전층 피부 열 화상 및 감염을 연구하기 위한 쥐 화상 모델

요약

화상 손상 및 감염의 임상 시나리오를 모방한 모델은 화상 연구를 진행하는 데 필요합니다. 본 프로토콜은 인간에 필적하는 간단하고 재현 가능한 쥐 화상 감염 모델을 보여줍니다. 이것은 새로운 국소 항생제 치료법을 개발하기 위해 화상 후 화상 및 감염에 대한 연구를 용이하게 합니다.

초록

화상 유도 방법론은 쥐 모델에서 일관되지 않게 설명됩니다. 재현 가능한 화상 연구를 수행하려면 임상 시나리오를 나타내는 균일한 화상 상처 모델이 필요합니다. 현재 프로토콜은 쥐에서 ~20% 총 체표면적(TBSA) 전층 화상을 생성하는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 여기서, 수조에서 97°C로 가열된 22.89^cm2 (직경 5.4 cm)의 구리 막대를 랫트 피부 표면에 도포하여 화상을 유발하였다. 열전도율이 높은 구리 막대는 피부 조직 깊숙이 열을 발산하여 전층 화상을 만들 수 있었습니다. 조직학 분석은 진피와 피하 조직의 전체 두께 범위에 대한 응고 손상으로 약화 된 표피를 보여줍니다. 또한, 이 모델은 면역 조절 장애 및 세균 감염과 같은 화상 손상 후 입원한 화상 환자에서 관찰되는 임상 상황을 대표합니다. 이 모델은 그람 양성균과 그람 음성균 모두에 의한 전신 세균 감염을 요약할 수 있습니다. 결론적으로, 이 논문은 화상 상처 및 감염에 대한 새로운 국소 항생제 개발에 상당한 유용성을 가진 면역 조절 장애 및 박테리아 감염을 포함한 임상 상황을 모방한 배우기 쉽고 강력한 쥐 화상 모델을 제시합니다.

서문

화상 부상은 가장 파괴적인 형태의 외상 중 하나이며, 전문 화상 센터에서도 사망률이 12 %에 이릅니다 ^1,2,3. 최근 발표된 보고서에 따르면 미국에서 매년 ~486,000명의 화상 환자가 치료를 필요로 하며 거의 3,500명이 사망합니다 1,2,3,4,5,6. 화상 손상은 환자의 면역 체계에 큰 도전을 부과하고 치유가 느린 심각한 열린 상처를 만들어 병원, 기회 박테리아에 의한 피부, 폐 및 전신 집락화에 취약하게 만듭니다. 세균 감염과 결합된 면역 조절 장애는 화상 환자의 이환율 및 사망률 증가와 관련이 있다⁷.

동물 화상 및 감염 모델은 화상 외상과 관련된 피부 손상 및 면역 억제에 따른 박테리아 감염의 발병기전을 연구하는 데 필수적입니다. 이러한 모델을 통해 화상 환자의 세균 감염을 치료하기 위한 새로운 방법을 설계하고 평가할 수 있습니다. 쥐와 인간은 이전에 기록된 것과 유사한 피부 생리적, 병리학적 특성을 공유한다⁸. 또한 쥐는 크기가 작아 대형 동물 모델보다 다루기 쉽고 저렴하며 조달 및 유지 관리가 더 쉽습니다.

이러한 특성으로 인해 쥐는 화상과 감염을 연구하기에 이상적인 모델 동물입니다⁹. 불행하게도, 화상 유도를 위한 기술은 일관성이 없고 종종 최소한으로 설명된다^{10,11,12,13,14}. 본 프로토콜은 임상 시나리오를 시뮬레이션하고 면역 억제 및 박테리아 감염을 평가하는 데 사용할 수 있는 쥐 모델에서 일관된 전층 화상 손상을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 재현 가능한 절차를 개발하도록 설계되었습니다.

프로토콜

모든 절차는 노스캐롤라이나 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 확립된 지침에 따라 수행되었습니다. 7-9주령의 수컷 및 암컷 Sprague Dawley 랫트(250-300 g)를 실험에 사용하였다. 모든 동물은 12시간 12시간 명암 주기로 사육되었으며 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 연구를 시작하기 전에 항상 진통제 계획에 대해 기관 수의사와 협력하십시오.

1. 화상에 대비한 쥐 준비

1. 화상 24 시간 전에 화상을 입기 위해 동물을 준비하십시오.
2. 호흡이 느려질 때까지 유도 챔버에서 5분 동안(유속: 2L/min) 유도 챔버에서 100% 산소에 5% 이소플루란으로 쥐를 마취합니다.
3. 쥐가 심하게 마취되면(모든 팔다리의 발가락 꼬집음에 반응하지 않음) 쥐를 엎드린 자세의 가열 패드로 옮기고 코 콘을 통한 유지 관리를 위해 이소플루란을 산소 1.5%로 줄입니다.
4. 마취 후와 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 면봉 어플리케이터를 사용하여 양쪽 눈의 각막에 눈 윤활제를 바릅니다.
5. 전기 클리퍼를 사용하여 쥐의 등쪽 부분을 면도하고( 재료 표 참조) 견갑골에서 꼬리 기저부까지 큰 직사각형으로 가능한 한 많은 털을 제거합니다(그림 2A).
6. 식염수에 적신 티슈로 면도한 부위를 닦아 느슨한 털을 닦아냅니다. 면봉 어플리케이터를 사용하여 면도한 부위에 제모 로션을 바르고 ~3분 동안 그대로 두십시오.
   알림: 참조된 제모 로션을 3분 이상 바르면 피부에 붉은 발진이 생깁니다.
7. 젖은 거즈 스폰지로 해당 부위를 두 번 닦아 로션을 제거하고 피부 자극을 방지하십시오.
8. 이소플루란을 끄고 노즈 콘을 제거한 다음 쥐를 회복 케이지에 넣습니다.
   알림: 복구 케이지에 가열 패드를 넣습니다.
9. 다음날 화상 절차를 위해 회수된 동물을 깨끗한 하우징 케이지로 옮깁니다(쥐가 마취에서 회복되는 데 ~10-15분이 소요될 수 있음).

2. 랫트의 화상 부상 유도

1. 화상 당일 수조 온도를 97°C로 설정하고 4개의 구리 막대(각각 420g; 그림 1) 화상 실험 1시간 전에 수조에서 막대가 균일하게 예열되도록 하였다.
   알림: 낚싯대는 물에 담가야 합니다. 실험 전에 온도계를 사용하여 디지털 온도 표시의 정확도를 확인하십시오.
2. 섹션 1에서 언급 한대로 쥐를 마취하십시오.
3. 쥐가 모든 팔다리의 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 유지 관리를 위해 산소에 1.5% 이소플루란이 있는 엎드린 자세의 가열 패드에 쥐를 놓습니다(그림 2A).
4. 통증 관리를 위해 복강내(ip) 경로를 통해 모르핀(20mg/kg 체중)을 주사합니다⁶.
5. 수조의 물 온도를 확인하십시오. 타이머를 설정하고 내열 장갑을 착용하십시오.
6. 수조에서 가열 된 구리 막대 하나를 꺼내 7 초 동안 쥐의 등쪽 부위에 대고 화상을 유도합니다.
   알림: 열 손실을 최소화하기 위해 수조와 동물 사이에 최소 거리(10-15cm)를 유지하고 화상을 유발하는 동안 막대에 압력을 가하지 마십시오(즉, 중력에 의해 접촉이 유지되어야 함).
7. 화상 부위당 하나의 막대를 사용하여 4번의 화상을 가하고 즉시 하나씩 약 20% TBSA 완전 접촉 화상을 생성합니다(그림 2B).
8. 화상 후 i.p. 젖산 링거 용액(0.1mL/g 체중)을 주사합니다.
   알림: 체온 조절 수유 링거 용액을 사용하여 쥐를 소생시킵니다.
9. 이소플루란을 끄고 노즈 콘을 제거한 다음 회복을 위해 열 매트에 쥐를 놓습니다.

3. 세균 접종물의 제조 및 감염

1. 녹 농균(Pseudomonas aeruginosa ) PAO1 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureu) s ATCC25923의 냉동 샘플을 화상 실험 2일 전에 Muller Hinton Agar(MHA) 플레이트에 줄무늬로 채취합니다.
2. 다음날, 접시에서 성장한 박테리아의 단일 식민지를 선택하고 접종 루프를 사용하여 접시에서 약간 긁어냅니다. 그 후, 이를 배양 튜브에 넣어 10 mL의 뮬러 힌튼 브로스(MHB)를 접종하고, 진탕기 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양한다.
3. 화상 및 감염 당일에, 배양액을 4,000 × g 에서 5 분 동안 원심 분리한다. 펠렛을 생리 식염수(0.9% NaCl 용액)로 세척합니다.
4. 박테리아 펠릿을 식염수에 재현탁하고 최대 0.1 OD 600nm(_600nm 에서 광학 밀도)까지 희석합니다. 이 박테리아 현탁액 200μL를 취하여 식염수 800μL와 혼합하여 박테리아 접종물을 희석하여 2 ×^{10 7} CFU/mL의 원하는 박테리아 접종물을 얻습니다.
5. 화상 후 15분 후에 마취된 쥐에게 이전 단계에서 준비한 녹농균 또는 녹농균 또는 S. 아우레우스접종물(감염 용량 1 ×^{10 6} CFU) 50μL를 주사하고, 29G 바늘을 사용하여 화상 상처에 최대한 가깝게 피하한다.
6. 화상 상처를 감염시킨 후 회복을 위해 가열 패드에 쥐를 올려 놓으십시오. 동물이 회복되면(~15-20분) 깨끗한 새장에 보관합니다.
   알림: 화상 후 케이지당 한 마리의 쥐를 수용하십시오. 쉽게 씹을 수 있도록 물에 젖은 음식 펠릿을 사용하고 쉽게 닿을 수 있도록 케이지 바닥에 놓으십시오.
7. 통증 관리를 위해 케이지의 물병에 모르핀 스파이크 물(0.4mg/mL)을 채웁니다.
   참고: 경구용 모르핀은 인간 화상 환자의 임상 상황을 반영합니다. 이 연구는 수의사와 여러 차례 상의한 후 이러한 실험을 인간 화상 환자와 비교할 수 있도록 경구용 모르핀을 사용했습니다. 음주 및 체중 로그는 실험 내내 유지되었습니다. 모든 절차 중에 동일한 음주 시스템을 사용하십시오. 부프레노르핀과 같은 다른 진통제는 기관 동물 관리 지침에 따라 피하/복강 내 투여할 수 있습니다.
8. 모니터링 체크리스트를 작성하고 전체 실험 기간 동안 동물에게 고통이나 질병이 있는지 면밀히 모니터링하십시오.

4. 화상 부상의 평가

1. 화상 손상 직후의 색상과 마진 측면에서 피부 화상 손상을 형태학적으로 평가합니다.
2. 화상을 입은 피부를 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하여 화상 상처 구조와 상피 간격¹⁵ 를 시각화합니다(샘플 처리는 5.6단계 참조).

5. 쥐 샘플의 후처리 및 박테리아 계수

1. 화상 후 24, 48, 72시간에 마취 과다 복용으로 쥐를 안락사시킵니다.
2. 심장 천자를 통해 쥐에게서 혈액 샘플을 채취하여 미니 수집 튜브에 수집합니다.
   1. 혈액 샘플의 전체 혈구 수를 분석하여 숙주 면역 체계에 대한 화상 유도의 효과를 확인합니다.
3. 안락사 시 피부, 피하조직, 근육, 폐, 비장을 채취한다.
   참고 : H & E 염색을 위해 피부의 한 부분 (~ 1cm × 1cm, 무게 ~ 200-300mg)을 유지하고 박테리아 계수를 위해 다른 부분을 유지하십시오.
4. 10mL 수집 튜브에 조직을 수집하고 박테리아 계수를 위해 얼음 위의 생리 식염수에 넣습니다.
5. 생리 식염수로 조직 중량을 정상화하고 조직 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화합니다( 재료 표 참조).
   1. 조직 균질액을 생리 식염수로 연속적으로 희석합니다.
   2. 희석되지 않은 균질액 100 μL와 각 조직 샘플의 모든 희석액을 녹 농균에 감염된 래트로부터 채취한 샘플에 대해 세트리미드 한천 플레이트에 플레이트한다.
      참고: S. 아우레우스에 감염된 쥐에서 채취한 샘플을 플레이팅하기 위해 만니톨 한천 플레이트를 사용하십시오.
   3. 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 인큐베이터에서 배양합니다.
   4. 다음날 플레이트의 박테리아 콜로니를 세고 희석 비율을 곱하여 CFU/mL 수를 구하고 조직의 무게로 정규화하여 CFU/g 조직을 계산합니다.
   5. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 샘플링 시점에서 서로 다른 장기의 박테리아 수를 표시합니다.
6. 화상을 입은 피부의 H & E 염색을 수행하여 상처 구조와 상피 간극을 시각화합니다.
   1. 가위와 톱니 집게를 사용하여 화상 부위에서 1cm x 1cm의 피부 패치를 자르고 실온에서 48시간 동안 고정액(10% 중성 완충 포르말린, NBF)에 담급니다.
      알림: 용기를 휘저어 모든 조직이 고정액에 완전히 잠기도록 하고 고정액의 부피가 조직 부피의 30배가 되도록 합니다.
   2. 실온에서 72시간 동안 70%(v/v) 에탄올로 피부 조직을 탈수합니다.
   3. 탈수된 샘플을 파라핀 블록으로 처리하여 절편을 절단하고 H&E¹⁵로 염색한다.
   4. 40x 대물렌즈를 사용하여 슬라이드 스캐너( 재료 표 참조)에서 염색된 슬라이드를 디지털 방식으로 이미지화합니다.
   5. 소프트웨어를 사용하여 스캔한 이미지를 분석합니다( 보충 참조 file 분석을 위한 이미지 처리에 대한 1, 재료 표 참조).
   6. 표피, 진피, 피하 조직 및 골격근의 상태를 평가하기 위해 염색 된 피부 섹션의 모든 필드를 검사합니다.

결과

여기에 제시된 프로토콜은 재현성이 높으며 쥐에서 3도 전층 화상 손상을 초래했습니다. 화상 유발 후 화상 상처가 백색으로 나타납니다(그림 2B). 화상 후 72시간 동안 화상 부상의 색상이 흰색에서 갈색으로 변했습니다(그림 2B-E).

조직학적 분석에서 전층 화상(화상 후 24시간 >2.61mm; 그림 3B<...

토론

화상 손상의 병태생리학을 연구하기 위해 여러 화상 모델이 제시되었습니다 8,12,16,17. 현재 연구에서 우리는 쥐 모델을 사용하여 환자의 감염된 화상 외상을 시뮬레이션하기 위해 전층 화상을 유도한 후 박테리아 감염을 유도하는 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 개발했습니다. 인간 조건을 모방하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm