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요약

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 내 이식과 결합된 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양을 설명하며, 이는 인간 신경퇴행성 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료법을 추가로 테스트하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다.

초록

신경퇴행성 장애는 증상과 세포 영향 측면에서 흔하고 이질적이어서 인간 질병을 완전히 모방하는 적절한 동물 모델이 부족하고 사후 인간 뇌 조직의 가용성이 낮기 때문에 연구가 복잡합니다. 성인 인간 신경 조직 배양은 신경 장애의 다양한 측면을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 분자, 세포 및 생화학적 메커니즘은 이 시스템에서 쉽게 해결할 수 있을 뿐만 아니라 약물 또는 세포 기반 요법과 같은 다양한 치료법을 테스트하고 검증할 수 있습니다. 이 방법은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻은 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양과 유도만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 이식을 결합합니다. 이 방법을 사용하면 세포 생존, 신경 분화, 시냅스 입력 및 출력 형성, 손상되지 않은 성인 인간 피질 조직에 이식한 후 인간 유래 세포의 전기생리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 다양한 신경 질환 환자를 위한 줄기 세포 기반 치료법의 임상 번역에 더 가까운 기초 연구를 제공하고 손상된 신경 회로를 재구성하기 위한 새로운 도구의 개발을 가능하게 하는 3D 인간 질병 모델링 플랫폼을 개발하기 전에 중요한 단계입니다.

서문

파킨슨병, 알츠하이머병 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 신경퇴행성 장애는 신경 기능 장애 또는 사망의 공통된 특징을 공유하는 질병 그룹입니다. 그들은 영향을받는 뇌 영역과 신경 집단 측면에서 이질적입니다. 불행하게도, 이러한 질병에 대한 치료법은 인간의 뇌에서 일어나는 것을 모방하는 동물 모델이 없기 때문에 드물거나 효능이 제한적이다 1,2. 줄기세포 치료는 뇌 재생을 위한 가장 유망한 전략 중 하나이다3. 다른 출처의 줄기 세포에서 신경 전구 세포의 생성은 최근 몇 년 동안 크게 발전했습니다 4,5. 최근 간행물에 따르면 인간 유도 만능 줄기(iPS) 세포 유래 장기 자가 재생 신경상피 유사 줄기(lt-NES) 세포는 피질 분화 프로토콜에 따라 체성 감각 피질에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중이 있는 쥐 모델에서 피질 내 이식 후 성숙한 피질 뉴런을 생성합니다. 또한, 이식편 유래 뉴런은 숙주 뉴런으로부터 구 심성 및 원심성 시냅스 연결을 받아 쥐 뉴런 네트워크 6,7에 통합되었음을 보여줍니다. 이식편 유래 축삭은 수초화되어 경색 주위 영역, 뇌량 및 반대쪽 체성 감각 피질을 포함하여 쥐 뇌의 다른 영역에서 발견되었습니다. 가장 중요한 것은 iPS 세포 유래 이식이 뇌졸중 동물의 운동 장애를 역전시켰다는 것이다 7.

동물 모델이 이식 생존, 신경 통합, 이식된 세포가 운동 및 인지 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 도움이 되더라도 인간 세포(이식편-숙주) 간의 상호 작용에 대한 정보는 이 시스템에서 누락되어 있습니다 8,9. 이러한 이유로, 인간 iPS 세포 유래 뉴런 전구체의 생체 외 이식과 함께 장기 인간 뇌 기관형 배양의 조합 방법이 여기에 기재되어 있다. 신경외과적 절제술을 통해 얻은 인간 뇌 기관형 배양은 생리학적으로 관련된 뇌의 3D 모델로, 연구자들이 인간 중추 신경계 회로에 대한 이해와 인간 뇌 질환 치료법을 테스트하는 가장 정확한 방법을 높일 수 있습니다. 그러나 이러한 맥락에서 충분한 연구가 이루어지지 않았으며, 대부분의 경우 인간 해마 뇌 기관형 배양이 사용되었습니다10,11. 대뇌 피질은 허혈성 뇌졸중12 또는 알츠하이머 병13과 같은 여러 신경 퇴행성 질환의 영향을 받기 때문에 지식을 넓히고 다양한 치료 전략을 테스트하고 검증 할 수있는 인간 피질 3D 시스템을 갖는 것이 중요합니다. 지난 몇 년 동안 여러 연구에서 성인 인간 피질(hACtx) 조직의 배양을 사용하여 인간 뇌 질환을 모델링했습니다 14,15,16,17,18,19; 그러나 줄기 세포 치료의 맥락에서 제한된 정보를 사용할 수 있습니다. 두 가지 연구가 이미 여기에 설명 된 시스템의 타당성을 입증했습니다. 2018년, 다양한 전사 인자로 프로그래밍되고 hACtx 조직에 이식된 인간 배아 줄기 세포는 성인 인간 피질 네트워크에 통합될 수 있는 성숙한 피질 뉴런을 생성하는 것으로 나타났습니다20. 2020년에 lt-NES 세포를 인간 기관형 시스템에 이식한 결과 기능적 뉴런의 전기생리학적 특성을 가진 성숙한 층별 피질 뉴런으로 분화할 수 있는 능력이 밝혀졌습니다. 이식된 뉴런은 성인 뇌 절편에서 인간 피질 뉴런과 구심성 및 원심성 시냅스 접촉을 모두 확립했으며, 이는 광견병 바이러스 역행 단시냅스 추적, 전체 세포 패치 클램프 기록 및 면역 전자 현미경에 의해 확증되었습니다21.

프로토콜

이 프로토콜은 스웨덴 룬드에 있는 지역 윤리 위원회(윤리 허가 번호 2021-07006-01)에서 승인한 지침을 따릅니다. 건강한 신피질 조직은 측두엽 간질에 대한 선택적 수술을 받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

참고: 얻은 모든 조직은 크기에 관계없이 처리되었습니다. 그러나 크기가 1-1.5mm3보다 작은 조직은 기술적으로 다루기가 어렵고 비브라톰으로 절편합니다.

1. 조직 수집, 유지 관리, 절단 및 도금

  1. 조직 슬라이싱 전날 준비
    1. 부피 플라스크에 2L의 절단 용액(표 1)을 준비합니다. MgCl 2 및 CaCl2를 제외한 모든 성분을 ~1,800mL의 탈이온수에 녹이고 카보겐 가스로 15분 동안 버블링합니다. 그런 다음 적절한 양의 1M MgCl 2 및 CaCl2 용액을 추가하고 15분 더 버블링을 계속합니다. 마지막으로 플라스크를 2L 표시까지 채웁니다. pH와 삼투압을 확인하고 필요한 경우 조정합니다. 제조된 용액 2 x 350 mL를 동결하고 나머지는 4°C에서 보관한다.
      참고: pH와 삼투압은 일반적으로 각각 7.3-7.4 및 295-300mOsm입니다.
    2. 100mL의 헹굼 용액을 준비합니다(표 2). 페니실린/스트렙토마이신 5mL가 보충된 HBSS 100mL에 HEPES 476mg과 포도당 200.6mg을 녹입니다. 4°C에서 최대 10일 동안 보관할 수 있습니다.
    3. 인간 성체 피질(hACtx) 배양액(hACtx 배지)(표 3)을 준비하고, 이를 통풍이 잘 되는 후드 하에 세포 배양 실험실에서 여과하였다. 배지는 페놀 레드가 없는 신경 배지(재료 표 참조), B27 보충제, L-글루타민(재료 표 참조) 및 겐타마이신을 포함합니다. 4 °C에서 최대 2주 동안 보관하세요.
  2. 조직 샘플이 도착하기 전에 수술 당일 준비
    1. 필요한 장비와 실험실 공간의 가용성을 확인하고 모든 수술 도구와 비브라톰( 재료 표 참조), 벤치탑 공간을 증류수(세제 제외)와 70% 에탄올로 철저히 청소합니다. 도구와 장비를 사용하기 전에 에탄올을 최소 30분 동안 건조시키십시오.
    2. 얼어붙은 절단 용액을 부수고 얼음과 액체의 "수프"에 카보겐 가스로 30분 동안 거품을 냅니다. 그런 다음 분쇄 된 용액 ''수프''로 용기 중 하나를 단단히 닫고 아이스 박스에 넣습니다. 이것은 수술실에서 조직을 수집하는 데 사용됩니다.
    3. 진동을 보정하고 절삭 매개변수를 설정합니다: 0.05mm/s 속도 및 1.7mm 진동. 커팅 챔버를 비브라톰 스테이지에 놓고 챔버가 -3 °C의 일정한 온도가되도록 연결된 냉각기를 시작합니다.
    4. 조직 조각과 절단 용액을 배치하기 위해 삽입물이 있는 슬라이스 수집 챔버를 준비하고 실온(RT)에서 카보겐 가스로 지속적으로 버블링합니다.
    5. 세포 배양 실험실과 통풍이 잘되는 후드 아래에서 집게를 사용하여 배양 삽입물을 6웰 플레이트에 넣습니다. 기포가 형성되지 않도록 멤브레인과 접촉할 때까지 인서트 하단에 hACtx 배지 5mL를 추가하고 인서트 상단에 2mL를 추가합니다. 조직 절편을 삽입물 내로 옮기기 전에 37°C 및 5%CO2 에서 적어도 2시간 동안 인큐베이터에서 평형을 이룬다.
  3. 조직 수집 및 슬라이싱 절차
    1. 절제 직후 수술실에 있는 환자의 조직을 가능하면 냉동, 기포 및 분쇄된 절단 용액이 담긴 용기에 직접 채취합니다. 얼음 위에 놓인 밀폐된 용기를 즉시 실험실의 절단 영역으로 옮깁니다.
    2. 조직을 검사하고 피질층의 방향을 고려하여 비브라톰의 절단 단계에 접착 할 최상의 표면을 찾습니다 (1.3.3 단계 참조). 필요한 경우 메스로 고르지 않은 표면을 잘라서 최적의 슬라이스 방향을 위해 조직을 스테이지에 쉽게 놓을 수 있도록 합니다.
    3. 티슈를 티슈 접착제로 스테이지에 붙이고( 재료 표 참조), 슬라이싱 챔버에 넣은 다음 즉시 챔버를 콜드 버블 절단 용액으로 채웁니다. 전체 절단 절차 동안 버블링을 계속합니다.
    4. 조직-칼날 방향에 따라 관상 또는 시상 조각을 300μm 두께로 절단하여 모든 피질층과 가능한 경우 백질을 포함합니다. RT에서 버블링 절단 용액이 있는 수집 챔버에 슬라이스를 놓습니다.
      참고: 백질 쪽에서 피질 표면을 향해 자릅니다. 조직이 손상될 수 있으므로 수막을 제거하지 마십시오. 절단 날은 일반적으로 쉽게 절단됩니다.
    5. 모든 조직이 절단되면 RT에서 헹굼 용액과 함께 멸균 페트리 접시에 슬라이스를 옮기고 세포 배양 실험실로 운반합니다. 이 단계는 배양 플레이트로 옮기기 전에 조각에서 과도한 자당을 제거하는 데 필요합니다.
      알림: 슬라이스를 옮기려면(이 단계와 다음 단계에서) 거꾸로 된 유리 피펫을 사용하고 더 얇은 부분을 떼어낸 다음 흡입을 위해 고무 젖꼭지를 놓습니다.
  4. hACtx 조직 절편의 배양 및 유지
    1. 이미 젖고 물에 잠긴 인서트 위에 조직 조각을 개별적으로 놓습니다. 24시간 후, 배지를 교체하여 절단 절차에서 남아 있는 자당 또는 기타 잔류 물질을 추가로 제거합니다.
    2. 배양 배지를 7일마다 새로운 배지로 교체하십시오. 2주 후, 겐타마이신이 없는 hACtx 배지를 사용한다. 문화는 최대 2 개월 동안 유지 될 수 있습니다.
      참고: 배지 교체 전 최소 2시간 동안 37°C 및 5% CO2 에서 배양기에서 hACtx 배지를 평형화합니다. 신선한 배지는 2 주마다 준비해야합니다. 2-3일마다 슬라이스를 확인하고 일부 매체가 증발한 경우 인서트 상단에 더 추가합니다.
절단 솔루션재고 농도최종농도 [mM]1L 당
자당가루20068.46 그램
나코3가루211.76 그램
케이씨엘가루30.22 그램
NaH2PO4가루1.250.17 그램
포도당가루101.80 그램
마그네슘41 미터22 밀리리터
CaCl21 미터1.61.6 밀리리터
마그네슘22 미터21 mL

표 1: 절단 용액의 구성. MgCl2 및CaCl2는 탈이온수에서 미리 준비된 1M 용액으로 사용됩니다.

헹굼 용액재고 농도최종 농도100mL당
증권 시세 표시기1배95 mL
펜스트렙10,000 U/mL500 U/mL5 mL
헤페스가루4.76g/리터476의 mg의
포도당가루2g/리터200.6의 mg의

표 2 : 헹굼 용액의 조성.

hACtx 매체재고 농도최종 농도100mL당
페놀 레드가 없는 신경 배지97.4 mL의재료 표 참조
나2750배1:502 밀리리터
L-글루타민100배1:200500 μL재료 표 참조
겐타마이신50 밀리그램/mL1:1000100 μL

표 3: hACtx 배지의 조성.

2. lt-NES 세포의 증식 및 분화

참고: Lt-NES 세포는 앞서 설명한 바와 같이 생성되고,21,22 구성적 프로모터(GFP-lt-NES 세포) 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 운반하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입됩니다. 3 x 106 세포를 함유하는 바이알은 사용 전까지 -150°C에서 보관된다.

  1. 원액 및 배지 준비
    1. 100μg의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 PBS-0.1% BSA 10mL에 희석하여 스톡 농도가 10μg/mL가 되도록 합니다. 100 μL 분취량을 준비합니다.
    2. PBS-0.1% BSA 10mL에 표피 성장 인자(EGF) 100μg을 희석하여 스톡 농도가 10μg/mL가 되도록 합니다. 100 μL 분취량을 준비합니다.
    3. 분취량 당 100 μL의 부피로 분취량 50x B27 보충.
    4. 100mg의 폴리-L-오르니틴을 탈이온수 100mL에 희석하여 스톡 농도가 100μg/mL가 되도록 합니다. 1mL 분취량을 만듭니다.
    5. 1.20mg/mL 마우스 라미닌 30μL 분취액을 준비합니다.
    6. 10mL의 트립신-EDTA(0.25%)를 90mL의 PBS에 0.025%의 스톡 농도로 희석합니다. 1mL 분취량을 준비합니다.
    7. 트립신 억제제 0.025g을 PBS 50mL에 0.5mg/mL의 스톡 농도로 희석합니다. 1mL 분취량을 준비합니다.
    8. 10μg의 Wnt3a(날개 없는 유형 MMTV 통합 부위 패밀리 구성원 3A)를 PBS-0.1% BSA 1mL에 희석하여 스톡 농도가 10μg/mL가 되도록 합니다. 같은 방법으로 BMP4 (뼈 형태 형성 단백질 4)를 준비하십시오. 100 μL 부피의 분취량.
    9. 1mg의 시클로파민을 2.5mL의 DMSO에 희석하여 최종 농도 400μg/mL로 만들고 100μL 분취량을 만듭니다.
    10. 염기성 배지(표 4)와 분화 정의 배지(DDM, 표 5)를 준비하고 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
  2. 문화 접시의 코팅
    1. 증식 또는 분화 중에 GFP-It-NES 세포를 배양하기 위해 접시를 미리 코팅하려면 폴리-L-오르니틴을 탈이온수에 1:100으로 희석하고 용액 5mL를 T25 플라스크에 추가합니다. RT에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    2. 폴리-L-오르니틴 코팅 플레이트를 탈이온수로 1x, PBS로 1x로 세척합니다.
    3. 증식 중인 GFP-It-NES 세포의 경우 마우스 라미닌을 PBS에서 1:500으로 희석하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 분화 중인 GFP-It-NES 세포의 경우 마우스 라미닌을 PBS에서 1:100으로 희석하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
  3. GFP-lt-NES 세포의 증식
    1. 5mL(세척용)와 5mL(파종용)의 염기성 배지를 두 개의 서로 다른 15mL 튜브에 담아 따뜻하게 합니다.
    2. GFP-lt-NES 세포 바이알 하나를 37°C에서 빠르게 해동하고, 세척 튜브로 옮기고, 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
    3. 펠릿을 건드리지 않고 배지를 조심스럽게 흡인하고 예열된 기본 배지 1mL에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 EGF(10ng/mL), bFGF(10ng/mL) 및 B27(10ng/mL)과 같은 증식 인자로 보충된 염기성 배지가 들어 있는 파종 튜브로 옮깁니다. 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 T25 플라스크에 세포를 시드합니다.
    4. 매일 세포에 증식 인자를 공급하십시오. 매체가 노란색으로 바뀌면 교체하십시오. 세포를 3일 또는 4일마다 통과시킵니다(100% 밀도에 도달한 후 1일).
  4. 증식 및 분화를 위한 GFP-lt-NES 세포 분할
    1. 플라스크당 5mL의 기본 배지(세포 수집용)와 다시 시드하는 데 필요한 총 부피를 미리 예열합니다.
      참고: 계대배양은 세포의 증식을 유지하기 위해 1:3 희석으로 이루어지며, 15mL의 염기성 배지가 필요하고, 분화를 시작하기 위해 1:6 희석으로 이루어지며, 30mL의 염기성 배지가 필요합니다.
    2. 흡인에 의해 세포 배양 플라스크로부터 배지를 제거하고, 예열된 0.025% 트립신 500 μL를 첨가한다. RT에서 5-10 분 동안 배양하십시오. 세포의 분리는 10x 배율의 표준 광학 현미경으로 확인할 수 있습니다.
    3. 같은 부피의 트립신 억제제(최종 농도 0.5mg/mL)를 추가한 다음 따뜻한 염기성 배지 5mL를 추가합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분리하고 수집합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다 .
    4. 세포를 증식 상태로 유지하려면 증식 인자가 보충된 새로운 염기성 배지에서 1:3 희석으로 다시 도금하고 2.3.4단계를 반복합니다.
  5. GFP-lt-NES 세포의 피질 분화
    1. 0일째에 증식 인자가 보충된 염기성 배지 30mL에 세포(분화에 사용됨)를 재현탁하고 분화 코팅된 T25 플라스크 6개(분할 1:6)에 플레이트합니다.
    2. 1일째에 배지의 절반을 DDM으로 변경하고 농도의 절반에 증식 인자를 추가합니다.
    3. 2일째에 배지를 분화 인자인 BMP4(10ng/mL), Wnt3a(10ng/mL) 및 시클로파민(400ng/mL)이 보충된 DDM으로 완전히 변경합니다.
    4. 4일차에는 미분 요인만 추가합니다. 매체가 노란색으로 바뀌면 교체하십시오.
    5. 6일째에 배지를 BMP4 및 Wnt3a가 보충된 DDM으로 변경합니다. 사이클로파민은 이 단계에서 제거된다.
    6. 7일째에 2.4.2단계와 2.4.3단계에서 설명한 대로 셀을 분리합니다.
베이직 미디엄재고 농도최종 농도100mL당
L-글루타민이 포함된 DMEM/F121배98.7 mL의
N-2 보충제100배1:1001 mL
포도당45%3.5mL/L350 μL

표 4: lt-NES 세포의 증식 배지(염기성 배지)의 조성.

DDM 매체재고 농도최종 농도100mL당
L-글루타민이 포함된 DMEM/F1296 mL의
N2100 배1:1001 mL
네아100 배1:1001 mL
소듐 피루브산100 밀리엠1:1001 mL
BSA V 분획7.5%6.6mL/L660 μL
2-메르캅토에탄올50 나노미터7 μL/L0.7 μL
포도당45%3.2mL/L320 μL

표 5: lt-NES 세포의 분화 정의 배지(DDM)의 조성.

3. GFP-lt-NES 세포를 기관형 hACtx 슬라이스로 이식

참고: hACtx 조직은 세포 이식 전 1주일 동안 배양해야 합니다. 이식 절차를 용이하게하기 위해, 조직이 부유하는 것을 방지하기 위해 삽입물의 상단에서 2 mL의 hACtx 배지를 제거 할 필요가있다.

  1. 피질로 프라이밍된 GFP-lt-NES 세포(2.5.6단계부터)를 1 x 105 cells/μL의 농도로 차가운 순수 기저막 매트릭스(재료 표 참조)에 재현탁하고 용액을 더 작은 멸균 튜브로 옮깁니다.
    참고: 이식 절차 중에 모든 재료(피펫 팁, 튜브, 모세관 등)는 겔 응고를 방지하기 위해 미리 냉각되어야 합니다. 사용하기 전에 기저막 매트릭스 젤을 얼음에서 30분 동안 해동합니다.
  2. 흡입을 위해 고무 젖꼭지에 연결된 차가운 유리 모세관에 세포 현탁액을 수집합니다. 세포 현탁액을 작은 방울(각각 약 1μL)로 주입하여 반건조 조직 조각을 다양한 부위에 찔러 넣습니다.
  3. 겔이 고형화될 때까지 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이터에서 후드로 플레이트를 다시 옮기고 인서트 상단에 hACtx 배지 2mL를 조심스럽게 추가하여 조직을 완전히 잠급니다.
  4. 일주일에 한 번 배양 배지를 신선한 hACtx 배지로 교체하십시오.

4. 검증

  1. hACtx 슬라이스의 염색
    1. 원하는 시점에서, 세포 배양 실험실에서 슬라이스를 꺼내고, PBS가 함유된 페트리 접시에 담가 삽입물로부터 제거한다. 그런 다음 반전 유리 피펫(단계 1.3.5의 참고 참조)을 사용하여 슬라이스를 염색 바이알로 옮기고 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
    2. 매번 KPBS로 15분 동안 3x 헹구고, 투과화 용액(KPBS 중 0.02% BSA 및 1% Triton X-100)으로 4°C에서 밤새 배양합니다.
    3. 다음날, 블로킹 용액(0.2% 트리톤 X-100, 1% BSA, 아지드화나트륨[1:10,000] 및 10% 정상 당나귀 혈청을 함유한 KPBS)을 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다.
    4. 블로킹 후, 블로킹 용액에 희석된 1차 항체(희석에 대해서는 표 6 참조)를 추가하고, 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
    5. 세럼을 첨가하지 않고 블로킹 용액으로 각각 15분 동안 3회 세척합니다. 블로킹 용액에 희석된 2차 항체를 추가하고(희석에 대해서는 표 6 참조), 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
    6. 혈청 없이 블로킹 용액으로 3x 세척하고 투과화 용액(1:1,000)에 희석된 Hoechst 염색에서 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
    7. KPBS로 3 번 씻고 페인트 브러시를 사용하여 유리 슬라이드에 슬라이스를 장착 한 다음 건조시킵니다. 마지막으로 슬라이드를 탈이온수로 헹구고 여분의 물을 제거하고 장착 매체를 추가하고 유리 커버슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 RT에서 최소 24시간 동안 보관하고 이미징될 때까지 4°C에서 보관합니다.
      참고: 핵 에피토프를 표지하는 항체의 경우 65°C에서 2시간 동안 구연산나트륨(10mM, pH 6.0)으로 투과화(단계 4.1.2) 전에 항원 검색을 수행합니다.
  2. 전체 셀 패치 클램프
    1. 기록 당일, 인간의 뇌 환경에 더 잘 맞도록 변형된 인간 인공 뇌척수액(haCSF) 1L를 준비합니다(표 7). 절단 용액과 유사하게, CaCl 2를 제외한 모든 성분을 탈 이온수에 용해시킨 약 900mL의 용액을 만들고, 적절한 부피의 1M CaCl2 용액을 첨가하기 전에 15 분 동안 카보겐으로 버블링한다. 부피 플라스크를 1L 표시까지 채우고 기록을 시작하기 전과 실험 내내 추가로 15분 동안 RT에서 버블링을 계속합니다.
    2. 조직 조각을 배양 플레이트에서 2mL/분의 관류 속도로 버블링된 haCSF로 지속적으로 관류되고 수조 온도 조절기를 사용하여 34°C로 가온되는 직립 현미경의 무대에 있는 기록 챔버로 옮깁니다.
    3. 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 평균 저항 3-5MΩ으로 당기고, 기록된 세포의 사후 식별을 위해 새로 첨가된 2-4mg의 바이오시틴으로 K-글루코네이트 기반 내부 용액(표 8)으로 모세관을 다시 채웁니다. 이 내부 용액의 pH와 삼투압은 각각 7.2-7.3 및 285-295mOsm입니다.
    4. 숙주 세포 기록의 경우, 4x 대물렌즈로 슬라이스를 대략적으로 살펴보고, 40x 대물렌즈로 패치할 건강해 보이는 셀을 찾습니다. 그런 다음 표준 전체 셀 패치 클램프로 진행합니다.
    5. 이식 세포 기록의 경우, 이식편에서 GFP 리포터 발현에 의해 청색 범위(460 nm)의 4x 목적 및 에피형광 필터를 사용하여 이식된 세포로 조직 면적을 식별하였다. 그런 다음 40x 대물렌즈로 위치한 영역을 확대하고 표준 전체 세포 패치 클램프에 대해 GFP를 발현하는 이식된 세포를 찾습니다.
    6. 셀에 침입한 직후 휴지막 전위(RMP)를 확인하고 녹음 품질이 좋은지 확인하십시오. 관심 있는 모든 파라미터(예: 멤브레인 저항[Ri], AP 파라미터, 나트륨 및 칼륨 전류, 시냅스 활성)를 전체 셀 전압 또는 전류 클램프 구성으로 기록합니다.
    7. 필요한 모든 데이터를 수집한 후, 세포를 더 이상 손상시키지 않고 기록 피펫을 조심스럽게 집어넣어 사후 면역염색으로 식별할 수 있도록 합니다.
    8. 4.1 단계에 설명된 대로 추가 고정 및 염색을 위해 슬라이스를 4% PFA 용액으로 옮깁니다. 스트렙타비딘은 기록 중에 바이오시틴으로 채워진 세포를 면역표지하는 데 사용됩니다.
항 체희석노트 
본래의
치킨 안티 GFP1:1000
치킨 안티 MAP21:1000
염소 항 -AiF11:100
마우스 안티 MBP1:1000항원 회수 필요
마우스 안티-SC1231:2000
토끼 안티 NeuN1:1000
토끼 anti-Olig21:500
토끼 항-TMEM1191:200
보조
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG1:500
488 접합 AffinityPure 당나귀 항토끼 IgG1:500
488 결합 AffinityPure 당나귀 안티 치킨 IgG1:500
Cy3 공액 친화력순수 당나귀 안티 치킨 IgG1:500
Cy3 결합 친화력순수 당나귀 항염소 IgG1:500
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG1:500
Alexa fluor 647 복합 스트렙타비딘1:500

표 6: 면역조직화학을 위한 1차 및 2차 항체 목록.

haCSF재고 농도최종농도 [mM]1L 당
염화나트륨(NaCl)가루1297.54 그램
나코3가루211.76 그램
포도당가루101.80 그램
케이씨엘가루30.22 그램
NaH2PO4가루1.250.17 그램
마그네슘41 미터22 밀리리터
CaCl21 미터1.61.6 밀리리터

표 7: 인공 뇌척수액(haCSF)의 조성.

K-글루코네이트 내부 용액재고 농도최종농도 [mM]100mL당
K-글루코네이트가루122.52.87 그램
케이씨엘가루12.593.18의 mg의
염화나트륨(NaCl)가루846.76 밀리그램
헤페스가루10238.32 밀리그램
마그네슘 ATP가루2101.4의 mg의
Na3GTP (나3GTP)가루0.317.0의 mg의
메모: KOH/HCl로 pH 조정

표 8: K-글루콘산계 내부 용액의 조성.

결과

기술된 프로토콜에 따라, 측두엽 간질이 있는 환자로부터의 hACtx 조직을 상기 설명된 바와 같이 수집 및 처리하였다. 몇 개의 슬라이스를 숙주 조직의 시작점을 연구하기 위해 배양 24시간 후에 고정시켰다. 뉴런(NeuN 및 Map2 발현, 그림 1A), 희소돌기아교세포(Olig2 및 MBP, 그림 1B) 및 성상교세포(인간 특이적 GFAP, STEM123이라고도 함, 그림 1C)와 같은 다양한 신경 세포 집단을 분석

토론

충분히 높은 품질의 hACtx 슬라이스를 얻는 것이 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 피질 조직은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻어진다24. 절제된 조직의 품질과 절제와 배양 사이의 조직 노출 시간은 매우 중요합니다. 조직이 수술실에서 실험실로 더 빨리 옮겨지고 절단될수록 기관형 배양이 더 최적화됩니다. 이상적으로는 조직을 절단하여 수집 후 처...

공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 스웨덴 연구 위원회(Swedish Research Council), 스웨덴 뇌 재단(Swedish Brain Foundation), 스웨덴 뇌졸중 재단(Swedish Stroke Foundation), 스코네(Skåne) 지역, 토르스텐 및 엘사 세게르팔크 재단(Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation), 스웨덴 정부의 전략 연구 분야 이니셔티브(StemTherapy)의 보조금으로 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Bath temperature controller Luigs & NeumannTC0511354
Calcium Chloride dihydrateMerck102382
Carbogen gasAir LiquideNA
CoolerJulaba FL 3009661012.03
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Double Patch-Clamp amplifierHEKA electronicEPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium saltMillipore371701
HEPESAppliChemA1069
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670
Magnesium Sulfate heptahydrateSigma-Aldrich230391
PatchmasterHEKA electronicPatchmaster 2x91
Pipette PullerSutterP-2000
Plastic Petri dishAny suitable
Potassium chlorideMerck104936
Potassium D-gluconateThermoFisherB25135
Rubber teat + glass pipetteAny suitable
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateMerck106346
SucroseSigma-AldrichS7903
Tissue adhesive: Acryl super glueLoctite2062278
Upright microscopeOlympusBX51WI 
Vibratome LeicaVT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed)ThermoFisher Scientific14175095
HEPESAppliChemA1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plateThermoFisher Scientific140675
Alvetex scaffold 6 well insertReinnervate LtdAVP004-96
B27 Supplement (50x)ThermoFisher Scientific17504001
BrainPhys without Phenol RedStemCell technologies#05791Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mLCorning SigmaCLS431096/97
ForcepsAny suitable
Gentamicin (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific15750037
Glutamax Supplement (100x)ThermoFisher Scientific35050061Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipetteAny suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Animal Free Recombinant EGFPeprotechAF-100-15
B27 Suplemment (50x)Thermo Fisher Scientific17504001
bFGFPeprotechAF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)ThermoFisher Scientific15260037
Cyclopamine, V. calcifornicumCalbiochem# 239803
D (+) Glucose solution (45%)SigmaG8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2438-10mL
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-144Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, NaturalThermo Fisher Scientific23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x)ThermoFisher Scientific11140050
N-2 Supplement (100 x)ThermoFisher Scientific17502001
Poly-L-OrnithineMerkP3655
Recombinant Human BMP-4 ProteinR&D Systems314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a ProteinR&D Systems5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powderThermo Fisher Scientific17075029
Sterile deionized waterMilliQMilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%)SigmaT4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µLEppendorfVarious
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel)CorningCLS354277-1EA
CentrifugeHettich CentrifugenRotina 420R5% CO2, 37 °C
IncubatorThermoForma Steri-Cult CO2HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mmVitrolife14601
Sterile tubesSarstedtVarious
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mmVWR612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µLBiotix VWRVarious
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mLCostarVarious
T25 flasks NuncThermoFisher Scientific156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoReserach715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoReserach711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgGJackson ImmunoReserach703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated StreptavidinJackson ImmunoReserach016-600-084
Bovine Serum AlbuminJackson ImmunoReserach001-000-162
Chicken anti-GFPMerk MilliporeAB16901
Chicken anti-MAP2 Abcamab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgGJackson ImmunoReserach703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgGJackson ImmunoReserach705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoReserach715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO)Sigma AldrichD27802Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal) BioradAHP2024
Hoechst 33342Molecular ProbesNuclear staining
Mouse anti-MBP BioLegend808402
Mouse anti-SC123 Stem Cells IncAB-123-U-050
Normal Donkey SerumMerk MilliporeS30-100
Paint brushAny suitable
Paraformaldehyde (PFA)Sigma Aldrich150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
     Distilled water
     Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4)Merk Millipore104873
     Potassium phospate dibasic (K2HPO4)Sigma AldrichP3786
     Sodium chloride (NaCl)Sigma AldrichS3014
Rabbit anti-NeuN Abcamab104225
Rabbit anti-Olig2 Abcamab109186
Rabbit anti-TMEM119 Abcamab185333
Sodium azideSigma AldrichS2002-5G
Sodium citrate
       Distilled water
       Tri-Sodium CitrateSigma AldrichS1804-500G
       Tween-20Sigma AldrichP1379
Triton X-100ThermoFisher Scientific327371000 
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscopeZeissLSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mmVWR630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mmMarienfeld107242
Microscope SoftwareZeissZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipetteAny suitable

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