Organotypische Kulturen des adulten humanen Kortex als Ex-vivo-Modell für die Transplantation und Validierung humaner Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt langfristige organotypische Kulturen des adulten menschlichen Kortex in Kombination mit der intrakortikalen Ex-vivo-Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen, die eine neuartige Methodik zur weiteren Erprobung stammzellbasierter Therapien für neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen darstellen.

Zusammenfassung

Neurodegenerative Erkrankungen sind häufig und heterogen in Bezug auf ihre Symptome und zelluläre Affektiertheit, was ihre Untersuchung aufgrund des Mangels an geeigneten Tiermodellen, die menschliche Krankheiten vollständig nachahmen, und der schlechten Verfügbarkeit von postmortalem menschlichem Hirngewebe erschwert. Die adulte menschliche Nervengewebekultur bietet die Möglichkeit, verschiedene Aspekte neurologischer Erkrankungen zu untersuchen. Molekulare, zelluläre und biochemische Mechanismen könnten in diesem System leicht angegangen werden, ebenso wie das Testen und Validieren von Medikamenten oder verschiedenen Behandlungen, wie z. B. zellbasierten Therapien. Diese Methode kombiniert organotypische Langzeitkulturen des adulten menschlichen Kortex, die von epileptischen Patienten gewonnen wurden, die sich einer resektiven Operation unterziehen, und ex vivo intrakortikale Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Zellüberlebens, der neuronalen Differenzierung, der Bildung synaptischer Ein- und Ausgänge und der elektrophysiologischen Eigenschaften menschlicher Zellen nach der Transplantation in intaktes erwachsenes menschliches kortikales Gewebe. Dieser Ansatz ist ein wichtiger Schritt auf dem Weg zur Entwicklung einer 3D-Plattform zur Modellierung menschlicher Krankheiten, die die Grundlagenforschung näher an die klinische Umsetzung stammzellbasierter Therapien für Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen heranführen und die Entwicklung neuer Werkzeuge zur Rekonstruktion geschädigter neuronaler Schaltkreise ermöglichen wird.

Einleitung

Neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer oder ischämischer Schlaganfall sind eine Gruppe von Krankheiten, die das gemeinsame Merkmal einer neuronalen Fehlfunktion oder des Todes aufweisen. Sie sind heterogen in Bezug auf das betroffene Gehirnareal und die neuronale Population. Leider sind Behandlungen für diese Krankheiten rar oder von begrenzter Wirksamkeit, da es keine Tiermodelle gibt, die das nachahmen, was im menschlichen Gehirn vorkommt ^1,2. Die Stammzelltherapie ist eine der vielversprechendsten Strategien für die Regeneration des Gehirns³. Die Erzeugung neuronaler Vorläuferzellen aus Stammzellen aus verschiedenen Quellen hat sich in den letzten Jahren stark entwickelt ^4,5. Jüngste Veröffentlichungen haben gezeigt, dass humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die aus Langzeit-Selbsterneuerungs-Neuroepithel-ähnlichen Stammzellen (lt-NES) stammen, nach einem kortikalen Differenzierungsprotokoll und nach intrakortikaler Transplantation in einem Rattenmodell mit ischämischem Schlaganfall, der den somatosensorischen Kortex betrifft, reife kortikale Neuronen erzeugen. Darüber hinaus erhielten die aus dem Transplantat stammenden Neuronen afferente und efferente synaptische Verbindungen von den Wirtsneuronen, was ihre Integration in das neuronale Netzwerk der Ratte zeigte ^6,7. Die aus dem Transplantat stammenden Axone wurden myelinisiert und in verschiedenen Bereichen des Rattengehirns gefunden, einschließlich des Peri-Infarktbereichs, des Corpus callosum und des kontralateralen somatosensorischen Kortex. Am wichtigsten ist, dass die aus iPS-Zellen gewonnene Transplantation motorische Defizite bei Schlaganfalltieren umkehrte⁷.

Auch wenn Tiermodelle helfen, das Überleben von Transplantaten, die neuronale Integration und die Wirkung der transplantierten Zellen auf motorische und kognitive Funktionen zu untersuchen, fehlen in diesem System Informationen über die Interaktion zwischen menschlichen Zellen (Graft-Host) ^8,9. Aus diesem Grund wird hier eine kombinierte Methode der organotypischen Langzeitkultur des menschlichen Gehirns mit der ex vivo-Transplantation von humanen iPS-Zellen abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen beschrieben. Organotypische Kulturen des menschlichen Gehirns, die aus neurochirurgischen Resektionen gewonnen werden, sind physiologisch relevante 3D-Modelle des Gehirns, die es Forschern ermöglichen, ihr Verständnis der Schaltkreise des menschlichen Zentralnervensystems zu verbessern und die genaueste Methode zum Testen von Behandlungen für Erkrankungen des menschlichen Gehirns zu finden. In diesem Zusammenhang wurde jedoch nicht genügend Forschung betrieben, und in den meisten Fällen wurden organotypische Kulturen des menschlichen Hippocampus-Gehirns verwendet^10,11. Die Großhirnrinde ist von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen betroffen, wie z. B. dem ischämischen Schlaganfall¹² oder der Alzheimer-Krankheit¹³, daher ist es wichtig, ein menschliches kortikales 3D-System zu haben, das es uns ermöglicht, unser Wissen zu erweitern und verschiedene therapeutische Strategien zu testen und zu validieren. Mehrere Studien in den letzten Jahren haben Kulturen aus adultem menschlichem kortikalem (hACtx) Gewebe verwendet, um menschliche Gehirnerkrankungen zu modellieren 14,15,16,17,18,19; Im Zusammenhang mit der Stammzelltherapie liegen jedoch nur begrenzte Informationen vor. Zwei Studien haben bereits die Machbarkeit des hier beschriebenen Systems nachgewiesen. Im Jahr 2018 wurde gezeigt, dass menschliche embryonale Stammzellen, die mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren programmiert und in hACtx-Gewebe transplantiert wurden, zu reifen kortikalen Neuronen führen, die sich in erwachsene menschliche kortikale Netzwerke integrieren können²⁰. Im Jahr 2020 zeigte die Transplantation von lt-NES-Zellen in das menschliche organotypische System ihre Fähigkeit, sich in reife, schichtspezifische kortikale Neuronen mit den elektrophysiologischen Eigenschaften funktioneller Neuronen zu differenzieren. Die transplantierten Neuronen stellten sowohl afferente als auch efferente synaptische Kontakte mit den menschlichen kortikalen Neuronen in den erwachsenen Gehirnschnitten her, was durch retrograde monosynaptische Verfolgung des Tollwutvirus, Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen und Immunelektronenmikroskopie^{bestätigt wurde 21}.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien, die von der Regionalen Ethikkommission, Lund, Schweden, genehmigt wurden (Ethikgenehmigungsnummer 2021-07006-01). Gesundes neokortikales Gewebe wurde von Patienten gewonnen, die sich einer elektiven Operation wegen Temporallappenepilepsie unterzogen. Von allen Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

HINWEIS: Alle erhaltenen Gewebe wurden unabhängig von ihrer Größe verarbeitet. Gewebe, die kleiner als 1-1,5 mm³ sind, sind jedoch technisch schwierig zu handhaben und mit einem Vibratom zu schneiden.

1. Sammeln, Pflegen, Schneiden und Plattieren von Gewebe

1. Vorbereitungen am Tag vor dem Gewebeschnitt
   1. 2 l Schneidlösung (Tabelle 1) werden in einem Messkolben zubereitet. Alle Zutaten außer MgCl 2 und CaCl₂ in ~1.800 ml deionisiertem Wasser auflösen und 15 Minuten mit Carbogengas sprudeln. Fügen Sie dann geeignete Mengen von 1 M MgCl 2 - und CaCl₂ -Lösungen hinzu und sprudeln Sie weitere 15 Minuten weiter. Zum Schluss füllen Sie den Kolben bis zur 2-Liter-Marke; Überprüfen Sie den pH-Wert und die Osmolarität und passen Sie sie bei Bedarf an. 2 x 350 ml der vorbereiteten Lösung einfrieren und den Rest bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Der pH-Wert und die Osmolarität betragen typischerweise 7,3-7,4 bzw. 295-300 mOsm.
   2. Bereiten Sie 100 ml Spüllösung vor (Tabelle 2). 476 mg HEPES und 200,6 mg Glucose werden in 100 ml HBSS gelöst, ergänzt mit 5 ml Penicillin/Streptomycin. Dieser kann bei 4 °C bis zu 10 Tage gelagert werden.
   3. Bereiten Sie das humane kortikale (hACtx) Kulturmedium (hACtx-Medium) vor (Tabelle 3) und filtern Sie es im Zellkulturlabor unter einer belüfteten Haube. Das Medium besteht aus neuronalem Medium ohne Phenolrot (siehe Materialtabelle), B27-Supplement, L-Glutamin (siehe Materialtabelle) und Gentamicin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
2. Vorbereitungen am Tag der Operation vor dem Eintreffen der Gewebeproben
   1. Überprüfen Sie die Verfügbarkeit der erforderlichen Geräte und Laborräume und reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente und das Vibratom (siehe Materialtabelle) sowie den Tischraum gründlich mit destilliertem Wasser (ohne Reinigungsmittel), gefolgt von 70% Ethanol. Lassen Sie das Ethanol mindestens 30 Minuten trocknen, bevor Sie die Werkzeuge und Geräte verwenden.
   2. Zerkleinern Sie die gefrorene Schneidlösung und blasen Sie die "Suppe" aus Eis und Flüssigkeit 30 Minuten lang mit Carbogengas auf. Verschließen Sie dann einen der Behälter fest mit der zerkleinerten Lösung "Suppe" und stellen Sie ihn in die Kühlbox. Dies wird verwendet, um das Gewebe aus dem Operationssaal zu entnehmen.
   3. Kalibrieren Sie das Vibratom und stellen Sie die Schnittparameter ein: 0,05 mm/s Geschwindigkeit und 1,7 mm Vibration. Stellen Sie die Schneidkammer auf eine Vibrationsstufe und starten Sie den daran angeschlossenen Kühler, so dass die Kammer eine konstante Temperatur von −3 °C hat.
   4. Bereiten Sie die Scheibensammelkammer mit Einsätzen vor, um die Gewebeschnitte und die Schneidlösung zu platzieren, und sprudeln Sie sie ständig mit Carbogengas bei Raumtemperatur (RT).
   5. Legen Sie die Kultureinsätze im Zellkulturlabor und unter einer belüfteten Haube mit einer Pinzette in eine 6-Well-Platte. Geben Sie 5 ml hACtx-Medium auf die Unterseite des Einsatzes, bis es die Membran berührt, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, und fügen Sie 2 ml auf der Oberseite des Einsatzes hinzu. Im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO 2 für mindestens₂ h ausbalancieren, bevor die Gewebeschnitte in die Einsätze übertragen werden.
3. Verfahren zur Gewebeentnahme und -schneidung
   1. Sammeln Sie das Gewebe des Patienten unmittelbar nach der Resektion im Operationssaal, wenn möglich, direkt in einen Behälter mit gefrorener, blasenförmiger und zerkleinerter Schneidlösung. Übertragen Sie den geschlossenen Behälter auf Eis sofort in den Schneidebereich des Labors.
   2. Untersuchen Sie das Gewebe und suchen Sie die beste Oberfläche, um es unter Berücksichtigung der Ausrichtung der kortikalen Schichten auf die Schneidephase des Vibratoms zu kleben (siehe Schritt 1.3.3). Schneiden Sie bei Bedarf die unebene Oberfläche mit einem Skalpell ab, damit das Gewebe leicht auf den Tisch gelegt werden kann, um eine optimale Schnittausrichtung zu erreichen.
   3. Kleben Sie das Gewebe mit Gewebekleber auf den Tisch (siehe Materialtabelle), legen Sie es in die Schneidekammer und füllen Sie die Kammer sofort mit kalter Schneidelösung. Setzen Sie das Sprudeln während des gesamten Schneidvorgangs fort.
   4. Schneiden Sie koronale oder sagittale Scheiben, je nach Ausrichtung von Gewebe zu Klinge, mit einer Dicke von 300 μm, um alle kortikalen Schichten und, wenn möglich, die weiße Substanz aufzunehmen. Legen Sie die Scheiben in die Auffangkammer mit sprudelnder Schneidlösung bei RT.
      HINWEIS: Schneiden Sie von der Seite der weißen Substanz zur Oberfläche des Kortex. Entfernen Sie die Hirnhäute nicht, da dies das Gewebe schädigen kann. Die Schneidklinge schneidet sie normalerweise leicht durch.
   5. Sobald das gesamte Gewebe geschnitten wurde, werden die Scheiben in eine sterile Petrischale mit Spüllösung bei RT überführt und in das Zellkulturlabor transportiert. Dieser Schritt ist notwendig, um überschüssige Saccharose von den Scheiben zu entfernen, bevor sie auf die Kulturplatte übertragen werden.
      HINWEIS: Verwenden Sie zum Übertragen der Scheiben (in diesem und den folgenden Schritten) eine umgekehrte Glaspipette, brechen Sie den dünneren Teil ab und setzen Sie einen Gummisauger zum Absaugen ein.
4. Kultivierung und Pflege von hACtx-Gewebeschnitten
   1. Legen Sie die Gewebeschnitte einzeln auf die bereits nassen und untergetauchten Einsätze. Wechseln Sie nach 24 h das Medium, um verbleibende Saccharose oder andere Reststoffe aus den Schneidvorgängen weiter zu entfernen.
   2. Ersetzen Sie das Nährmedium alle 7 Tage durch frisches Medium. Verwenden Sie nach 2 Wochen hACtx-Medium ohne Gentamicin. Die Kultur kann bis zu 2 Monate aufrechterhalten werden.
      HINWEIS: Äquilibrieren Sie das hACtx-Medium im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO 2 für mindestens₂ h vor dem Medienwechsel. Frisches Medium sollte alle 2 Wochen zubereitet werden. Überprüfen Sie die Scheiben alle 2-3 Tage und geben Sie, wenn ein Teil des Mediums verdunstet ist, mehr an die Oberseite des Einsatzes.

Schneidelösung	Konzentration der Bestände	Endkonzentration [mM]	Pro 1 L
Saccharose	Pulver	200	68,46 g
NaHCO3	Pulver	21	1,76 g
Kcl	Pulver	3	0,22 g
NaH2PO4	Pulver	1.25	0,17 g
Traubenzucker	Pulver	10	1,80 g
MgSO4	ca. 1 m	2	2 ml
CaCl2	ca. 1 m	1.6	1,6 ml
MgCl2	ca. 2 m	2	1 ml

Tabelle 1: Zusammensetzung der Schneidlösung. MgCl2_{und CaCl2} werden als vorgefertigte 1 M-Lösungen in deionisiertem Wasser verwendet.

Spüllösung	Konzentration der Bestände	Endkonzentration	Pro 100 ml
HBSS (Begriffsklärung)	1x		95 mL
PenStrep	10.000 U/ml	500 U/ml	5 mL
HEPES	Pulver	4,76 g/L	476 mg
Traubenzucker	Pulver	2 g/L	200,6 mg

Tabelle 2: Zusammensetzung der Spüllösung.

hACtx mittel	Konzentration der Bestände	Endkonzentration	Pro 100 ml
Neuronales Medium ohne Phenolrot			97,4 ml	siehe Materialtabelle
B27	50x	1:50	2 ml
L-Glutamin	100x	1:200	500 μL	siehe Materialtabelle
Gentamicin	50 mg/ml	1:1000	100 μL

Tabelle 3: Zusammensetzung des hACtx-Mediums.

2. Proliferation und Differenzierung von lt-NES-Zellen

HINWEIS: Lt-NES-Zellen werden wie zuvor beschrieben^{erzeugt 21,22} und mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter einem konstitutiven Promotor (GFP-lt-NES-Zellen) trägt. Durchstechflaschen mit 3 x 10⁶ Zellen werden bis zur Verwendung bei −150 °C gelagert.

1. Aufbereitung der Stammlösungen und Medien
   1. 100 μg basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) werden in 10 ml PBS-0,1% BSA verdünnt, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie 100 μl Aliquote vor.
   2. 100 μg epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) werden in 10 ml PBS-0,1 % BSA verdünnt, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie 100 μl Aliquote vor.
   3. Aliquot 50x B27 Supplement in einem Volumen von 100 μL pro Aliquot.
   4. 10 mg Poly-L-Ornithin werden in 100 ml deionisiertem Wasser verdünnt, um eine Stammkonzentration von 100 μg/ml zu erreichen. Stellen Sie 1 ml Aliquote her.
   5. Bereiten Sie 30 μl Aliquote von 1,20 mg/ml Mauslaminin vor.
   6. 10 ml Trypsin-EDTA (0,25 %) werden in 90 ml PBS auf eine Stammkonzentration von 0,025 % verdünnt. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor.
   7. 0,025 g Trypsin-Inhibitor werden in 50 ml PBS auf eine Stammkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor.
   8. 10 μg Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family member 3A) werden in 1 ml PBS-0,1 % BSA verdünnt, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie BMP4 (Knochenmorphogenetisches Protein 4) auf die gleiche Weise vor. Aliquot in einem Volumen von 100 μL.
   9. 1 mg Cyclopamin wird in 2,5 ml DMSO auf eine Endkonzentration von 400 μg/ml verdünnt und 100 μl Aliquote hergestellt.
   10. Grundmedium (Tabelle 4) und differenzierungsdefiniertes Medium (DDM, Tabelle 5) vorbereiten und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
2. Beschichtung von Kulturschalen
   1. Um die Schalen vorzubeschichten, um die GFP-It-NES-Zellen während der Proliferation oder Differenzierung zu kultivieren, verdünnen Sie Poly-L-Ornithin 1:100 in deionisiertem Wasser und geben Sie 5 ml der Lösung in einen T25-Kolben. Inkubieren Sie über Nacht bei RT.
   2. Waschen Sie die mit Poly-L-Ornithin beschichteten Platten 1x mit deionisiertem Wasser und 1x mit PBS.
   3. Für GFP-It-NES-Zellen in der Proliferation wird Mauslaminin bei 1:500 in PBS verdünnt und mindestens 2 h bei 37 °C inkubiert. Für GFP-It-NES-Zellen in Differenzierung wird Mauslaminin im Verhältnis 1:100 in PBS verdünnt und mindestens 2 h bei 37 °C inkubiert.
3. Proliferation der GFP-lt-NES-Zellen
   1. Erwärmen Sie 5 ml (zum Waschen) und 5 ml (zum Aussäen) des Grundmediums in zwei verschiedenen 15-ml-Röhrchen.
   2. Eine Durchstechflasche mit GFP-lt-NES-Zellen wird bei 37 °C rasch aufgetaut, in das Waschröhrchen gegeben und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert.
   3. Saugen Sie das Medium vorsichtig ab, ohne das Pellet zu berühren, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vorgewärmtem Basismedium. Übertragen Sie die Zellsuspension in das Aussaatröhrchen, das das Basismedium enthält, das mit Proliferationsfaktoren angereichert ist: EGF (10 ng/ml), bFGF (10 ng/ml) und B27 (10 ng/ml). Säen Sie die Zellen auf einen mit Poly-L-Ornithin/Laminin beschichteten T25-Kolben.
   4. Füttern Sie die Zellen jeden Tag mit Proliferationsfaktoren. Ersetzen Sie das Medium, wenn es gelb wird. Passieren Sie die Zellen jeden dritten oder vierten Tag (1 Tag, nachdem sie 100% Konfluenz erreicht haben).
4. Aufteilung der GFP-lt-NES-Zellen zur Proliferation und Differenzierung
   1. 5 ml Basismedium pro Kolben vorwärmen (um die Zellen zu sammeln), zuzüglich des Gesamtvolumens, das für die Wiederaussaat benötigt wird.
      HINWEIS: Die Passage erfolgt mit einer Verdünnung von 1:3, um die Zellen in der Proliferation zu halten, was 15 ml Basismedium erfordert, und einer Verdünnung von 1:6, um mit der Differenzierung zu beginnen, was 30 ml Basismedium erfordert.
   2. Nehmen Sie das Medium durch Aspiration aus dem Zellkulturkolben und fügen Sie 500 μl vorgewärmtes 0,025% Trypsin hinzu. 5-10 min bei RT inkubieren. Die Ablösung der Zellen kann unter einem Standard-Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung bestätigt werden.
   3. Fügen Sie ein gleiches Volumen Trypsin-Inhibitor (0,5 mg/ml Endkonzentration) hinzu, gefolgt von 5 ml warmem basischem Medium. Lösen und sammeln Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Die Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert .
   4. Um die Zellen in der Proliferation zu halten, wird die Platte im Verhältnis 1:3 in frischem Basismedium, das mit Proliferationsfaktoren ergänzt ist, neu aufgetragen und Schritt 2.3.4 wiederholt.
5. Kortikale Differenzierung der GFP-lt-NES-Zellen
   1. Am Tag 0 resuspendieren die Zellen (zur Differenzierung zu verwenden) in 30 ml basischem Medium, das mit Proliferationsfaktoren angereichert ist, und plattieren Sie sie in sechs differenzierungsbeschichteten T25-Kolben (aufgeteilt 1:6).
   2. Ändern Sie an Tag 1 die Hälfte des Mediums auf DDM und fügen Sie Proliferationsfaktoren mit der Hälfte ihrer Konzentration hinzu.
   3. Ändern Sie das Medium an Tag 2 vollständig auf DDM, ergänzt mit Differenzierungsfaktoren: BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (10 ng/ml) und Cyclopamin (400 ng/ml).
   4. Fügen Sie an Tag 4 nur die Differenzierungsfaktoren hinzu. Ersetzen Sie das Medium, wenn es gelb wird.
   5. Ändern Sie an Tag 6 das Medium auf DDM, das mit BMP4 und Wnt3a ergänzt wird. In diesem Schritt wird das Cyclopamin entfernt.
   6. Trennen Sie an Tag 7 die Zellen wie in Schritt 2.4.2 und Schritt 2.4.3 beschrieben.

Grundlegendes Medium	Konzentration der Bestände	Endkonzentration	Pro 100 ml
DMEM/F12 mit L-Glutamin	1x		98,7 ml
N-2 Ergänzung	100x	1:100	1 ml
Traubenzucker	45%	3,5 ml/l	350 μL

Tabelle 4: Zusammensetzung des Proliferationsmediums von lt-NES-Zellen (basisches Medium).

DDM-Mittel	Konzentration der Bestände	Endkonzentration	Pro 100 ml
DMEM/F12 mit L-Glutamin			96 ml
N2	100 x	1:100	1 ml
NEAA	100 x	1:100	1 ml
Natriumpyruvat	100 mM	1:100	1 ml
BSA-V-Fraktion	7.5%	6,6 ml/l	660 μL
2-Mercaptoethanol	50 nM	7 μL/L	0,7 μL
Traubenzucker	45%	3,2 ml/l	320 μL

Tabelle 5: Zusammensetzung des differenzierungsdefinierten Mediums (DDM) von lt-NES-Zellen.

3. Transplantation der GFP-lt-NES-Zellen in organotypische hACtx-Schnitte

HINWEIS: Das hACtx-Gewebe sollte vor der Zelltransplantation 1 Woche lang kultiviert werden. Um das Transplantationsverfahren zu erleichtern, ist es notwendig, 2 ml des hACtx-Mediums von der Oberseite des Einsatzes zu entfernen, um zu verhindern, dass das Gewebe schwimmt.

1. Die kortikal geprimten GFP-lt-NES-Zellen (aus Schritt 2.5.6) werden in kalter reiner Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen/μl resuspendiert und die Lösung in ein kleineres steriles Röhrchen überführt.
   HINWEIS: Während des Transplantationsverfahrens sollten alle Materialien (Pipettenspitzen, Röhrchen, Kapillaren usw.) vorgekühlt werden, um eine Verfestigung des Gels zu vermeiden. Tauen Sie das Basalmembran-Matrix-Gel vor seiner Verwendung 30 Minuten lang auf Eis auf.
2. Sammeln Sie die Zellsuspension in einer kalten Glaskapillare, die zum Absaugen mit einem Gummisauger verbunden ist. Injizieren Sie die Zellsuspension in kleinen Tropfen (je ca. 1 μl), indem Sie den halbtrockenen Gewebeschnitt an verschiedenen Stellen stechen.
3. 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, damit sich das Gel verfestigt. Übertragen Sie die Platte aus dem Inkubator zurück in die Haube und geben Sie vorsichtig 2 ml hACtx-Medium auf die Oberseite des Einsatzes, um das Gewebe vollständig einzutauchen.
4. Ersetzen Sie das Nährmedium einmal pro Woche durch frisches hACtx-Medium.

4. Validierung

1. Färbung der hACtx-Scheiben
   1. Nehmen Sie die Scheiben zum gewünschten Zeitpunkt aus dem Zellkulturlabor und entfernen Sie sie aus dem Einsatz, indem Sie sie in eine Petrischale mit PBS tauchen. Anschließend werden die Scheiben mit einer umgekehrten Glaspipette in Färbefläschchen überführt (siehe ANMERKUNG in Schritt 1.3.5) und über Nacht bei 4 °C mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert.
   2. Spülen Sie 3x mit KPBS für jeweils 15 Minuten und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit Permeabilisierungslösung (0,02% BSA und 1% Triton X-100 in KPBS).
   3. Am nächsten Tag wird Blockierlösung (KPBS mit 0,2 % Triton X-100, 1 % BSA, Natriumazid [1:10.000] und 10 % normalem Eselserum) hinzugefügt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
   4. Nach dem Blockieren werden die in der Blocklösung verdünnten Primärantikörper (siehe Tabelle 6 ) in die Blocklösung gegeben und 48 h bei 4 °C inkubiert.
   5. 3x mit Blockierlösung ohne Zugabe von Serum jeweils 15 Minuten waschen. Die in Blockierlösung verdünnten sekundären Antikörper werden zugegeben (siehe Tabelle 6 für die Verdünnungen) und 48 h bei 4 °C inkubiert.
   6. 3x mit Blockierlösung ohne Serum waschen und 2 h bei RT in Hoechst-Färbung inkubieren, verdünnt in Permeabilisierungslösung (1:1.000).
   7. 3x mit KPBS waschen, die Scheiben mit einem Pinsel auf Objektträger montieren und trocknen lassen. Zum Schluss spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem Wasser ab, entfernen Sie überschüssiges Wasser, fügen Sie das Montagemedium hinzu und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab. Bewahren Sie die Objektträger mindestens 24 Stunden bei RT auf und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C.
      ANMERKUNG: Bei Antikörpern, die Kernepitope markieren, ist die Antigenentnahme vor der Permeabilisierung (Schritt 4.1.2) mit Natriumcitrat (10 mM, pH 6,0) für 2 h bei 65 °C durchzuführen.
2. Ganzzell-Patch-Klemme
   1. Bereiten Sie am Tag der Aufzeichnung 1 l künstliches Liquor cerebrospinalis (haCSF) vor, das so modifiziert ist, dass es besser an die menschliche Gehirnumgebung angepasst ist (Tabelle 7). Ähnlich wie bei der Schneidlösung werden ca. 900 ml der Lösung mit allen Zutaten außer CaCl 2 in deionisiertem Wasser gelöst und 15 Minuten lang mit Carbogen gesprudelt, bevor das entsprechende Volumen von 1 M CaCl₂ -Lösung hinzugefügt wird. Füllen Sie den Messkolben bis zur 1-l-Marke auf und sprudeln Sie weitere 15 Minuten bei RT, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen und während des gesamten Experiments.
   2. Übertragen Sie die Gewebeschnitte von der Kulturplatte in die Aufnahmekammer auf dem Tisch eines aufrechten Mikroskops, das ständig mit blasenförmigem haCSF mit einer Perfusionsrate von 2 ml/min perfundiert und mit einem Badtemperaturregler auf 34 °C erwärmt wird.
   3. Ziehen Sie die Glaskapillaren mit einem Pipettenzieher auf einen durchschnittlichen Widerstand von 3-5 MΩ und füllen Sie die Kapillaren mit einer internen Lösung auf K-Gluconatbasis (Tabelle 8) mit frisch zugegebenen 2-4 mg Biocytin auf, um die aufgezeichneten Zellen nachträglich zu identifizieren. Der pH-Wert und die Osmolarität dieser internen Lösung betragen 7,2 bis 7,3 bzw. 285 bis 295 mOsm.
   4. Verschaffen Sie sich im Falle der Aufzeichnung der Wirtszelle einen groben Überblick über die Scheibe mit einem 4-fachen Objektiv und finden Sie eine gesund aussehende Zelle, die Sie mit einem 40-fachen Objektiv patchen können. Fahren Sie dann mit der Standard-Ganzzellen-Patch-Klemme fort.
   5. Im Falle einer transplantierten Zellaufzeichnung identifizieren Sie den Gewebebereich mit den transplantierten Zellen unter Verwendung eines 4-fachen Objektivs und eines Epifluoreszenzfilters im blauen Bereich (460 nm) durch GFP-Reporterexpression im Transplantat. Zoomen Sie dann mit einem 40-fachen Objektiv in den lokalisierten Bereich und finden Sie eine transplantierte Zelle, die GFP exprimiert, für eine Standard-Ganzzell-Patch-Klemme.
   6. Überprüfen Sie das Ruhemembranpotential (RMP) unmittelbar nach dem Einbruch in die Zelle und stellen Sie sicher, dass die Qualität der Aufnahme gut ist. Notieren Sie alle relevanten Parameter (z. B. Membranwiderstand [Ri], AP-Parameter, Natrium- und Kaliumströme und synaptische Aktivität) in der Ganzzellenspannungs- oder Stromzangenkonfiguration.
   7. Nachdem Sie alle erforderlichen Daten gesammelt haben, ziehen Sie die Aufnahmepipette vorsichtig zurück, ohne die Zelle weiter zu beschädigen, damit sie mit einer Post-hoc-Immunfärbung identifiziert werden kann.
   8. Übertragen Sie die Scheibe zur weiteren Fixierung und Färbung in die 4%ige PFA-Lösung, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Streptavidin wird verwendet, um die mit Biocytin gefüllten Zellen während der Aufnahmen immunoaktiv zu markieren.

ANTIKÖRPER	Verdünnung	Notizen
Primär
Huhn Anti-GFP	1:1000
Huhn Anti-MAP2	1:1000
Ziege Anti-AiF1	1:100
Maus Anti-MBP	1:1000	Antigen-Retrieval erforderlich
Maus Anti-SC123	1:2000
Kaninchen Anti-NeuN	1:1000
Kaninchen Anti-Olig2	1:500
Kaninchen Anti-Tmem119	1:200
Sekundär
488-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Maus-IgG	1:500
488-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Kaninchen-IgG	1:500
488-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Huhn-IgG	1:500
Cy3-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Huhn-IgG	1:500
Cy3-konjugierte AffinitätReiner Esel Anti-Ziege IgG	1:500
Cy3-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Maus-IgG	1:500
Alexa Fluor 647-konjugiertes Streptavidin	1:500

Tabelle 6: Liste der primären und sekundären Antikörper für die Immunhistochemie.

haCSF	Konzentration der Bestände	Endkonzentration [mM]	Pro 1 L
NaCl	Pulver	129	7,54 g
NaHCO3	Pulver	21	1,76 g
Traubenzucker	Pulver	10	1,80 g
Kcl	Pulver	3	0,22 g
NaH2PO4	Pulver	1.25	0,17 g
MgSO4	ca. 1 m	2	2 ml
CaCl2	ca. 1 m	1.6	1,6 ml

Tabelle 7: Zusammensetzung der künstlichen Liquor cerebrospinalis (haCSF).

K-Gluconat interne Lösung	Konzentration der Bestände	Endkonzentration [mM]	Pro 100 ml
K-Gluconat	Pulver	122.5	2,87 g
Kcl	Pulver	12.5	93,18 mg
NaCl	Pulver	8	46,76 mg
HEPES	Pulver	10	238,32 mg
MgATP	Pulver	2	101,4 mg
Na3GTP	Pulver	0.3	ca. 17,0 mg
Anmerkung: Einstellen des pH-Werts mit KOH/HCl

Tabelle 8: Zusammensetzung der internen Lösung auf K-Gluconat-Basis.

Ergebnisse

Nach dem beschriebenen Protokoll wurde hACtx-Gewebe von einem Patienten mit Temporallappenepilepsie entnommen und verarbeitet, wie oben erläutert. Einige Scheiben wurden nach 24 h in Kultur fixiert, um den Ausgangspunkt des Wirtsgewebes zu untersuchen. Die Analyse verschiedener neuronaler Zellpopulationen wie Neuronen (exprimiert NeuN und Map2, Abbildung 1A), Oligodendrozyten (Olig2 und MBP, Abbildung 1B) und Astrozyten (humanspezifisches GFAP, auch STEM123 genannt, Abb...

Diskussion

Das Erhalten von hACtx-Scheiben von ausreichender Qualität ist der kritischste Schritt in diesem Protokoll. Kortikales Gewebe wird von Epilepsiepatienten gewonnen, die sich einer resektiven Operation unterziehen²⁴. Die Qualität des resezierten Gewebes sowie die Expositionszeit des Gewebes zwischen Resektion und Kultur sind entscheidend; Je schneller das Gewebe vom Operationssaal ins Labor gebracht und geschnitten wird, desto optimaler ist die organotypische Kultur. Idealerweise...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Bath temperature controller	Luigs & Neumann	TC0511354
Calcium Chloride dihydrate	Merck	102382
Carbogen gas	Air Liquide	NA
Cooler	Julaba FL 300	9661012.03
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Double Patch-Clamp amplifier	HEKA electronic	EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt	Millipore	371701
HEPES	AppliChem	A1069
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Patchmaster	HEKA electronic	Patchmaster 2x91
Pipette Puller	Sutter	P-2000
Plastic Petri dish	Any suitable
Potassium chloride	Merck	104936
Potassium D-gluconate	ThermoFisher	B25135
Rubber teat + glass pipette	Any suitable
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Merck	106346
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue	Loctite	2062278
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Vibratome	Leica	VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)	ThermoFisher Scientific	14175095
HEPES	AppliChem	A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys without Phenol Red	StemCell technologies	#05791	Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Forceps	Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Supplement (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM	ThermoFisher Scientific	31350010
Animal Free Recombinant EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Glucose solution (45%)	Sigma	G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)	ThermoFisher Scientific	11140050
N-2 Supplement (100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poly-L-Ornithine	Merk	P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein	R&D Systems	5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder	Thermo Fisher Scientific	17075029
Sterile deionized water	MilliQ		MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL	Eppendorf	Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrifuge	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubator	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm	Vitrolife	14601
Sterile tubes	Sarstedt	Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm	VWR	612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL	Biotix VWR	Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Various
T25 flasks Nunc	ThermoFisher Scientific	156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoReserach	711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin	Jackson ImmunoReserach	016-600-084
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoReserach	001-000-162
Chicken anti-GFP	Merk Millipore	AB16901
Chicken anti-MAP2	Abcam	ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG	Jackson ImmunoReserach	703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG	Jackson ImmunoReserach	705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoReserach	715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)	Sigma Aldrich	D27802	Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)	Biorad	AHP2024
Hoechst 33342	Molecular Probes		Nuclear staining
Mouse anti-MBP	BioLegend	808402
Mouse anti-SC123	Stem Cells Inc	AB-123-U-050
Normal Donkey Serum	Merk Millipore	S30-100
Paint brush	Any suitable
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
Distilled water
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)	Merk Millipore	104873
Potassium phospate dibasic (K2HPO4)	Sigma Aldrich	P3786
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S3014
Rabbit anti-NeuN	Abcam	ab104225
Rabbit anti-Olig2	Abcam	ab109186
Rabbit anti-TMEM119	Abcam	ab185333
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002-5G
Sodium citrate
Distilled water
Tri-Sodium Citrate	Sigma Aldrich	S1804-500G
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379
Triton X-100	ThermoFisher Scientific	327371000
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope	Zeiss	LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm	VWR	630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm	Marienfeld	107242
Microscope Software	Zeiss	ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette	Any suitable