מודל שריפת חולדות לחקר כוויה תרמית עורית בעובי מלא וזיהום

Summary

מודל המחקה את התרחיש הקליני של פגיעה בכוויות וזיהום נחוץ לקידום מחקר הכוויות. הפרוטוקול הנוכחי מדגים מודל פשוט וניתן לשחזור של זיהום כוויות חולדות הדומה לזה שבבני אדם. זה מקל על המחקר של כוויות וזיהומים לאחר כוויה לפיתוח טיפולים אנטיביוטיים מקומיים חדשים.

Abstract

מתודולוגיות השראת שריפה מתוארות באופן לא עקבי במודלים של חולדות. מודל אחיד של פצעי כוויה, המייצג את התרחיש הקליני, נחוץ לביצוע מחקר כוויות הניתן לשחזור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה וניתנת לשחזור ליצירת ~20% כוויות בעובי מלא של שטח הגוף הכולל (TBSA) בחולדות. כאן, מוט נחושת בקוטר 22.89 ס"מ 2 (5.4^ס" מ) שחומם ב 97 מעלות צלזיוס באמבט מים הוחל על פני העור של החולדה כדי לגרום לפציעת הכוויה. מוט נחושת בעל מוליכות תרמית גבוהה הצליח לפזר את החום עמוק יותר ברקמת העור וליצור כוויה בעובי מלא. ניתוח היסטולוגיה מראה אפידרמיס מוחלש עם נזק קוגולטיבי להיקף עובי מלא של הדרמיס והרקמה התת עורית. בנוסף, מודל זה מייצג את המצבים הקליניים שנצפו בחולי כוויות מאושפזים לאחר פגיעה בכוויות כגון חוסר ויסות חיסוני וזיהומים חיידקיים. המודל יכול לשחזר את הזיהום החיידקי המערכתי הן על ידי חיידקים גראם-חיוביים והן על ידי חיידקים גראם-שליליים. לסיכום, מאמר זה מציג מודל קל ללמידה וחזק של כוויות חולדות המחקה את המצבים הקליניים, כולל חוסר ויסות חיסוני וזיהומים חיידקיים, אשר מועיל רבות לפיתוח תרופות אנטיביוטיות מקומיות חדשות לפצעי כוויות וזיהומים.

Introduction

פציעות כוויות הן בין צורות הטראומה ההרסניות ביותר, כאשר שיעורי התמותה מגיעים ל -12% אפילו במרכזי כוויות מיוחדים ^1,2,3. על פי דיווחים שפורסמו לאחרונה, ~ 486,000 חולי כוויות זקוקים לטיפול רפואי מדי שנה בארצות הברית, עם כמעט 3,500 מקרי מוות 1,2,3,4,5,6. פגיעת כוויות מציבה אתגר גדול למערכת החיסונית של החולים ויוצרת פצע פתוח משמעותי, אשר נרפא לאט, ומותיר אותם רגישים להתיישבות עורית, ריאתית וסיסטמית עם חיידקים נוסוקומיאליים ואופורטוניסטיים. חוסר ויסות חיסוני בשילוב עם זיהום חיידקי קשור לעלייה בתחלואה ותמותה בקרב חולי כוויות⁷.

מודל של כוויות וזיהומים בבעלי חיים חיוני לחקר הפתוגנזה של זיהומים חיידקיים בעקבות נזק לעור ודיכוי חיסוני הקשור לטראומה מכוויות. מודלים כאלה מאפשרים תכנון והערכה של שיטות חדשות לטיפול בזיהומים חיידקיים בחולי כוויות. חולדות ובני אדם חולקים מאפייני עור, פיזיולוגיים ופתולוגיים דומים שתועדו בעבר⁸. בנוסף, החולדות קטנות יותר בגודלן, מה שהופך אותן לקלות יותר לטיפול, זולות יותר וקלות יותר לרכישה ולתחזוקה מאשר מודלים גדולים יותר של בעלי חיים.

מאפיינים אלה הופכים את החולדות לחיית מודל אידיאלית לחקר כוויות וזיהומים⁹. למרבה הצער, הטכניקה להשראת כוויות אינה עקבית ולעתים קרובות מתוארת באופן מינימלי 10,11,12,13,14. הפרוטוקול הנוכחי נועד לפתח הליך פשוט, חסכוני וניתן לשחזור ליצירת פגיעה עקבית בכוויות בעובי מלא במודל חולדה המדמה את התרחיש הקליני וניתן להשתמש בו להערכת דיכוי חיסוני וזיהום חיידקי.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת צפון קרוליינה ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו שלה. זכרים ונקבות חולדות Sprague Dawley (250-300 גרם) בגילאי 7-9 שבועות שימשו לניסויים. כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור-חושך של 12 שעות: 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים אד ליביטום. תמיד לעבוד עם הווטרינר המוסדי שלך על תוכנית משככי כאבים לפני תחילת המחקר.

1. הכנת חולדות לפציעת הכוויה

1. הכינו את בעלי החיים לפציעת כוויה 24 שעות לפני הכוויה.
2. מרדימים את החולדה עם 5% איזופלורן ב-100% חמצן בתא אינדוקציה למשך 5 דקות (קצב זרימה: 2 ליטר/דקה) עד להאטה בנשימה.
3. ברגע שהחולדה מורדמת עמוקות (לא מגיבה לצביטה בבוהן בכל הגפיים), העבירו את החולדה לכרית חימום במצב נוטה והפחיתו את האיזופלורן ל-1.5% חמצן לתחזוקה דרך חרוט באף.
4. כדי למנוע התייבשות הקרנית לאחר הרדמה ובמהלך ההליך, יש למרוח חומר סיכה לעיניים על הקרניות של שתי העיניים באמצעות מוליך צמר גפן.
5. גלחו את האזור הגבי של החולדה באמצעות קוצץ חשמלי (ראו טבלת חומרים) והסירו כמה שיותר שיער במלבן גדול מהשכמות ועד לבסיס הזנב (איור 2A).
6. נקו את האזור המגולח עם טישו ספוג במי מלח כדי לנגב את השערות הרופפות. יש למרוח תחליב להסרת שיער על האזור המגולח באמצעות אפליקטור עם קצוות כותנה ולהשאיר אותו למשך ~3 דקות.
   הערה: מריחת תחליב הסרת השיער הנזכר במשך יותר מ -3 דקות תגרום לפריחה אדומה על העור.
7. נגבו את האזור עם ספוג גזה רטוב פעמיים כדי להסיר את הקרם ולמנוע גירוי בעור.
8. כבו את האיזופלורן, הסירו את חרוט האף והכניסו את החולדה לכלוב ההתאוששות.
   הערה: הכניסו כרית חימום לכלוב ההתאוששות.
9. העבירו את בעל החיים שהתאושש לכלוב דיור נקי להליך הכוויה למחרת (ייתכן שיחלפו ~10-15 דקות עד שהחולדה תתאושש מההרדמה).

2. גרימת פציעת כוויה בחולדות

1. ביום הכוויה, כוונו את טמפרטורת אמבט המים ל -97 מעלות צלזיוס והניחו את כל ארבעת מוטות הנחושת (420 גרם כל אחד; איור 1) באמבט המים שעה לפני ניסוי הכוויה כדי לאפשר למוטות להתחמם באופן אחיד.
   הערה: יש לטבול את המוטות במים. בדוק את הדיוק של תצוגת הטמפרטורה הדיגיטלית באמצעות מדחום לפני הניסוי.
2. להרדים את החולדה כאמור בסעיף 1.
3. ברגע שהחולדה לא מגיבה לצביטה בבוהן בכל הגפיים, הניחו אותה על כרית חימום במצב נוטה עם 1.5% איזופלורן בחמצן לתחזוקה (איור 2A).
4. הזריקו מורפיום (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) דרך המסלול התוך-צפקי (I.P.) לטיפול בכאב⁶.
5. בדוק את טמפרטורת המים באמבט המים. הגדר את הטיימר ולבש את הכפפות העמידות בחום.
6. הוציאו מוט נחושת מחומם אחד מאמבט המים וגעו בו באזור הגבי של החולדה למשך 7 שניות כדי לגרום לכוויה.
   הערה: יש לשמור על מרחק מינימלי (10-15 ס"מ) בין אמבט המים לבין בעל החיים כדי למזער את איבוד החום, ואין להפעיל לחץ על המוטות בעת גרימת הכוויה (כלומר, המגע חייב להישמר על ידי כוח הכבידה).
7. הפעילו ארבע כוויות, באמצעות מוט אחד לכל אתר כוויה, אחת מיד אחרי השנייה כדי לייצר כ-20% כוויות TBSA במגע מלא (איור 2B).
8. לאחר הכוויה, יש לבצע החייאה על ידי הזרקת תמיסת רינגר מניקה (0.1 מ"ל/גרם משקל גוף).
   הערה: השתמש בתמיסת רינגר הנקה מותאמת לטמפרטורת הגוף כדי להחיות את החולדות.
9. כבו את האיזופלורן, הסירו את חרוט האף והניחו את החולדה על משטח החום להתאוששות.

3. הכנת חיסון חיידקי וזיהום

1. פזרו את הדגימה הקפואה של Pseudomonas aeruginosa PAO1 ו-Staphylococcus aureus ATCC25923 על לוחות Muller Hinton Agar (MHA), יומיים לפני ניסוי הכוויה.
2. למחרת, בחרו מושבה אחת של חיידקים בוגרים מהצלחת, ובעזרת לולאת חיסון, גרדו אותה מעט מהצלחת. לאחר מכן, הניחו אותו בצינור התרבית כדי לחסן 10 מ"ל של מרק מולר הינטון (MHB) ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר אינקובטור.
3. ביום השריפה וההדבקה, צנטריפוגה את התרבית ב 4,000 × גרם במשך 5 דקות. שטפו את הגלולה במי מלח רגילים (תמיסת NaCl 0.9%).
4. להשהות מחדש את כדורית החיידקים במי מלח ולדלל עד 0.1 OD_600nm (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). לדלל את החיסון החיידקי על ידי לקיחת 200 μL של תרחיף חיידקי זה וערבוב אותו עם 800 μL של מלוחים כדי לקבל את החיסון החיידקי הרצוי של 2 × 10⁷ CFU/מ"ל.
5. הזריקו 50 μL של P. aeruginosa או S. aureus inoculum שהוכן בשלב הקודם (מינון זיהום 1 × 10⁶ CFU) לחולדה המורדמת 15 דקות לאחר הכוויה, באמצעות מחט 29 G תת עורית קרוב ככל האפשר לפצע הכוויה.
6. לאחר הדבקת פצע הכוויה, הניחו את החולדה על כרית החימום להתאוששות. לאחר שהחיה מתאוששת (~ 15-20 דקות), אכסנו אותה בכלוב נקי.
   הערה: לאחר פציעת הכוויה, אכלסו חולדה אחת בכל כלוב. השתמשו בכדורי מזון רטובים במים ללעיסה קלה והניחו אותם על רצפת הכלוב להגעה נוחה.
7. מלאו את בקבוקי המים בכלוב במים עם מורפיום (0.4 מ"ג/מ"ל) לטיפול בכאב.
   הערה: מורפיום אוראלי משקף את המצב הקליני עם חולי כוויות אנושיים. מחקר זה השתמש במורפיום אוראלי כדי לשמור על ניסויים אלה דומים לחולי כוויות אנושיים לאחר התייעצות עם הצוות הווטרינרי בהזדמנויות רבות. יומני שתייה ומשקל נשמרו לאורך כל הניסוי. השתמש באותה מערכת שתייה במהלך כל ההליכים. משככי כאבים אחרים, כגון Buprenorphine, יכולים להינתן תת עורית / intraperitonely בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים.
8. מלאו את רשימת התיוג לניטור ועקבו מקרוב אחר בעלי החיים לאיתור מצוקה או מחלה במשך כל תקופת הניסוי.

4. הערכת פציעת הכוויה

1. יש להעריך את הפגיעה בכוויה בעור מבחינה מורפולוגית מבחינת צבע ושוליים מיד לאחר הפציעה מכוויה.
2. הכתימו את העור השרוף עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי להמחיש את מבנה פצע הכוויה ואת פער האפיתל¹⁵ (ראו שלב 5.6 לעיבוד דגימה).

5. עיבוד לאחר דגימות חולדות וספירת חיידקים

1. הרדימו את החולדה ב-24, 48 ו-72 שעות לאחר הכוויה עם מנת יתר של חומר הרדמה.
2. הוציאו דגימות דם מהחולדות באמצעות ניקוב לב ואספו אותן בצינורית איסוף קטנה.
   1. נתח ספירות דם מלאות מדגימות הדם כדי לקבוע את ההשפעה של השראת כוויות על המערכת החיסונית המארחת.
3. יש לקצור עור, רקמות תת עוריות, שרירים, ריאות וטחול בזמן המתת חסד.
   הערה: יש לשמור חלק אחד (~ 1 ס"מ × 1 ס"מ; במשקל ~ 200-300 מ"ג) של העור לצביעת H&E וחלק אחר לספירה חיידקית.
4. אספו את הרקמות בצינור איסוף של 10 מ"ל והניחו אותן במי מלח רגילים על קרח לצורך ספירת חיידקים.
5. לנרמל את משקל הרקמה עם מלוחים רגילים והומוגניזציה של הדגימות באמצעות הומוגנייזר רקמות (ראה טבלת חומרים).
   1. לדלל באופן סדרתי את ההומוגנאטים של הרקמה במי מלח רגילים.
   2. צלחת 100 μL של הומוגנאט לא מדולל וכל הדילולים של כל דגימת רקמה על צלחות אגר cetrimide עבור דגימות שנאספו מחולדות נגועות P. aeruginosa.
      הערה: השתמש בצלחות אגר מניטול לציפוי דגימות שנאספו מחולדות נגועות ב- S. aureus.
   3. לדגור את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 16-18 שעות.
   4. למחרת, ספרו את מושבות החיידקים על הלוחות, הכפילו ביחס הדילול כדי לקבל את ספירת CFU/mL, ונרמלו עם משקל הרקמה כדי לחשב את רקמת CFU/g.
   5. השתמש בתוכנה לניתוח נתונים כדי לשרטט את ספירת החיידקים באיברים שונים בנקודות זמן הדגימה השונות.
6. בצע צביעת H&E של עור שרוף כדי להמחיש את מבנה הפצע ואת פער האפיתל.
   1. בעזרת מספריים ומלקחיים חותכים טלאי עור בגודל 1X1 ס"מ מאזור הכוויה וטובלים אותו בקיבוע (פורמלין חוצץ ניטרלי 10%, NBF) למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר.
      הערה: סובבו את המיכל כדי לוודא שכל הרקמות שקועות לחלוטין בקיבוע, כאשר נפח הקיבוע גדול פי 30 מנפח הרקמה.
   2. יש לייבש את רקמת העור באתנול 70% (v/v) למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר.
   3. מעבדים את הדגימות המיובשות בגושי פרפין כדי לחתוך את החלקים ולהכתים עם H&E¹⁵.
   4. צייר באופן דיגיטלי את השקופיות המוכתמות בסורק שקופיות (ראה טבלת חומרים) באמצעות מטרה של 40x.
   5. נתח את התמונה הסרוקה באמצעות תוכנה (ראה קובץ משלים 1 לעיבוד התמונה לניתוח; ראה טבלת חומרים).
   6. בדוק את כל שדות העור המוכתם כדי להעריך את מצב האפידרמיס, הדרמיס, הרקמה התת עורית ושרירי השלד.

תוצאות

הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לשחזור רב והביא לפציעת כוויה מדרגה שלישית בעובי מלא בחולדות. פצע הכוויה נראה לבן שעווה לאחר השראת הכוויה (איור 2B). צבע פציעת הכוויה השתנה מלבן לחום במהלך 72 שעות לאחר הכוויה (איור 2B-E).

ניתוח היסטולוגי ...

Discussion

מספר מודלים של כוויות הוצגו כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של פגיעה בכוויות 8,12,16,17. במחקר הנוכחי, השתמשנו במודל של חולדות כדי לפתח פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור כדי לגרום לכוויה בעובי מלא ואחריה זיהום חיידקי כדי לדמות טראומה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm