In This Article

Summary

Ten protokół opisuje długoterminowe hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej w połączeniu z dokorowym przeszczepem ex vivo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych, które prezentują nowatorską metodologię do dalszego testowania terapii opartych na komórkach macierzystych dla ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Abstract

Zaburzenia neurodegeneracyjne są powszechne i niejednorodne pod względem objawów i wpływu na komórki, co komplikuje ich badanie z powodu braku odpowiednich modeli zwierzęcych, które w pełni naśladują ludzkie choroby i słabej dostępności pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Posiewy tkanek nerwowych u dorosłych ludzi dają możliwość zbadania różnych aspektów zaburzeń neurologicznych. W tym systemie można łatwo zająć się mechanizmami molekularnymi, komórkowymi i biochemicznymi, a także testować i walidować leki lub różne metody leczenia, takie jak terapie komórkowe. Metoda ta łączy długoterminowe organotypowe hodowle kory mózgowej dorosłego człowieka, uzyskane od pacjentów z padaczką poddawanych operacji resekcyjnej, oraz dokorowe przeszczepienie ex vivo indukowanych pluripotencjalnych komórek progenitorowych kory mózgowej pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda ta pozwoli na badanie przeżycia komórek, różnicowania neuronów, tworzenia synaptycznych wejść i wyjść oraz właściwości elektrofizjologicznych komórek pochodzących od człowieka po przeszczepieniu do nienaruszonej tkanki korowej dorosłego człowieka. Podejście to jest ważnym krokiem przed opracowaniem platformy 3D do modelowania chorób u ludzi, która przybliży badania podstawowe do klinicznego przełożenia terapii opartych na komórkach macierzystych na pacjentów z różnymi zaburzeniami neurologicznymi i umożliwi opracowanie nowych narzędzi do rekonstrukcji uszkodzonych obwodów neuronalnych.

Introduction

Zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera lub udar niedokrwienny, to grupa chorób, które mają wspólną cechę nieprawidłowego działania neuronów lub śmierci. Są niejednorodne pod względem obszaru mózgu i populacji neuronów, których dotyczy problem. Niestety, metody leczenia tych chorób są rzadkie lub mają ograniczoną skuteczność ze względu na brak modeli zwierzęcych, które naśladują to, co dzieje się w ludzkim mózgu1,2. Terapia komórkami macierzystymi jest jedną z najbardziej obiecujących strategii regeneracji mózgu3. Generowanie neuronalnych komórek progenitorowych z komórek macierzystych pochodzących z różnych źródeł zostało znacznie rozwinięte w ostatnich latach4,5. Ostatnie publikacje wykazały, że długoterminowe samoodnawiające się neuronabłonkowe komórki macierzyste (lt-NES) pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), zgodnie z protokołem różnicowania kory mózgowej i po przeszczepie dokorowym w modelu szczurzym z udarem niedokrwiennym wpływającym na korę somatosensoryczną, generują dojrzałe neurony korowe. Ponadto neurony pochodzące z przeszczepu otrzymały aferentne i odprowadzające połączenia synaptyczne z neuronów gospodarza, co wskazuje na ich integrację z siecią neuronalną szczura6,7. Aksony pochodzące z przeszczepu zostały zmielinizowane i znalezione w różnych obszarach mózgu szczura, w tym w obszarze okołozawałowym, ciele modzelowatym i przeciwległej korze somatosensorycznej. Co najważniejsze, przeszczep z komórek iPS odwrócił deficyty motoryczne u zwierząt po udarze7.

Nawet jeśli modele zwierzęce pomagają badać przeżywalność przeszczepów, integrację neuronów i wpływ przeszczepionych komórek na funkcje motoryczne i poznawcze, w tym systemie brakuje informacji o interakcji między komórkami ludzkimi (przeszczep-gospodarz) 8,9. Z tego powodu opisano w niniejszym artykule połączoną metodę długotrwałej hodowli organotypowej ludzkiego mózgu z przeszczepem ex vivo ludzkich komórek progenitorowych neuronów pochodzących z komórek iPS. Hodowle organotypowe ludzkiego mózgu uzyskane z resekcji neurochirurgicznych są fizjologicznie istotnymi modelami 3D mózgu, które pozwalają naukowcom lepiej zrozumieć obwody ośrodkowego układu nerwowego człowieka i najdokładniejszy sposób testowania metod leczenia zaburzeń ludzkiego mózgu. Nie przeprowadzono jednak wystarczających badań w tym kontekście, a w większości przypadków wykorzystano kultury organotypowe ludzkiego hipokampa w mózgu10,11. Kora mózgowa jest dotknięta kilkoma zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak udar niedokrwienny12 lub choroba Alzheimera13, dlatego ważne jest, aby mieć system 3D kory mózgowej człowieka, który pozwala nam poszerzać naszą wiedzę oraz testować i walidować różne strategie terapeutyczne. W kilku badaniach przeprowadzonych w ciągu ostatnich kilku lat wykorzystano kultury z tkanki korowej dorosłego człowieka (hACtx) do modelowania chorób ludzkiego mózgu14,15,16,17,18,19; Dostępne są jednak ograniczone informacje na temat terapii komórkami macierzystymi. Dwa badania wykazały już wykonalność opisanego tutaj systemu. W 2018 r. wykazano, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste zaprogramowane różnymi czynnikami transkrypcyjnymi i przeszczepione do tkanki hACtx dają początek dojrzałym neuronom korowym, które mogą zintegrować się z sieciami korowymi dorosłego człowieka20. W 2020 r. przeszczepienie komórek lt-NES do ludzkiego układu organotypowego ujawniło ich zdolność do różnicowania się w dojrzałe, specyficzne dla warstwy neurony korowe o elektrofizjologicznych właściwościach funkcjonalnych neuronów. Przeszczepione neurony nawiązały zarówno aferentne, jak i odprowadzające kontakty synaptyczne z ludzkimi neuronami korowymi w wycinkach dorosłego mózgu, co zostało potwierdzone przez wsteczne śledzenie monosynaptyczne wirusa wścieklizny, zapisy klamr łatkowych całych komórek i mikroskopię immunoelektronową21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi zatwierdzonymi przez Regionalny Komitet Etyczny, Lund, Szwecja (numer zezwolenia etycznego 2021-07006-01). Zdrową tkankę kory nowej pozyskano od pacjentów poddawanych planowym zabiegom chirurgicznym z powodu padaczki skroniowej. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.

UWAGA: Wszystkie uzyskane tkanki zostały przetworzone, niezależnie od ich wielkości. Jednak tkanki mniejsze niż 1-1,5 mm o rozmiarze3 będą technicznie trudne w obsłudze i cięciu za pomocą wibratomu.

1. Zbieranie, konserwacja, cięcie i powlekanie tkanek

  1. Preparaty w dniu poprzedzającym krojenie tkanek
    1. Przygotować 2 litry roztworu do cięcia (tabela 1) w kolbie miarowej. Rozpuść wszystkie składniki z wyjątkiem MgCl2 i CaCl2 w ~ 1,800 ml wody dejonizowanej i bąbelkuj gazem karbogenicznym przez 15 minut. Następnie dodać odpowiednie ilości 1 M roztworów MgCl2 i CaCl2 i kontynuować bulgotanie przez kolejne 15 minut. Na koniec napełnić kolbę do poziomu 2 l; Sprawdź pH i osmolarność i dostosuj w razie potrzeby. Zamrozić 2 x 350 ml przygotowanego roztworu i przechowywać resztę w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: pH i osmolarność wynoszą zazwyczaj odpowiednio 7,3-7,4 i 295-300 mOsm.
    2. Przygotować 100 ml roztworu płuczącego (Tabela 2). Rozpuść 476 mg HEPES i 200,6 mg glukozy w 100 ml HBSS uzupełnionym 5 ml penicyliny/streptomycyny. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C do 10 dni.
    3. Przygotować pożywkę do hodowli korowej u dorosłych ludzi (hACtx) (pożywka hACtx) (Tabela 3) i przefiltrować ją w laboratorium hodowli komórkowych pod wentylowanym kapturem. Pożywka składa się z pożywki neuronalnej bez czerwieni fenolowej (patrz tabela materiałów), suplementu witaminy B27, L-glutaminy (patrz tabela materiałów) i gentamycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  2. Przygotowanie w dniu operacji przed przybyciem próbek tkanek
    1. Sprawdź dostępność potrzebnego sprzętu i przestrzeni laboratoryjnej oraz dokładnie wyczyść wszystkie narzędzia chirurgiczne i wibratomizm (patrz tabela materiałów), a także przestrzeń na stole stołowym wodą destylowaną (bez detergentu), a następnie 70% etanolem. Pozostaw etanol do wyschnięcia na co najmniej 30 minut przed użyciem narzędzi i sprzętu.
    2. Rozdrobnić zamrożony roztwór do krojenia i bulgotać "zupę" z lodu i płynu gazem karbogenicznym przez 30 minut. Następnie szczelnie zamknij jeden z pojemników z rozdrobnionym roztworem "zupy" i umieść go w zamrażalniku. Zostanie on wykorzystany do pobrania tkanki z sali operacyjnej.
    3. Skalibruj wibratomium i ustaw parametry cięcia: prędkość 0,05 mm/s i wibracje 1,7 mm. Umieść komorę tnącą na stoliku wibratomowym i uruchom podłączoną do niego chłodnicę tak, aby komora miała stałą temperaturę −3 °C.
    4. Przygotuj komorę do zbierania plastrów z wkładkami, aby umieścić plastry tkanek i roztwór do krojenia, stale bulgocząc gazem karbogenicznym w temperaturze pokojowej (RT).
    5. W laboratorium hodowli komórkowych i pod wentylowanym kapturem umieść wkładki hodowlane na 6-dołkowej płytce za pomocą kleszczy. Dodaj 5 ml pożywki hACtx na dno wkładki, aż zetknie się z membraną, unikając tworzenia się pęcherzyków, i dodaj 2 ml na wierzch wkładki. Zachować równowagę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny przed przeniesieniem wycinków tkanki do wkładek.
  3. Procedury pobierania i krojenia tkanek
    1. Natychmiast po resekcji należy pobrać tkankę od pacjenta na sali operacyjnej, jeśli to możliwe, bezpośrednio do pojemnika z zamrożonym, bąbelkowym i rozdrobnionym roztworem do cięcia. Natychmiast przenieś zamknięty pojemnik na lód do obszaru cięcia w laboratorium.
    2. Zbadaj tkankę i zlokalizuj najlepszą powierzchnię do przyklejenia (patrz krok 1.3.3) do etapu cięcia wibratomu, biorąc pod uwagę orientację warstw korowych. W razie potrzeby przetnij nierówną powierzchnię skalpelem, aby łatwo było umieścić tkankę na stoliku w celu optymalnej orientacji plastru.
    3. Przyklej tkankę do stolika za pomocą kleju tkankowego (patrz Tabela materiałów), umieść ją w komorze krojenia i natychmiast napełnij komorę zimnym roztworem do cięcia bąbelkowego. Kontynuuj bulgotanie podczas całej procedury cięcia.
    4. Wytnij plastry koronalne lub strzałkowe, w zależności od ułożenia tkanka do ostrza, o grubości 300 μm, aby pomieścić wszystkie warstwy korowe i, jeśli to możliwe, istotę białą. Umieść plastry w komorze zbiorczej z bulgoczącym roztworem do krojenia w RT.
      UWAGA: Wytnij od strony istoty białej w kierunku powierzchni kory. Nie należy usuwać opon mózgowych, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki. Ostrze tnące zwykle łatwo je przecina.
    5. Po przecięciu całej tkanki przenieś plastry na sterylną szalkę Petriego z roztworem płuczącym w temperaturze pokojowej i przetransportuj je do laboratorium hodowli komórkowych. Ten krok jest konieczny, aby usunąć nadmiar sacharozy z plastrów przed przeniesieniem ich na płytkę hodowlaną.
      UWAGA: Aby przenieść plastry (w tym i następnych krokach), użyj pipety z odwróconego szkła, oderwij cieńszą część i umieść gumowy smoczek do odsysania.
  4. Hodowla i utrzymanie wycinków tkanek hACtx
    1. Pojedynczo umieść plastry chusteczki na już mokrych i zanurzonych wkładkach. Po 24 godzinach zmienić pożywkę, aby jeszcze bardziej usunąć pozostałości sacharozy lub innych pozostałości po procedurach cięcia.
    2. Pożywkę należy wymieniać na świeżą pożywkę co 7 dni. Po 2 tygodniach należy zastosować pożywkę hACtx bez gentamycyny. Kulturę można utrzymywać do 2 miesięcy.
      UWAGA: Równoważyć pożywkę hACtx w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny przed zmianą pożywki. Świeże podłoże należy przygotowywać co 2 tygodnie. Sprawdzaj plastry co 2-3 dni, a jeśli część podłoża wyparowała, dodaj więcej na wierzch wkładki.
szt. powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
Rozwiązanie do cięciaKoncentracja zapasówStężenie końcowe [mM]Na 1 l
sacharozaproszek20068,46 gr
NaHCO3proszek211,76 gr
Kclproszek30,22 gr
NaH2PO4proszekWydanie orzeczenia 1,250,17 gr
glukozaproszek101,80 grama
MgSO41 mlncyfra arabska2 ml
CaCl21 mln1.61,6 ml
MgCl22 mlncyfra arabska1 ml

Tabela 1: Skład roztworu do cięcia. MgCl2 i CaCl2 stosuje się jako wstępnie przygotowane roztwory 1 M w wodzie dejonizowanej.

)
Roztwór do płukaniaKoncentracja zapasówKońcowe stężenieNa 100 ml
HBSS (Sieć HBSS)1x95 ml
PenStrep (ang. PenStrep10 000 U/ml500 U/ml5 ml
HEPESYproszek4,76 g/l476 mg tabletki powlekania
glukozaproszek2 g/l200,6 mg tabletki powlekania

Tabela 2: Skład roztworu do płukania.

jedn.
hACtx średniKoncentracja zapasówKońcowe stężenieNa 100 ml
Pożywka neuronalna bez czerwieni fenolowej97,4 ml patrz tabela materiałów
B2750-krotnie1:502 ml
L-glutamina100x1:200500 μLpatrz tabela materiałów
Gentamycyna50 mg/ml1:1000100 μL

Tabela 3: Skład podłoża hACtx.

2. Proliferacja i różnicowanie komórek lt-NES

UWAGA: Komórki Lt-NES są generowane zgodnie z wcześniejszym opisem21,22 i transdukowane wektorem lentiwirusowym przenoszącym zielone białko fluorescencyjne (GFP) pod konstytutywnym promotorem (komórki GFP-lt-NES). Fiolki zawierające 3 x 106 komórek są przechowywane w temperaturze -150 °C do momentu użycia.

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych i pożywek
    1. Rozcieńczyć 100 μg podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) w 10 ml PBS-0,1% BSA, aby uzyskać stężenie podstawowe 10 μg/ml. Przygotować 100 μl porcji.
    2. Rozcieńczyć 100 μg naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) w 10 ml PBS-0,1% BSA, aby uzyskać stężenie podstawowe 10 μg/ml. Przygotować 100 μl porcji.
    3. Podwielokrotność 50x suplement B27 w objętości 100 μL na podwielokrotność.
    4. Rozcieńczyć 10 mg poli-L-ornityny w 100 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać stężenie podstawowe 100 μg/ml. Przygotować 1 ml porcji.
    5. Przygotować 30 μl podwielokrotności 1,20 mg/ml mysiej lamininy.
    6. Rozcieńczyć 10 ml trypsyny-EDTA (0,25%) w 90 ml PBS do stężenia podstawowego 0,025%. Przygotować 1 ml porcji.
    7. Rozcieńczyć 0,025 g inhibitora trypsyny w 50 ml PBS do stężenia podstawowego 0,5 mg/ml. Przygotować 1 ml porcji.
    8. Rozcieńczyć 10 μg Wnt3a (członek rodziny miejsc integracji MMTV typu bezskrzydłego 3A) w 1 ml PBS-0,1% BSA, aby uzyskać stężenie wyjściowe 10 μg/ml. Przygotuj BMP4 (białko morfogenetyczne kości 4) w ten sam sposób. Podwielokrotność w objętości 100 μl.
    9. Rozcieńczyć 1 mg cyklopaminy w 2,5 ml DMSO do końcowego stężenia 400 μg/ml i uzyskać 100 μl podwielokrotności.
    10. Przygotować pożywkę zasadową (tabela 4) i pożywkę zdefiniowaną przez różnicowanie (DDM, tabela 5) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  2. Powlekanie naczyń kulturowych
    1. Aby wstępnie pokryć szalki w celu hodowli komórek GFP-It-NES podczas proliferacji lub różnicowania, rozcieńczyć poli-L-ornitynę w stosunku 1:100 w wodzie dejonizowanej i dodać 5 ml roztworu do kolby T25. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
    2. Umyj płytki pokryte poli-L-ornityną 1x wodą dejonizowaną i 1x PBS.
    3. W przypadku komórek GFP-It-NES w fazie proliferacji należy rozcieńczyć mysią lamininę w stosunku 1:500 w PBS i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C. W przypadku różnicowania komórek GFP-It-NES należy rozcieńczyć mysią lamininę w stosunku 1:100 w PBS i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Proliferacja komórek GFP-lt-NES
    1. Ciepłe 5 ml (do mycia) i 5 ml (do wysiewu) podłoża zasadowego w dwóch różnych probówkach o pojemności 15 ml.
    2. Szybko rozmrozić jedną fiolkę z komórkami GFP-lt-NES w temperaturze 37 °C, przenieść je do probówki płuczącej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    3. Ostrożnie zassać pożywkę, nie dotykając osadu, i ponownie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża zasadowego. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wysiewającej zawierającej podłoże podstawowe uzupełnione czynnikami proliferacji: EGF (10 ng/ml), bFGF (10 ng/ml) i B27 (10 ng/ml). Wysiać komórki w kolbie T25 pokrytej poli-L-ornityną/lamininą.
    4. Codziennie karmić komórki czynnikami proliferacji. Wymień pożywkę, jeśli zmieni kolor na żółty. Komórki należy przechodzić co trzeci lub czwarty dzień (1 dzień po osiągnięciu 100% zbieżności).
  4. Podział komórek GFP-lt-NES w celu proliferacji i różnicowania
    1. Podgrzej 5 ml podłoża podstawowego na kolbę (w celu zebrania komórek) plus całkowita objętość potrzebna do ich ponownego wysiania.
      UWAGA: Pasaż odbywa się w rozcieńczeniu 1:3, aby utrzymać komórki w proliferacji, co wymaga 15 ml pożywki zasadowej, oraz w rozcieńczeniu 1:6, aby rozpocząć różnicowanie, wymagając 30 ml pożywki zasadowej.
    2. Usunąć pożywkę z kolby do hodowli komórkowej przez aspirację i dodać 500 μl wstępnie podgrzanej 0,025% trypsyny. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Oderwanie komórek można potwierdzić pod standardowym mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu.
    3. Dodać równą objętość inhibitora trypsyny (końcowe stężenie 0,5 mg/ml), a następnie 5 ml ciepłej pożywki zasadowej. Odłącz i zbierz komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 300 x g.
    4. Aby utrzymać komórki w stanie proliferacji, należy ponownie platerować w rozcieńczeniu 1:3 na świeżej pożywce zasadowej uzupełnionej czynnikami proliferacji i powtórzyć krok 2.3.4.
  5. Różnicowanie korowe komórek GFP-lt-NES
    1. W dniu 0 ponownie zawiesić komórki (do wykorzystania do różnicowania) w 30 ml pożywki zasadowej uzupełnionej czynnikami proliferacji i umieścić je w sześciu kolbach T25 pokrytych różnicowaniem (podzielonych 1:6).
    2. W pierwszym dniu zmień połowę pożywki na DDM i dodaj czynniki proliferacji w połowie ich stężenia.
    3. W 2 dniu należy całkowicie zmienić pożywkę na DDM uzupełnioną czynnikami różnicującymi: BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (10 ng/ml) i cyklopaminą (400 ng/ml).
    4. W dniu 4 dodaj same czynniki różnicujące. Wymień pożywkę, jeśli zmieni kolor na żółty.
    5. W dniu 6 zmień pożywkę na DDM uzupełnioną BMP4 i Wnt3a. Na tym etapie usuwa się cyklopaminę.
    6. W dniu 7 odłącz komórki, jak podano w kroku 2.4.2 i kroku 2.4.3.
Podstawowy ŚredniKoncentracja zapasówKońcowe stężenieNa 100 ml
DMEM/F12 z L-glutaminą1x98,7 ml
Suplement N-2100x1:1001 ml
glukoza45%3,5 ml/l350 μL

Tabela 4: Skład pożywki proliferacyjnej komórek lt-NES (podłoże podstawowe).

Średni DDMKoncentracja zapasówKońcowe stężenieNa 100 ml
DMEM/F12 z L-glutaminą96 ml
N2100 razy1:1001 ml
NEAA (Agencja Zdrowia)100 razy1:1001 ml
Pirogronian sodu100 mM1:1001 ml
Frakcja BSA V7,5%6,6 ml/l660 μL
2-merkaptoetanol50 nM7 μl/l 0,7 μl
glukoza45%3,2 ml/l320 μL

Tabela 5: Skład pożywki zdefiniowanej różnicowo (DDM) komórek lt-NES.

3. Przeszczepienie komórek GFP-lt-NES do organotypowych warstw hACtx

UWAGA: Tkanka hACtx powinna być hodowana przez 1 tydzień przed przeszczepem komórki. Aby ułatwić procedurę przeszczepu, konieczne jest usunięcie 2 ml pożywki hACtx z górnej części wkładki, aby zapobiec unoszeniu się tkanki.

  1. Ponownie zawiesić kory mózgowe komórki GFP-lt-NES (od kroku 2.5.6) w zimnej, czystej macierzy błony podstawnej (patrz Tabela materiałów) w stężeniu 1 x 105 komórek/μL i przenieść roztwór do mniejszej sterylnej probówki.
    UWAGA: Podczas procedury przeszczepu wszystkie materiały (końcówki pipet, rurki, kapilary itp.) powinny być wstępnie schłodzone, aby uniknąć zestalenia żelu. Rozmrozić żel matrycy błony podstawnej na lodzie przez 30 minut przed jego użyciem.
  2. Zbierz zawiesinę komórek do zimnej szklanej kapilary połączonej z gumowym smoczkiem w celu odsysania. Zawiesinę komórkową należy wstrzykiwać w postaci małych kropel (po ok. 1 μl każda), wbijając półsuchy wycinek tkanki w różne miejsca.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aż żel stężeje. Przenieś płytkę z inkubatora z powrotem do kaptura i ostrożnie dodaj 2 ml pożywki hACtx do górnej części wkładu, aby całkowicie zanurzyć tkankę.
  4. Raz w tygodniu należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką hACtx.

4. Walidacja

  1. Barwienie plastrów hACtx
    1. W pożądanym momencie wyjmij plastry z laboratorium hodowli komórkowych i wyjmij je z wkładki, zanurzając ją na szalce Petriego z PBS. Następnie przenieść plastry do fiolek do barwienia za pomocą pipety z odwróconego szkła (patrz UWAGA w kroku 1.3.5) i utrwalić je 4% paraformaldehydem (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Płukać 3x KPBS przez 15 minut za każdym razem i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z roztworem przepuszczalnym (0,02% BSA i 1% Triton X-100 w KPBS).
    3. Następnego dnia dodać roztwór blokujący (KPBS z 0,2% Triton X-100, 1% BSA, azydkiem sodu [1:10 000] i 10% normalną surowicą osła) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Po zablokowaniu dodać przeciwciała pierwszorzędowe (rozcieńczenia patrz tabela 6) rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
    5. Myć 3x roztworem blokującym bez dodawania serum przez 15 min każdy. Dodać przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym (rozcieńczenia patrz tabela 6) i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
    6. Przemyć 3x roztworem blokującym bez surowicy i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w barwie Hoechst rozcieńczonej w roztworze przepuszczalnym (1:1,000).
    7. Umyj 3x za pomocą KPBS, nałóż plastry na szkiełka za pomocą pędzla i pozostaw do wyschnięcia. Na koniec przepłucz szkiełka wodą dejonizowaną, usuń nadmiar wody, dodaj podłoże montażowe i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Preparaty należy przechowywać przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu wykonania obrazowania.
      UWAGA: W przypadku przeciwciał znakujących epitopy jądrowe, przed przepuszczalnością (etap 4.1.2) należy przeprowadzić pobieranie antygenu za pomocą cytrynianu sodu (10 mM, pH 6,0) przez 2 godziny w temperaturze 65 °C.
  2. Zacisk krosowy na całe ogniwa
    1. W dniu rejestracji należy przygotować 1 l ludzkiego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (haCSF), zmodyfikowanego tak, aby lepiej pasował do środowiska ludzkiego mózgu (Tabela 7). Podobnie jak w przypadku roztworu do cięcia, przygotować około 900 ml roztworu ze wszystkimi składnikami z wyjątkiem CaCl2 rozpuszczonymi w wodzie dejonizowanej i bąbelkować go karbogenem przez 15 minut przed dodaniem odpowiedniej objętości 1 M roztworu CaCl2. Napełnij kolbę miarową do oznaczenia 1 l i kontynuuj bulgotanie w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 15 minut przed rozpoczęciem zapisu i przez cały czas trwania eksperymentu.
    2. Przenieść wycinki tkanek z płytki hodowlanej do komory rejestracyjnej na stoliku pionowego mikroskopu, który jest stale perfuzjowany bąbelkowym haCSF z szybkością perfuzji 2 ml/min i ogrzewany do 34 °C za pomocą regulatora temperatury kąpieli.
    3. Pociągnąć szklane kapilary za pomocą ściągacza do pipet do średniej rezystancji 3-5 MΩ i wypełnić kapilary wewnętrznym roztworem na bazie K-glukonianu (Tabela 8) świeżo dodanymi 2-4 mg biocytyny w celu identyfikacji post-hoc zarejestrowanych komórek. pH i osmolarność tego wewnętrznego roztworu wynoszą odpowiednio 7,2-7,3 i 285-295 mOsm.
    4. W przypadku nagrywania komórek gospodarza, uzyskaj przybliżony przegląd wycinka za pomocą obiektywu 4x i znajdź zdrowo wyglądającą komórkę, którą chcesz załatać za pomocą obiektywu 40x. Następnie postępuj zgodnie ze standardowym zaciskiem krosowym na całe komórki.
    5. W przypadku zapisu przeszczepionych komórek należy zidentyfikować obszar tkanki z przeszczepionymi komórkami za pomocą obiektywu 4x i filtra epifluorescencyjnego w zakresie niebieskim (460 nm) poprzez ekspresję reporterową GFP w przeszczepie. Następnie powiększ zlokalizowany obszar za pomocą obiektywu 40x i znajdź przeszczepioną komórkę wykazującą ekspresję GFP dla standardowego zacisku krosowego na całe komórki.
    6. Sprawdź spoczynkowy potencjał błonowy (RMP) natychmiast po włamaniu do ogniwa i upewnij się, że jakość nagrania jest dobra. Zapisz wszystkie interesujące Cię parametry (np. rezystancję membrany [Ri], parametry AP, prądy sodowe i potasowe oraz aktywność synaptyczną) w konfiguracji napięcia całego ogniwa lub cęgów prądowych.
    7. Po zebraniu wszystkich niezbędnych danych należy ostrożnie schować pipetę rejestrującą, nie uszkadzając jej dalej komórki, tak aby można ją było zidentyfikować za pomocą barwienia immunologicznego post-hoc.
    8. Przenieś plasterek do 4% roztworu PFA w celu dalszego utrwalenia i barwienia, jak opisano w kroku 4.1. Streptawidyna jest stosowana do znakowania immunologicznego komórek wypełnionych biocytyną podczas nagrań.
jedn.
przeciwciałaRozcieńczeniuNotatki
podstawowy
Kurczak anty-GFP1:1000
Kurczak anty-MAP21:1000
Kozioł anty-AiF11:100
Mysz anty-MBP1:1000Konieczne pobranie antygenu
Mysz anty-SC1231:2000
Królik anty-NeuN1:1000
Królik anty-Olig21:500
Królik anty-Tmem1191:200
wtórny
488-sprzężone AffinityPure Donkey anty-mysie IgG1:500
488-sprzężone AffinityPure Donkey anty-królicze IgG1:500
488-sprzężone AffinityPure Donkey anty-kurczak IgG1:500
Cy3-sprzężone PowinowactwoPure Donkey anty-chicken IgG1:500
Powinowactwo sprzężone z Cy3Pure Donkey anty-kozie IgG1:500
Cy3-sprzężone PowinowactwoPure Donkey anty-mysie IgG1:500
Streptawidyna sprzężona z Alexa fluor 6471:500

Tabela 6: Lista pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał immunohistochemicznych.

powiedział: powiedział: powiedział:
haCSF (Płyn krzyżowy)Koncentracja zapasówStężenie końcowe [mM] Na 1 l
Zawartość NaClproszek129 Rozdział 1297,54 gr
NaHCO3proszek211,76 gr
glukozaproszek101,80 grama
Kclproszek30,22 gr
NaH2PO4proszekWydanie orzeczenia 1,250,17 gr
MgSO41 mlncyfra arabska2 ml
CaCl21 mln1.61,6 ml

Tabela 7: Skład sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (haCSF).

pkt.
Roztwór wewnętrzny K-glukonianu Koncentracja zapasówStężenie końcowe [mM] Na 100 ml
K-glukonianproszek122,52,87 gr
KclproszekRozdział 12,593,18 mg tabletki powlekania
Zawartość NaClproszek846,76 mg tabletki powlekania
HEPESYproszek10238,32 mg tabletki powlekania
MgATP (MgATP)proszekcyfra arabska101,4 mg tabletki powlekania
Na3GTP powiedział:proszek0,317,0 mg tabletki powlekania
Uwaga: Dostosuj pH za pomocą KOH/HCl

Tabela 8: Skład roztworu wewnętrznego na bazie K-glukonianu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Zgodnie z opisanym protokołem, pobrano i przetworzono tkankę hACtx od pacjenta z padaczką skroniową, jak wyjaśniono powyżej. Kilka wycinków utrwalono po 24 godzinach w hodowli w celu zbadania punktu wyjścia tkanki gospodarza. Analiza różnych populacji komórek nerwowych, takich jak neurony (wyrażające NeuN i Map2, Figura 1A), oligodendrocyty (Olig2 i MBP, Figura 1B) i astrocyty (GFAP specyficzny dla człowieka, nazwany również STEM123,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Uzyskanie wycinków hACtx o wystarczająco wysokiej jakości jest najważniejszym krokiem w tym protokole. Tkankę korową pozyskuje się od pacjentów z padaczką poddawanych zabiegom chirurgicznym24. Jakość wyciętej tkanki, a także czas ekspozycji tkanki między resekcją a hodowlą, mają kluczowe znaczenie; Im szybciej tkanka zostanie przeniesiona z sali operacyjnej do laboratorium i wycięta, tym bardziej optymalna będzie hodowla organotypowa. Idealnie byłoby, gdyby tka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

Ta praca jest wspierana przez granty ze Szwedzkiej Rady ds. Badań, Szwedzkiej Fundacji Mózgu, Szwedzkiej Fundacji Udaru Mózgu, Regionu Skane, Fundacji Thorsten i Elsy Segerfalk oraz Inicjatywy Rządu Szwedzkiego na rzecz Strategicznych Obszarów Badawczych (StemTherapy).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Cutting and Electrophysiology
Adenozyna 5'-trifosforan magnezu sól SigmaA9187
Regulator temperatury kąpieli Luigs & NeumannTC0511354
Chlorek wapnia dwuwodnyMerck102382
Gaz karbogenicznyAir LiquideNA
ChłodnicaJulaba FL 3009661012.03
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Wzmacniacz z podwójnym zaciskiem krosowymHEKA electronicEPC10
Guanozyna 5'-Trifosforanowa sól disodowaMillipore371701
HEPESAppliChemA1069
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-AldrichM2670
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma-Aldrich230391
Patchmaster HEKA electronicŚciągacz
SutterP-2000
Plastikowa szalka PetriegoDowolny odpowiedni
Chlorek potasuMerck104936
D-glukonian potasuThermoFisherB25135
Smoczek gumowy + szklana pipetaDowolna odpowiednia
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Diwodorofosforan sodu jednowodnyMerck106346
SacharozaSigma-AldrichS7903
Klej tkankowy: Super klej akrylowyLoctite2062278
Mikroskop pionowyOlympusBX51WI 
Wibratom LeicaVT1200 S
ROZTWÓR DO PŁUKANIA
D-(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
HBSS (bez Ca, Mg lub PhenolRed)ThermoFisher Scientific14175095
HEPESAppliChemA1069
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)ThermoFisher Scientific15-140-122
UTRZYMANIE I HODOWLA LUDZKIEJ TKANKI NOWEJ
6-dołkowa płytkaThermoFisher Scientific140675
Rusztowanie Alvetex 6-dołkowe wkładkiReinnervate LtdAVP004-96
B27 Suplement (50x)ThermoFisher Scientific17504001
BrainPhys bez technologii Phenol RedStemCell#05791Określany jako pożywka neuronalna w tekście
Jednostki filtrujące 250 ml lub 500 mlKleszcze Corning SigmaCLS431096/97
Dowolna odpowiednia
gentamycyna (50 mg/ml)Suplement ThermoFisher Scientific15750037
Glutamax (100x)ThermoFisher Scientific35050061Określany jako L-glutamina w tekście
Smoczek gumowy + pipeta szklanaDowolna odpowiednia
GENERACJA komórek lt-NES
2-merkaptoetanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Rekombinowany EGFPeprotechAF-100-15
B27 (50x)Thermo Fisher Scientific17504001
bFGFPeprotechAF-100-18B
Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór)ThermoFisher Scientific15260037
Cyklopamina, V. calcifornicumCalbiochem# 239803
D (+) Roztwór glukozy (45%)SigmaG8769
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2438-10mL
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320074
Bufor fosforanowy Dulbecco sól fizjologiczna (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-144Bez wapnia i magnezu
Białko myszy Laminin, naturalneThermo Fisher Scientific23017015
MEM Roztwory aminokwasów endogennych (100x)ThermoFisher Suplement Scientific11140050
N-2 (100 x)ThermoFisher Scientific17502001
Poli-L-OrnitynaMerkP3655
Rekombinowane ludzkie białko BMP-4R& D Systems314-BP-010
Rekombinowane ludzkie białko Wnt-3a R& D Systems5036-WN
Pirogronian sodu (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Inhibitor trypsyny sojowej, proszekThermo Fisher Scientific17075029
Sterylna woda dejonizowanaMilliQSystem filtrów MilliQ
Trypsyna EDTA (0,25%)SigmaT4049-500ML
SPRZĘT DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH 
Pipety o regulowanej objętości 10, 100, 200, 1000 i mikro; LEppendorfVarious
Matryca membrany podstawnej z certyfikatem ESC (Matrigel)Wirówka CorningCLS354277-1EA
Hettich CentrifugenRotina 420R5% CO2, 37 ° C
InkubatorThermoForma Steri-Cult CO2HEPA Class100
Narzędzie do cięcia komórek macierzystych 0,190-0,210 mmVitrolife14601
Sterylne probówkiSarstedtRóżne
sterylne jednorazowe szklane pipety Pasteura 150 mmVWR612-1701
Sterylne końcówki do pipet 0,1-1000   &mikro; LBiotix VWRRóżne
sterylne pipety serologiczne 5, 10, 25, 50 mlCostarRóżne
kolby T25 NuncThermoFisher Scientific156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-sprzężony AffinityPure Donkey anty-mysie IgGJackson ImmunoReserach715-545-151
488-sprzężone AffinityPure Donkey anty-królicze IgGJackson ImmunoReserach711-545-152
488-sprzężone AffinityPure Donkey anty-kurczak IgGJackson ImmunoReserach703-545-155
Alexa fluor 647-sprzężona StreptavidinJackson ImmunoReserach016-600-084
Albumina surowicy bydlęcejJackson ImmunoReserach001-000-162
Kurczak anty-GFPMerk MilliporeAB16901
Kurczak anty-MAP2 Abcamab5392
Cy3-sprzężone PowinowactwoCzysty osioł anty-kurczak IgGJackson ImmunoReserach703-165-155
Cy3-sprzężone PowinowactwoCzysty osioł anty-kozi IgGJackson ImmunoReserach705-165-147
Cy3-sprzężone PowinowactwoCzysty osioł anty-mysz IgGJackson ImmunoReserach715-165-151
Diazabicykloktan (DABCO)Sigma AldrichD27802Nośnik montażowy
Goat anty-AIF1 (C-terminal) BioradAHP2024
Hoechst 33342Sondy molekularneBarwienie jądrowe
Mysz anty-MBP Mysz BioLegend808402
anty-SC123 Stem Cells IncAB-123-U-050
Normalna surowica osłaMerk MilliporeS30-100
PędzelDowolny odpowiedni
paraformaldehyd (PFA)Sigma Aldrich150127
Bufor fosforanu potasu Sól fizjologiczna, KPBS (1x)
        Woda
        Fosforan diwodoru potasu (KH2PO4)Merk Millipore104873
        Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)Sigma AldrichP3786
        Chlorek sodu (NaCl)Sigma AldrichS3014
Królik anty-NeuN Abcamab104225
Królik anty-Olig2 Abcamab109186
Królik anty-TMEM119 Abcamab185333
Azydek soduSigma AldrichS2002-5G
Cytrynian
            Woda
            Cytrynian trójsodowySigma AldrichS1804-500G
            Tween-20Sigma AldrichP1379
Triton X-100ThermoFisher Scientific327371000 
SPRZĘT DO IMMUNOHISTOCHEMII
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 780
Szkiełka mikroskopowe 76 mm x 26 mmVWR630-1985
Szkiełka nakrywkowe do mikroskopów 24 mm x 60 mmMarienfeld107242
ZeissZEN Black edition
Gumowy smoczek + szklana pipetaDowolna odpowiednia
do pipet Patchmaster 2x91 destylowana sodu destylowana Oprogramowanie do mikroskopów

References

  1. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609(2020).
  2. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
  4. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
  5. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
  6. Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
  7. Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
  8. Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
  9. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  10. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050(2021).
  11. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  12. Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
  13. Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
  14. Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  15. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  16. Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
  17. Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54(2021).
  18. Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576(2021).
  19. Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249(2017).
  20. Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207(2017).
  21. Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
  22. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597(2012).
  23. Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
  24. Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
  25. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
  26. Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
  27. Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
  28. Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704(2021).
  29. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  30. Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417(2019).
  31. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  32. Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
  33. Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15(2018).
  34. Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Hodowle organotypowekora m zgowa doros ego cz owiekamodel ex vivoprzeszczep ludzkich kom rek macierzystychprzeszczepione ludzkie kom rkiobwody neuronoweci cie tkanekpod o e korowetechnika wibratomuodzyskiwanie funkcjonalnetranslacja klinicznalaboratorium hodowli kom rkowychprocedura ci cia