نموذج حرق الفئران لدراسة الحروق الحرارية الجلدية كاملة السماكة والعدوى

Summary

يعد النموذج الذي يحاكي السيناريو السريري لإصابة الحروق والعدوى ضروريا لتعزيز أبحاث الحروق. يوضح البروتوكول الحالي نموذجا بسيطا وقابلا للتكرار لعدوى حرق الفئران يمكن مقارنته بنظيره الموجود في البشر. هذا يسهل دراسة الحروق والالتهابات بعد الحرق لتطوير علاجات المضادات الحيوية الموضعية الجديدة.

Abstract

يتم وصف منهجيات تحريض الحرق بشكل غير متسق في نماذج الفئران. يعد نموذج جرح الحروق الموحد ، الذي يمثل السيناريو السريري ، ضروريا لإجراء أبحاث الحروق القابلة للتكرار. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإنشاء ~ 20٪ إجمالي مساحة سطح الجسم (TBSA) حروق كاملة السماكة في الفئران. هنا ، تم تطبيق قضيب نحاسي 22.89 سم² (قطر 5.4 سم) تم تسخينه عند 97 درجة مئوية في حمام مائي على سطح جلد الفئران للحث على إصابة الحرق. كان قضيب النحاس ذو الموصلية الحرارية العالية قادرا على تبديد الحرارة بشكل أعمق في أنسجة الجلد لإحداث حرق كامل السماكة. يظهر تحليل الأنسجة البشرة الموهنة مع تلف تجلط الدم إلى المدى الكامل للسمك الكامل للأدمة والأنسجة تحت الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، يمثل هذا النموذج الحالات السريرية التي لوحظت في مرضى الحروق في المستشفى بعد إصابة الحروق مثل عدم التنظيم المناعي والالتهابات البكتيرية. يمكن للنموذج تلخيص العدوى البكتيرية الجهازية بواسطة كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام. في الختام ، تقدم هذه الورقة نموذجا قويا وسهل التعلم لحرق الفئران يحاكي الحالات السريرية ، بما في ذلك عدم التنظيم المناعي والالتهابات البكتيرية ، وهو أمر ذو فائدة كبيرة لتطوير أدوية مضادات حيوية موضعية جديدة لجروح الحروق والالتهابات.

Introduction

تعد إصابات الحروق من بين أكثر أشكال الصدمات تدميرا ، حيث تصل معدلات الوفيات إلى 12٪ حتى في مراكز الحروق^{المتخصصة 1،2،3}. وفقا للتقارير المنشورة مؤخرا ، ~ 486,000 مريض حروق يحتاجون إلى رعاية طبية سنويا في الولايات المتحدة ، مع ما يقرب من 3,500 حالة وفاة 1,2,3,4,5,6. تفرض إصابة الحروق تحديا كبيرا لجهاز المناعة لدى المرضى وتخلق جرحا مفتوحا كبيرا ، وهو بطيء الشفاء ، مما يجعلهم عرضة للاستعمار الجلدي والرئوي والجهازي ببكتيريا المستشفيات والانتهازية. يرتبط عدم التنظيم المناعي جنبا إلى جنب مع العدوى البكتيرية بزيادة المراضة والوفيات في مرضى الحروق⁷.

يعد نموذج حرق الحيوانات والعدوى ضروريا لدراسة التسبب في الالتهابات البكتيرية بعد تلف الجلد وقمع المناعة المرتبط بصدمة الحروق. تتيح هذه النماذج تصميم وتقييم طرق جديدة لعلاج الالتهابات البكتيرية لدى مرضى الحروق. تشترك الفئران والبشر في خصائص فسيولوجية ومرضية جلدية متشابهة تم توثيقها مسبقا⁸. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفئران أصغر حجما ، مما يجعلها أسهل في التعامل معها ، وبأسعار معقولة ، وأسهل في الشراء والصيانة من النماذج الحيوانية الكبيرة.

هذه الخصائص تجعل الفئران حيوانا نموذجيا مثاليا لدراسة الحروق والالتهابات⁹. لسوء الحظ ، فإن تقنية تحريض الحرق غير متسقة وغالبا ما يتم وصفها بالحد الأدنى¹⁰،11،¹²،^13،14. تم تصميم البروتوكول الحالي لتطوير إجراء بسيط وفعال من حيث التكلفة وقابل للتكرار لإنشاء إصابة حروق كاملة السماكة متسقة في نموذج الفئران الذي يحاكي السيناريو السريري ويمكن استخدامه لتقييم قمع المناعة والعدوى البكتيرية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة نورث كارولينا وتم إجراؤها وفقا لإرشاداتها المعمول بها. تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague Dawley (250-300 جم) الذين تتراوح أعمارهم بين 7-9 أسابيع في التجارب. تم إيواء جميع الحيوانات في دورة 12 ساعة: 12 ساعة من الضوء والظلام مع حرية الوصول إلى الطعام والماء حسب الحاجة. اعمل دائما مع طبيبك البيطري المؤسسي حول خطة مسكنة قبل بدء الدراسة.

1. تحضير الفئران لإصابة الحروق

1. تحضير الحيوانات لإصابة الحروق قبل 24 ساعة من الحرق.
2. تخدير الفئران بنسبة 5٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ في غرفة الحث لمدة 5 دقائق (معدل التدفق: 2 لتر / دقيقة) حتى يتباطأ التنفس.
3. بمجرد تخدير الجرذ بعمق (لا يستجيب لقرصة إصبع القدم على جميع الأطراف) ، انقل الجرذ إلى وسادة تدفئة في وضع الانبطاح وقلل الأيزوفلوران إلى 1.5٪ في الأكسجين للصيانة من خلال مخروط الأنف.
4. لمنع جفاف القرنية بعد التخدير وأثناء العملية ، ضع مادة تشحيم العين على قرنيات كلتا العينين باستخدام قضيب ذو رأس قطني.
5. حلق المنطقة الظهرية للفأر باستخدام مقص كهربائي (انظر جدول المواد) وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الشعر في مستطيل كبير من لوحي الكتف وصولا إلى قاعدة الذيل (الشكل 2 أ).
6. نظف المنطقة المحلوقة بمنديل منقوع في محلول ملحي لمسح الشعر المتساقط. ضعي غسول إزالة الشعر على المنطقة المحلوقة باستخدام قضيب برأس قطني واتركيه لمدة ~ 3 دقائق.
   ملاحظة: تطبيق غسول إزالة الشعر المشار إليه لأكثر من 3 دقائق سيؤدي إلى ظهور طفح جلدي أحمر على الجلد.
7. امسح المنطقة بإسفنجة شاش مبللة مرتين لإزالة المستحضر ومنع تهيج الجلد.
8. قم بإيقاف تشغيل isoflurane ، وإزالة مخروط الأنف ، ووضع الفئران في قفص الانتعاش.
   ملاحظة: ضع وسادة تدفئة في قفص الاسترداد.
9. نقل الحيوان المستعاد إلى قفص سكن نظيف لإجراء الحرق في اليوم التالي (قد يستغرق الأمر ~ 10-15 دقيقة حتى يتعافى الجرذ من التخدير).

2. إحداث إصابة الحروق في الفئران

1. في يوم الحرق ، اضبط درجة حرارة حمام الماء على 97 درجة مئوية وضع جميع قضبان النحاس الأربعة (420 جم لكل منها ؛ الشكل 1) في حمام مائي 1 ساعة قبل تجربة الحرق للسماح للقضبان بالتسخين بشكل موحد.
   ملاحظة: يجب غمر القضبان في الماء. تحقق من دقة عرض درجة الحرارة الرقمية باستخدام مقياس حرارة قبل التجربة.
2. تخدير الفئران كما هو مذكور في القسم 1.
3. بمجرد أن لا يستجيب الجرذ لقرصة إصبع القدم على جميع الأطراف ، ضعه على وسادة تدفئة في وضع الانبطاح مع 1.5٪ إيزوفلوران في الأكسجين للصيانة (الشكل 2 أ).
4. حقن المورفين (20 ملغ/كغ من وزن الجسم) عبر الطريق داخل الصفاق (i.p.) للتحكم^{في الألم 6}.
5. تحقق من درجة حرارة الماء في حمام مائي. قم بإعداد المؤقت وارتداء القفازات المقاومة للحرارة.
6. أخرج قضيبا نحاسيا ساخنا من الحمام المائي ولمسه على المنطقة الظهرية للفأر لمدة 7 ثوان للحث على الحرق.
   ملاحظة: حافظ على مسافة لا تقل (10-15 سم) بين الحمام المائي والحيوان لتقليل فقد الحرارة ، ولا تضغط على القضبان أثناء إحداث الحرق (أي يجب الحفاظ على التلامس عن طريق الجاذبية).
7. ضع أربعة حروق ، باستخدام قضيب واحد لكل موقع حرق ، واحدا تلو الآخر مباشرة لإنتاج ما يقرب من 20٪ من حرق TBSA كامل التلامس (الشكل 2 ب).
8. بعد الحرق ، إنعاش الحيوان عن طريق حقن i.p. من محلول رينغر المرضع (0.1 مل / غرام من وزن الجسم).
   ملاحظة: استخدم محلول رنين الرضاعة المعدل بدرجة حرارة الجسم لإنعاش الفئران.
9. قم بإيقاف تشغيل isoflurane ، وإزالة مخروط الأنف ، ووضع الفئران على حصيرة الحرارة للتعافي.

3. إعداد اللقاح البكتيري والعدوى

1. قم بخط العينة المجمدة من Pseudomonas aeruginosa PAO1 والمكورات العنقودية الذهبيةATCC25923 على ألواح Muller Hinton Agar (MHA) ، قبل يومين من تجربة الحرق.
2. في اليوم التالي ، حدد مستعمرة واحدة من البكتيريا المزروعة من اللوحة ، وباستخدام حلقة التلقيح ، كشطها قليلا من اللوحة. ثم ضعه في أنبوب الاستزراع لتلقيح 10 مل من مرق مولر هينتون (MHB) واستزراعه طوال الليل عند 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة.
3. في يوم الحرق والعدوى ، أجهزة الطرد المركزي الثقافة في 4000 × غرام لمدة 5 دقائق. اغسل الحبيبات بمحلول ملحي عادي (محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪).
4. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في محلول ملحي وقم بتخفيفها حتى 0.1 OD_600nm (الكثافة البصرية عند 600 نانومتر). قم بتخفيف اللقاح البكتيري عن طريق أخذ 200 ميكرولتر من هذا المعلق البكتيري وخلطه مع 800 ميكرولتر من المحلول الملحي للحصول على اللقاح البكتيري المطلوب من 2 × 10⁷ CFU / mL.
5. حقن 50 ميكرولتر من لقاح P. aeruginosa أو S. aureus المحضر في الخطوة السابقة (جرعة العدوى 1 × 10⁶ CFU) في الجرذ المخدر بعد 15 دقيقة من الحرق ، باستخدام إبرة 29 G تحت الجلد بالقرب من جرح الحرق قدر الإمكان.
6. بعد إصابة جرح الحرق ، ضع الفئران على وسادة التدفئة للتعافي. بمجرد أن يتعافى الحيوان (~ 15-20 دقيقة) ، ضعه في قفص نظيف.
   ملاحظة: بعد إصابة الحرق ، قم بإيواء فأر واحد لكل قفص. استخدم كريات الطعام الرطبة بالماء لسهولة المضغ وضعها على أرضية القفص لسهولة الوصول إليها.
7. املأ زجاجات المياه في القفص بالماء المسنن بالمورفين (0.4 مجم / مل) لإدارة الألم.
   ملاحظة: يعكس المورفين الفموي الحالة السريرية مع مرضى الحروق البشرية. استخدمت هذه الدراسة المورفين عن طريق الفم للحفاظ على هذه التجارب قابلة للمقارنة مع مرضى الحروق البشرية بعد التشاور مع الطاقم البيطري في مناسبات عديدة. تم الحفاظ على سجلات الشرب والوزن طوال التجربة. استخدم نفس نظام الشرب خلال جميع الإجراءات. يمكن إعطاء المسكنات الأخرى ، مثل البوبرينورفين ، تحت الجلد / داخل الصفاق وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية الحيوانات.
8. املأ قائمة مراجعة المراقبة وراقب الحيوانات عن كثب بحثا عن الضيق أو المرض طوال مدة التجربة.

4. تقييم إصابة الحروق

1. تقييم إصابة حروق الجلد شكليا من حيث اللون والهامش مباشرة بعد إصابة الحرق.
2. قم بتلطيخ الجلد المحروق بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) لتصور بنية جرح الحرق والفجوة الظهارية¹⁵ (انظر الخطوة 5.6 لمعالجة العينات).

5. المعالجة اللاحقة لعينات الفئران والتعداد البكتيري

1. القتل الرحيم للفأر في 24 و 48 و 72 ساعة بعد الحرق بجرعة زائدة من التخدير.
2. سحب عينات الدم من الفئران عن طريق ثقب القلب وجمعها في أنبوب جمع صغير.
   1. تحليل تعداد الدم الكامل من عينات الدم لتحديد تأثير تحريض الحرق على الجهاز المناعي المضيف.
3. حصاد الجلد والأنسجة تحت الجلد والعضلات والرئة والطحال في وقت القتل الرحيم.
   ملاحظة: احتفظ بجزء واحد (~ 1 سم × 1 سم ؛ يزن ~ 200-300 مجم) من الجلد لتلطيخ H& E وجزء آخر للتعداد البكتيري.
4. اجمع الأنسجة في أنبوب تجميع سعة 10 مل وضعها في محلول ملحي طبيعي على الثلج لتعداد البكتيريا.
5. تطبيع وزن الأنسجة بالمحلول الملحي الطبيعي وتجانس العينات باستخدام خالط الأنسجة (انظر جدول المواد).
   1. تمييع تسلسليا تجانس الأنسجة في المياه المالحة العادية.
   2. صفيحة 100 ميكرولتر من التجانس غير المخفف وجميع التخفيفات لكل عينة من الأنسجة على ألواح أجار السيتريميد للعينات التي تم جمعها من الفئران المصابة ب P. aeruginosa.
      ملاحظة: استخدم ألواح مانيتول أجار لطلاء العينات التي تم جمعها من الفئران المصابة بالمكورات العنقودية الذهبية.
   3. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 16-18 ساعة.
   4. في اليوم التالي ، عد المستعمرات البكتيرية على الألواح ، واضربها في نسبة التخفيف للحصول على عدد CFU / mL ، وقم بتطبيعها مع وزن الأنسجة لحساب أنسجة CFU / g.
   5. استخدام برامج تحليل البيانات لرسم الأعداد البكتيرية في الأعضاء المختلفة في نقاط زمنية مختلفة لأخذ العينات.
6. قم بإجراء تلطيخ H& E للجلد المحروق لتصور بنية الجرح والفجوة الظهارية.
   1. باستخدام المقص والملقط المسنن ، قم بقطع رقعة جلدية بحجم 1 سم × 1 سم من منطقة الحرق واغمرها في مثبت (10٪ فورمالين محايد ، NBF) لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قم بتدوير الحاوية لضمان غمر جميع الأنسجة تماما في المثبت ، مع حجم المثبت 30x حجم الأنسجة.
   2. تجفيف أنسجة الجلد بنسبة 70٪ (v / v) من الإيثانول لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   3. قم بمعالجة العينات المجففة في كتل البارافين لقطع الأقسام وتلطيخها باستخدام H&E¹⁵.
   4. قم بتصوير الشرائح الملطخة رقميا في ماسح ضوئي للشرائح (انظر جدول المواد) باستخدام هدف 40x.
   5. تحليل الصورة الممسوحة ضوئيا باستخدام البرنامج (انظر الملف التكميلي 1 لمعالجة الصورة للتحليل؛ انظر جدول المواد).
   6. فحص جميع مجالات قسم الجلد الملون لتقييم حالة البشرة والأدمة والأنسجة تحت الجلد والعضلات الهيكلية.

النتائج

البروتوكول المقدم هنا قابل للتكرار بدرجة كبيرة وأدى إلى إصابة حروق كاملة السماكة من الدرجة الثالثة في الفئران. يظهر جرح الحرق أبيض شمعي بعد تحريض الحرق (الشكل 2 ب). تغير لون إصابة الحرق من الأبيض إلى البني على مدار 72 ساعة بعد الحرق (الشكل 2B-E...

Discussion

تم تقديم العديد من نماذج الحروق لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الحروق⁸،^12،16،17. في الدراسة الحالية ، استخدمنا نموذجا للفئران لتطوير بروتوكول بسيط وقابل للتكرار للحث على حرق كامل السمك متبوعا بعدوى بكتيرية لمحاكاة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm