hACtx) para modelar doenças cerebrais humanas 14,15,16,17,18,19; no entanto, informações limitadas estão disponíveis no contexto da terapia com células-tronco. Dois estudos já demonstraram a viabilidade do sistema aqui descrito. Em 2018, células-tronco embrionárias humanas programadas com diferentes fatores de transcrição e transplantadas para o tecido hACtx demonstraram dar origem a neurônios corticais maduros que poderiam se integrar em redes corticais humanas adultas²⁰. Em 2020, o transplante de células lt-NES para o sistema organotípico humano revelou sua capacidade de se diferenciar em neurônios corticais maduros e específicos de camadas com as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios funcionais. Os neurônios enxertados estabeleceram contatos sinápticos aferentes e eferentes com os neurônios corticais humanos nas fatias cerebrais adultas, corroborado pelo rastreamento monossináptico retrógrado do vírus da raiva, registros de patch-clamp de células inteiras e microscopia imunoeletrônica²¹.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes aprovadas pelo Comitê Regional de Ética, Lund, Suécia (número de permissão ética 2021-07006-01). Tecido neocortical saudável foi obtido de pacientes submetidos a cirurgia eletiva para epilepsia do lobo temporal. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.

NOTA: Todos os tecidos obtidos foram processados independentemente do seu tamanho. No entanto, tecidos menores que 1-1,5 mm³ de tamanho serão tecnicamente difíceis de manusear e seccionar com um vibratome.

1. Coleta, manutenção, corte e chapeamento de tecidos

1. Preparações no dia anterior ao corte de tecidos
   1. Preparar 2 L de solução de corte (quadro 1) num balão aferido. Dissolva todos os ingredientes, exceto MgCl 2 e CaCl₂, em ~1.800 mL de água deionizada e borbulhe com gás carbógeno por 15 min. Em seguida, adicione quantidades adequadas de 1 M de soluções de MgCl 2 e CaCl₂ e continue borbulhando por mais 15 min. Por último, encher o balão até à marca de 2 L; verificar o pH e a osmolaridade e ajustar, se necessário. Congelar 2 x 350 ml da solução preparada e conservar o resto a 4 °C.
      NOTA: O pH e a osmolaridade são tipicamente 7,3-7,4 e 295-300 mOsm, respectivamente.
   2. Preparar 100 mL de solução de enxágue (Tabela 2). Dissolver 476 mg de HEPES e 200,6 mg de glicose em 100 mL de HBSS suplementados com 5 mL de penicilina/estreptomicina. Este pode ser armazenado a 4 °C durante até 10 dias.
   3. Preparar o meio de cultura cortical adulto humano (hACtx) (meio hACtx) (Tabela 3) e filtrá-lo no laboratório de cultura celular sob um exaustor ventilado. O meio compreende meio neuronal sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais), suplemento de B27, L-glutamina (ver Tabela de Materiais) e gentamicina. Conservar a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
2. Preparações no dia da operação antes da chegada das amostras de tecido
   1. Verifique a disponibilidade do equipamento necessário e do espaço de laboratório, e limpe minuciosamente todas as ferramentas cirúrgicas e o vibratome (ver Tabela de Materiais), bem como o espaço de bancada, com água destilada (sem detergente), seguido de etanol a 70%. Deixe o etanol secar por pelo menos 30 min antes de usar as ferramentas e equipamentos.
   2. Esmague a solução de corte congelada e borbulhe a "sopa" de gelo e líquido com gás carbógeno por 30 min. Em seguida, feche bem um dos recipientes com a solução triturada ''sopa'' e coloque-a na caixa de gelo. Isso será usado para coletar o tecido da sala de operação.
   3. Calibre o vibratome e defina os parâmetros de corte: velocidade de 0,05 mm/s e vibração de 1,7 mm. Coloque a câmara de corte em um estágio de vibratome e inicie o resfriador conectado a ela de modo que a câmara esteja a uma temperatura constante de -3 °C.
   4. Prepare a câmara de coleta de fatias com inserções para colocar as fatias de tecido e a solução de corte, borbulhando-a constantemente com gás carbógeno à temperatura ambiente (RT).
   5. No laboratório de cultura celular e sob um exaustor ventilado, coloque as inserções de cultura em uma placa de 6 poços usando pinça. Adicione 5 mL de meio hACtx na parte inferior da pastilha até entrar em contato com a membrana, evitando a formação de bolhas, e adicione 2 mL na parte superior da pastilha. Equilibrar-se na incubadora a 37 °C e 5% de CO 2 durante, pelo menos,₂ h antes de transferir as fatias de tecido para as pastilhas.
3. Procedimentos de coleta e fatiamento de tecidos
   1. Imediatamente após a ressecção, colete o tecido do paciente na sala de cirurgia, se possível, diretamente em um recipiente com solução de corte congelada, borbulhada e esmagada. Transfira o recipiente fechado no gelo imediatamente para a área de corte do laboratório.
   2. Inspecionar o tecido e localizar a melhor superfície para colá-lo (ver passo 1.3.3) até à fase de corte do vibratome, tendo em conta a orientação das camadas corticais. Se necessário, corte a superfície irregular com um bisturi para que seja fácil colocar o tecido no palco para uma orientação ideal da fatia.
   3. Cole o tecido ao palco com adesivo de tecido (consulte a Tabela de Materiais), coloque-o na câmara de corte e encha imediatamente a câmara com solução de corte borbulhada a frio. Continue o borbulhar durante todo o processo de corte.
   4. Corte fatias coronais ou sagitais, dependendo da orientação tecido-lâmina, a uma espessura de 300 μm para conter todas as camadas corticais e, se possível, a substância branca. Coloque as fatias na câmara de coleta com solução de corte borbulhante no RT.
      NOTA: Corte do lado da substância branca em direção à superfície do córtex. Não remova as meninges, pois isso pode danificar o tecido. A lâmina de corte geralmente corta através deles facilmente.
   5. Uma vez que todo o tecido tenha sido cortado, transfira as fatias para uma placa de Petri estéril com solução de enxágue no RT e transporte-as para o laboratório de cultura celular. Este passo é necessário para remover o excesso de sacarose das fatias antes de transferi-las para a placa de cultura.
      NOTA: Para transferir as fatias (nesta e nas etapas seguintes), use uma pipeta de vidro invertida, quebre a parte mais fina e coloque uma tetina de borracha para sucção.
4. Cultura e manutenção de fatias de tecido hACtx
   1. Coloque individualmente as fatias de tecido em cima das inserções já molhadas e submersas. Após 24 h, mudar o meio para remover ainda mais a sacarose remanescente ou outras substâncias residuais dos procedimentos de corte.
   2. Substitua o meio de cultura por meio fresco a cada 7 dias. Após 2 semanas, use hACtx meio sem gentamicina. A cultura pode ser mantida por até 2 meses.
      NOTA: Equilibrar o meio hACtx na incubadora a 37 °C e 5% de CO 2 durante, pelo menos,₂ h antes da mudança do meio. O meio fresco deve ser preparado a cada 2 semanas. Verifique as fatias a cada 2-3 dias e, se algum do meio tiver evaporado, adicione mais ao topo da pastilha.

Solução de corte	Concentração de existências	Concentração final [mM]	Por 1 L
Sacarose	Pó	200	68,46 gr
NaHCO3	Pó	21	1,76 gr
Kcl	Pó	3	0,22 gr
NaH2PO4	Pó	1.25	0,17 gr
Glicose	Pó	10	1,80 gr
MgSO4	1 milh	2	2 mL
CaCl2	1 milh	1.6	1,6 mL
MgCl2	2 milh	2	1 mL

Tabela 1: Composição da solução de corte. MgCl 2 e CaCl₂ são usados como soluções pré-preparadas de 1 M em água deionizada.

Solução de enxágue	Concentração de existências	Concentração final	Por 100 mL
HBSS	1x		95 mL
PenStrep	10.000 U/mL	500 U/mL	5 mL
HEPES	Pó	4,76 g/L	magnésio 476
Glicose	Pó	2 g/L	200,6 mg

Tabela 2: Composição da solução de enxágue.

hACtx médio	Concentração de existências	Concentração final	Por 100 mL
Meio neuronal sem vermelho de fenol			97,4 mL	ver Tabela de Materiais
B27	50x	1:50	2 mL
L-Glutamina	100x	1:200	500 μL	ver Tabela de Materiais
Gentamicina	50 mg/mL	1:1000	100 μL

Tabela 3: Composição do meio hACtx.

2. Proliferação e diferenciação de células lt-NES

NOTA: As células Lt-NES são geradas como descrito anteriormente^21,22 e transduzidas com um vetor lentiviral que transporta proteína fluorescente verde (GFP) sob um promotor constitutivo (células GFP-lt-NES). Os frascos para injetáveis contendo 3 x 10⁶ células são armazenados a -150 °C até à sua utilização.

1. Preparação das soluções de estoque e meios
   1. Diluir 100 μg de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em 10 mL de PBS-0,1% BSA para ter uma concentração de estoque de 10 μg/mL. Preparar alíquotas de 100 μL.
   2. Diluir 100 μg de fator de crescimento epidérmico (EGF) em 10 mL de PBS-0,1% BSA para ter uma concentração estoque de 10 μg/mL. Preparar alíquotas de 100 μL.
   3. Aliquota 50x B27 suplemento num volume de 100 μL por alíquota.
   4. Diluir 10 mg de poli-L-ornitina em 100 mL de água deionizada para ter uma concentração de estoque de 100 μg/mL. Faça alíquotas de 1 mL.
   5. Preparar alíquotas de 30 μL de 1,20 mg/ml de laminina de rato.
   6. Diluir 10 mL de tripsina-EDTA (0,25%) em 90 mL de PBS até uma concentração de estoque de 0,025%. Prepare alíquotas de 1 mL.
   7. Diluir 0,025 g de inibidor de tripsina em 50 ml de PBS até uma concentração de reserva de 0,5 mg/ml. Prepare alíquotas de 1 mL.
   8. Diluir 10 μg de Wnt3a (membro da família 3A do local de integração MMTV do tipo Wingless) em 1 mL de PBS-0,1% BSA para ter uma concentração de estoque de 10 μg/mL. Prepare BMP4 (proteína morfogenética óssea 4) da mesma maneira. Alíquota num volume de 100 μL.
   9. Diluir 1 mg de ciclopamina em 2,5 mL de DMSO até uma concentração final de 400 μg/mL e fazer alíquotas de 100 μL.
   10. Preparar o meio básico (Tabela 4) e o meio definido por diferenciação (DDM, Tabela 5) e armazenar a 4 °C por até 2 semanas.
2. Revestimento de pratos de cultura
   1. Para pré-revestir as placas para cultura das células GFP-It-NES durante a proliferação ou diferenciação, diluir a poli-L-ornitina 1:100 em água deionizada e adicionar 5 mL da solução a um frasco de T25. Incubar durante a noite no RT.
   2. Lave as placas revestidas de poli-L-ornitina 1x com água deionizada e 1x com PBS.
   3. Para as células GFP-It-NES em proliferação, diluir a laminina do rato a 1:500 em PBS e incubar durante, pelo menos, 2 h a 37 °C. Para as células GFP-It-NES em diferenciação, diluir a laminina do rato a 1:100 em PBS e incubar durante, pelo menos, 2 h a 37 °C.
3. Proliferação das células GFP-lt-NES
   1. Aqueça 5 mL (para lavagem) e 5 mL (para semeadura) de meio básico em dois tubos diferentes de 15 mL.
   2. Descongelar rapidamente um frasco para injetáveis de células GFP-lt-NES a 37 °C, transferi-las para o tubo de lavagem e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
   3. Aspirar o meio cuidadosamente sem tocar no pellet, e ressuspender as células em 1 mL de meio básico pré-aquecido. Transfira a suspensão celular para o tubo de semeadura contendo meio básico suplementado com fatores de proliferação: EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) e B27 (10 ng/mL). Semeia as células num balão T25 revestido de poli-L-ornitina/laminina.
   4. Alimente as células com fatores de proliferação todos os dias. Substitua o meio se ele ficar amarelo. Passagem das células a cada três ou quatro dias (1 dia depois de atingirem 100% de confluência).
4. Divisão das células GFP-lt-NES para proliferação e diferenciação
   1. Pré-aqueça 5 mL de meio básico por frasco (para coletar as células), mais o volume total necessário para resemeá-las.
      NOTA: A passagem é feita em uma diluição de 1:3 para manter as células em proliferação, necessitando de 15 mL de meio básico, e uma diluição de 1:6 para iniciar a diferenciação, necessitando de 30 mL de meio básico.
   2. Retirar o meio do balão de cultura celular por aspiração e adicionar 500 μL de tripsina pré-aquecida a 0,025%. Incubar por 5-10 min em RT. O descolamento das células pode ser confirmado sob um microscópio de luz padrão com ampliação de 10x.
   3. Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina (concentração final de 0,5 mg/mL) seguido de 5 mL de meio básico quente. Desprenda e colete as células pipetando suavemente para cima e para baixo. Transfira as células para um tubo de 15 mL e centrifugar por 5 min a 300 x g.
   4. Para manter as células em proliferação, repor a uma diluição de 1:3 em meio básico fresco suplementado com factores de proliferação e repetir o passo 2.3.4.
5. Diferenciação cortical das células GFP-lt-NES
   1. No dia 0, ressuspender as células (a serem usadas para diferenciação) em 30 mL de meio básico suplementado com fatores de proliferação e plaqueá-las em seis frascos T25 revestidos por diferenciação (split 1:6).
   2. No dia 1, mude metade do meio para DDM e adicione fatores de proliferação à metade de sua concentração.
   3. No dia 2, mude completamente o meio para DDM suplementado com fatores de diferenciação: BMP4 (10 ng/mL), Wnt3a (10 ng/mL) e ciclopamina (400 ng/mL).
   4. No dia 4, adicione apenas os fatores de diferenciação. Substitua o meio se ele ficar amarelo.
   5. No dia 6, mude o meio para DDM suplementado com BMP4 e Wnt3a. A ciclopamina é removida nesta etapa.
   6. No dia 7, retire as células conforme indicado nas etapas 2.4.2 e 2.4.3.

Meio Básico	Concentração de existências	Concentração final	Por 100 mL
DMEM/F12 com L-Glutamina	1x		98,7 mL
Suplemento de N-2	100x	1:100	1 mL
Glicose	45%	3,5 mL/L	350 μL

Tabela 4: Composição do meio de proliferação das células lt-NES (meio básico).

Meio DDM	Concentração de existências	Concentração final	Por 100 mL
DMEM/F12 com L-Glutamina			96 mL
N2	100 x	1:100	1 mL
NEAA	100 x	1:100	1 mL
Piruvato de sódio	100 mM	1:100	1 mL
Fração BSA V	7.5%	6,6 mL/L	660 μL
2-mercaptoetanol	50 nM	7 μL/L	0,7 μL
Glicose	45%	3,2 mL/L	320 μL

Tabela 5: Composição do meio definido por diferenciação (DDM) de células lt-NES.

3. Transplante das células GFP-lt-NES em fatias organotípicas de hACtx

NOTA: O tecido hACtx deve ser cultivado durante 1 semana antes do transplante celular. Para facilitar o procedimento de transplante, é necessário remover 2 mL do meio hACtx da parte superior da inserção para evitar que o tecido flutue.

1. Ressuspender as células GFP-lt-NES corticicamente preparadas (a partir da etapa 2.5.6) em matriz de membrana basal pura a frio (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 1 x 10⁵ células/μL e transferir a solução para um tubo estéril mais pequeno.
   NOTA: Durante o procedimento de transplante, todos os materiais (pontas da pipeta, tubos, capilares, etc.) devem ser pré-resfriados para evitar a solidificação do gel. Descongele o gel da matriz da membrana basal no gelo por 30 minutos antes de seu uso.
2. Recolher a suspensão celular num capilar de vidro frio ligado a uma tetina de borracha para sucção. Injete a suspensão celular como pequenas gotas (aprox. 1 μL cada) esfaqueando a fatia de tecido semi-seco em vários locais.
3. Incubar a 37 °C durante 30 min para que o gel se solidifique. Transfira a placa da incubadora de volta para o exaustor e adicione cuidadosamente 2 mL de meio hACtx ao topo da inserção para submergir completamente o tecido.
4. Substitua o meio de cultura por um meio hACtx fresco uma vez por semana.

4. Validação

1. Coloração das fatias hACtx
   1. No ponto de tempo desejado, retire as fatias do laboratório de cultura celular e remova-as da pastilha, imergindo-a em uma placa de Petri com PBS. Em seguida, transferir as fatias para vitrais utilizando uma pipeta de vidro invertido (ver a NOTA no passo 1.3.5) e fixá-las com paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite a 4 °C.
   2. Enxaguar 3x com KPBS por 15 min de cada vez e incubar durante a noite a 4 °C com solução de permeabilização (BSA a 0,02% e Triton X-100 a 1% em KPBS).
   3. No dia seguinte, adicionar solução bloqueadora (KPBS com Triton X-100 a 0,2%, BSA a 1%, azida de sódio [1:10.000] e soro de burro normal a 10%) e incubar durante a noite a 4 °C.
   4. Após o bloqueio, adicionar os anticorpos primários (ver Tabela 6 para as diluições) diluídos na solução de bloqueio e incubar durante 48 h a 4 °C.
   5. Lave 3x com solução de bloqueio sem adicionar soro por 15 min cada. Adicionar os anticorpos secundários diluídos em solução bloqueadora (ver Tabela 6 para as diluições) e incubar durante 48 h a 4 °C.
   6. Lavar 3x com solução de bloqueio sem soro e incubar durante 2 h a RT na coloração Hoechst diluída em solução de permeabilização (1:1.000).
   7. Lave 3x com KPBS, monte as fatias em lâminas de vidro usando um pincel e deixe-as secar. Finalmente, lave as lâminas com água deionizada, remova o excesso de água, adicione o meio de montagem e cubra com uma tampa de vidro. Mantenha as lâminas por pelo menos 24 horas no RT e guarde-as a 4 °C até a geração de imagens.
      NOTA: Para anticorpos que marcam epítopos nucleares, realizar a recuperação de antígenos antes da permeabilização (etapa 4.1.2) com citrato de sódio (10 mM, pH 6,0) por 2 h a 65 °C.
2. Braçadeira de patch de célula inteira
   1. No dia da gravação, preparar 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial humano (haCSF), modificado para melhor corresponder ao ambiente cerebral humano (Tabela 7). Semelhante à solução de corte, faça aproximadamente 900 mL da solução com todos os ingredientes, exceto CaCl 2 dissolvido em água deionizada, e borbulhe com carbogênio por 15 min antes de adicionar o volume apropriado de 1 M de solução de CaCl₂. Encher o balão volumétrico até à marca de 1 L e continuar a borbulhar no RT durante mais 15 minutos antes de iniciar a gravação e durante toda a experiência.
   2. Transfira as fatias de tecido da placa de cultura para a câmara de gravação no palco de um microscópio vertical que é constantemente perfundido com haCSF borbulhado a uma taxa de perfusão de 2 mL/min e aquecido a 34 °C usando um controlador de temperatura de banho.
   3. Puxe os capilares de vidro com um extrator de pipeta para uma resistência média de 3-5 MΩ e encha os capilares com solução interna à base de K-gluconato (Tabela 8) com um recém-adicionado 2-4 mg de biocitina para a identificação post-hoc das células registradas. O pH e a osmolaridade desta solução interna são 7,2-7,3 e 285-295 mOsm, respectivamente.
   4. No caso da gravação de células hospedeiras, obtenha uma visão geral aproximada da fatia com um objetivo de 4x e encontre uma célula de aparência saudável para corrigir com um objetivo de 40x. Em seguida, prossiga com a braçadeira de remendo de célula inteira padrão.
   5. No caso de registro celular enxertado, identifique a área do tecido com as células enxertadas usando uma objetiva 4x e um filtro de epifluorescência na faixa azul (460 nm) pela expressão do repórter GFP no enxerto. Em seguida, amplie a área localizada com uma objetiva de 40x e encontre uma célula enxertada expressando GFP para uma braçadeira de remendo de célula inteira padrão.
   6. Verifique o potencial de membrana em repouso (PGR) imediatamente após a entrada na célula e certifique-se de que a qualidade da gravação é boa. Registre todos os parâmetros de interesse (por exemplo, resistência da membrana [Ri], parâmetros AP, correntes de sódio e potássio e atividade sináptica) na tensão de célula inteira ou na configuração de pinça de corrente.
   7. Depois de coletar todos os dados necessários, retraia cuidadosamente a pipeta de gravação sem danificar ainda mais a célula para que ela possa ser identificada com imunocoloração post-hoc.
   8. Transferir o corte para a solução de PFA a 4% para posterior fixação e coloração, conforme descrito no passo 4.1. A estreptavidina é usada para imunomarcar as células cheias de biocitina durante as gravações.

ANTICORPOS	Diluição	Anotações
Primário
Frango anti-GFP	1:1000
Frango anti-MAP2	1:1000
Cabra anti-AiF1	1:100
Mouse anti-MBP	1:1000	Recuperação de antígenos necessária
Rato anti-SC123	1:2000
Coelho anti-NeuN	1:1000
Coelho anti-Olig2	1:500
Coelho anti-Tmem119	1:200
Secundário
488-conjugado AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	1:500
488-conjugado AffinityPure Donkey anti-coelho IgG	1:500
488-conjugado AffinityPure Donkey anti-frango IgG	1:500
Afinidade conjugada Cy3Pure Donkey anti-frango IgG	1:500
Afinidade conjugada Cy3Pure Donkey anti-cabra IgG	1:500
Afinidade conjugada Cy3Pure Donkey anti-rato IgG	1:500
Alexa fluor 647-conjugado Streptavidin	1:500

Tabela 6: Lista de anticorpos primários e secundários para imuno-histoquímica.

haCSF	Concentração de existências	Concentração final [mM]	Por 1 L
NaCl	Pó	129	7,54 gr
NaHCO3	Pó	21	1,76 gr
Glicose	Pó	10	1,80 gr
Kcl	Pó	3	0,22 gr
NaH2PO4	Pó	1.25	0,17 gr
MgSO4	1 milh	2	2 mL
CaCl2	1 milh	1.6	1,6 mL

Tabela 7: Composição do líquido cefalorraquidiano artificial (haCSF).

Solução interna de K-gluconato	Concentração de existências	Concentração final [mM]	Por 100 mL
K-gluconato	Pó	122.5	2,87 gr
Kcl	Pó	12.5	93,18 mg
NaCl	Pó	8	46,76 mg
HEPES	Pó	10	238,32 mg
MgATP	Pó	2	101,4 mg
Na3GTP	Pó	0.3	17,0 mg
Nota: Ajuste o pH com KOH/HCl

Tabela 8: Composição da solução interna à base de K-gluconato.

Resultados

Seguindo o protocolo descrito, o tecido hACtx de um paciente com epilepsia do lobo temporal foi coletado e processado, conforme explicado acima. Alguns cortes foram fixados após 24 h em cultura para estudar o ponto de partida do tecido hospedeiro. A análise de diferentes populações de células neurais, como neurônios (expressando NeuN e Map2, Figura 1A), oligodendrócitos (Olig2 e MBP, Figura 1B) e astrócitos (GFAP humano-específico, também chamado STEM123, Figura 1C) mostrou preserv...

Discussão

Obter fatias hACtx de qualidade suficientemente alta é a etapa mais crítica neste protocolo. O tecido cortical é obtido de pacientes epilépticos submetidos à cirurgia ressectiva²⁴. A qualidade do tecido ressecado, bem como o tempo de exposição do tecido entre a ressecção e a cultura, é fundamental; quanto mais rápido o tecido for transferido da sala de cirurgia para o laboratório e cortado, mais ideal será a cultura organotípica. Idealmente, o tecido deve ser cortad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Bath temperature controller	Luigs & Neumann	TC0511354
Calcium Chloride dihydrate	Merck	102382
Carbogen gas	Air Liquide	NA
Cooler	Julaba FL 300	9661012.03
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Double Patch-Clamp amplifier	HEKA electronic	EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt	Millipore	371701
HEPES	AppliChem	A1069
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Patchmaster	HEKA electronic	Patchmaster 2x91
Pipette Puller	Sutter	P-2000
Plastic Petri dish	Any suitable
Potassium chloride	Merck	104936
Potassium D-gluconate	ThermoFisher	B25135
Rubber teat + glass pipette	Any suitable
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue	Loctite	2062278
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Vibratome	Leica	VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)	ThermoFisher Scientific	14175095
HEPES	AppliChem	A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys without Phenol Red	StemCell technologies	#05791	Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forceps	Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Animal Free Recombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glucose solution (45%)	Sigma	G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Supplement (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poly-L-Ornithine	Merk	P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein	R&D Systems	5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterile deionized water	MilliQ		MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL	Eppendorf	Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuge	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Sterile tubes	Sarstedt	Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm	VWR	612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL	Biotix VWR	Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Various
T25 flasks Nunc	ThermoFisher Scientific	156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoReserach	711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin	Jackson ImmunoReserach	016-600-084
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoReserach	001-000-162
Chicken anti-GFP	Merk Millipore	AB16901
Chicken anti-MAP2	Abcam	ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG	Jackson ImmunoReserach	705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)	Sigma Aldrich	D27802	Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)	Biorad	AHP2024
Hoechst 33342	Molecular Probes		Nuclear staining
Mouse anti-MBP	BioLegend	808402
Mouse anti-SC123	Stem Cells Inc	AB-123-U-050
Normal Donkey Serum	Merk Millipore	S30-100
Paint brush	Any suitable
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
Distilled water
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)	Merk Millipore	104873
Potassium phospate dibasic (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S3014
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab104225
Rabbit anti-Olig2	Abcam	ab109186
Rabbit anti-TMEM119	Abcam	ab185333
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-5G
Sodium citrate
Distilled water
Tri-Sodium Citrate	Sigma Aldrich	S1804-500G
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	327371000
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope	Zeiss	LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm	VWR	630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm	Marienfeld	107242
Microscope Software	Zeiss	ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable