Modello di ratto burn per studiare l'ustione termica cutanea a tutto spessore e l'infezione

Riepilogo

Un modello che imiti lo scenario clinico delle ustioni e delle infezioni è necessario per promuovere la ricerca sulle ustioni. Il presente protocollo dimostra un modello semplice e riproducibile di infezione da ustione da ratto paragonabile a quello dell'uomo. Ciò facilita lo studio delle ustioni e delle infezioni successive all'ustione per lo sviluppo di nuovi trattamenti antibiotici topici.

Abstract

Le metodologie di induzione delle ustioni sono descritte in modo incoerente nei modelli di ratto. Un modello uniforme di ferita da ustione, che rappresenta lo scenario clinico, è necessario per eseguire ricerche di ustioni riproducibili. Il presente protocollo descrive un metodo semplice e riproducibile per creare ~ 20% di superficie corporea totale (TBSA) ustioni a tutto spessore nei ratti. Qui, una barra di rame di 22,89 cm² (5,4 cm di diametro) riscaldata a 97 °C a bagnomaria è stata applicata sulla superficie della pelle di ratto per indurre la lesione da ustione. Una barra di rame con un'alta conduttività termica è stata in grado di dissipare il calore più in profondità nel tessuto cutaneo per creare un'ustione a tutto spessore. L'analisi istologica mostra epidermide attenuata con danno coagulativo all'estensione a tutto spessore del derma e del tessuto sottocutaneo. Inoltre, questo modello è rappresentativo delle situazioni cliniche osservate nei pazienti ustionati ospedalizzati a seguito di lesioni da ustione come la disregolazione immunitaria e le infezioni batteriche. Il modello può ricapitolare l'infezione batterica sistemica da entrambi i batteri Gram-positivi e Gram-negativi. In conclusione, questo articolo presenta un modello di ustione di ratto facile da imparare e robusto che imita le situazioni cliniche, tra cui la disregolazione immunitaria e le infezioni batteriche, che è di notevole utilità per lo sviluppo di nuovi farmaci antibiotici topici per ustioni e infezioni.

Introduzione

Le ustioni sono tra le forme più devastanti di trauma, con tassi di mortalità che raggiungono il 12% anche nei centri specializzati per ustioni ^1,2,3. Secondo rapporti pubblicati di recente, ~ 486.000 pazienti ustionati richiedono cure mediche ogni anno negli Stati Uniti, con quasi 3.500 morti 1,2,3,4,5,6. Le ustioni impongono una grande sfida per il sistema immunitario dei pazienti e creano una significativa ferita aperta, che è lenta a guarire, lasciandoli suscettibili alla colonizzazione cutanea, polmonare e sistemica con batteri nosocomiali e opportunisti. La disregolazione immunitaria combinata con l'infezione batterica è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità nei pazienti ustionati⁷.

Un modello di ustione e infezione animale è essenziale per studiare la patogenesi delle infezioni batteriche a seguito di danni cutanei e soppressione immunitaria associata a traumi da ustione. Tali modelli consentono la progettazione e la valutazione di nuovi metodi per il trattamento delle infezioni batteriche nei pazienti ustionati. I ratti e gli esseri umani condividono caratteristiche fisiologiche e patologiche cutanee simili che sono state precedentemente documentate⁸. Inoltre, i ratti sono di dimensioni più piccole, rendendoli più facili da gestire, più economici e più facili da procurarsi e mantenere rispetto ai modelli animali più grandi.

Queste caratteristiche rendono i ratti un animale modello ideale per studiare ustioni e infezioni⁹. Sfortunatamente, la tecnica per l'induzione della bruciatura è incoerente e spesso descritta in minima parte 10,11,12,13,14. Il presente protocollo è progettato per sviluppare una procedura semplice, economica e riproducibile per creare una lesione da ustione a tutto spessore coerente in un modello di ratto che simula lo scenario clinico e può essere utilizzata per valutare la soppressione immunitaria e l'infezione batterica.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Carolina del Nord e sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite. Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti Sprague Dawley maschi e femmine (250-300 g) di età compresa tra 7 e 9 settimane. Tutti gli animali sono stati alloggiati in un ciclo luce-buio di 12 ore: 12 h con libero accesso al cibo e all'acqua ad libitum. Lavora sempre con il tuo veterinario istituzionale su un piano analgesico prima di iniziare lo studio.

1. Preparare i ratti per la ferita da ustione

1. Preparare gli animali per le ustioni 24 ore prima dell'ustione.
2. Anestetizzare il ratto con isoflurano al 5% in ossigeno al 100% in una camera di induzione per 5 minuti (portata: 2 L/min) fino a quando la respirazione non è rallentata.
3. Una volta che il ratto è profondamente anestetizzato (non risponde al pizzicamento della punta su tutti gli arti), spostare il ratto su una piastra elettrica in posizione prona e ridurre l'isoflurano all'1,5% in ossigeno per il mantenimento attraverso un cono nasale.
4. Per prevenire l'essiccazione corneale dopo l'anestesia e durante la procedura, applicare lubrificante per gli occhi sulle cornee di entrambi gli occhi utilizzando un applicatore con punta di cotone.
5. Rasare l'area dorsale del ratto usando un tagliacapelli elettrico (vedere la tabella dei materiali) e rimuovere quanti più peli possibile in un grande rettangolo dalle scapole fino alla base della coda (Figura 2A).
6. Pulire la zona rasata con un fazzoletto imbevuto di soluzione salina per asciugare i peli sciolti. Applicare la lozione depilatoria sulla zona rasata utilizzando un applicatore con punta di cotone e lasciarlo in posa per ~ 3 minuti.
   NOTA: L'applicazione della lozione depilatoria di riferimento per più di 3 minuti indurrà eruzioni cutanee rosse sulla pelle.
7. Pulire l'area con una spugna di garza bagnata due volte per rimuovere la lozione e prevenire l'irritazione della pelle.
8. Spegnere l'isoflurano, rimuovere il cono del naso e posizionare il ratto nella gabbia di recupero.
   NOTA: Mettere una piastra riscaldante nella gabbia di recupero.
9. Trasferire l'animale recuperato in una gabbia pulita per la procedura di ustione del giorno successivo (potrebbero essere necessari ~ 10-15 minuti affinché il ratto si riprenda dall'anestesia).

2. Indurre la lesione da ustione nei ratti

1. Il giorno dell'ustione, impostare la temperatura del bagno d'acqua a 97 °C e posizionare tutte e quattro le barre di rame (420 g ciascuna; Figura 1) a bagnomaria 1 h prima dell'esperimento di combustione lasciare che le aste si scaldino uniformemente.
   NOTA: Le aste devono essere immerse nell'acqua. Verificare la precisione del display digitale della temperatura utilizzando un termometro prima dell'esperimento.
2. Anestetizzare il ratto come menzionato nella sezione 1.
3. Una volta che il ratto non risponde al pizzicamento della punta su tutti gli arti, posizionarlo su una piastra elettrica in posizione prona con isoflurano all'1,5% in ossigeno per il mantenimento (Figura 2A).
4. Iniettare morfina (20 mg/kg di peso corporeo) attraverso la via intraperitoneale (i.p.) per la gestione del dolore⁶.
5. Controllare la temperatura dell'acqua a bagnomaria. Impostare il timer e indossare i guanti resistenti al calore.
6. Estrarre una barra di rame riscaldata dal bagno d'acqua e toccarla sulla zona dorsale del ratto per 7 secondi per indurre la bruciatura.
   NOTA: Mantenere una distanza minima (10-15 cm) tra il bagno d'acqua e l'animale per ridurre al minimo la perdita di calore e non esercitare pressione sulle aste mentre si induce l'ustione (cioè, il contatto deve essere mantenuto dalla gravità).
7. Applicare quattro bruciature, utilizzando una barra per sito di combustione, una immediatamente dopo l'altra per produrre una bruciatura a contatto completo TBSA di circa il 20% (Figura 2B).
8. Dopo l'ustione, rianimare l'animale mediante iniezione endovenosa di soluzione di Ringer lattato (0,1 ml/g di peso corporeo).
   NOTA: Utilizzare una soluzione di suoneria lattata regolata per la temperatura corporea per rianimare i ratti.
9. Spegnere l'isoflurano, rimuovere il cono del naso e posizionare il ratto sul tappetino termico per il recupero.

3. Preparazione dell'inoculo batterico e dell'infezione

1. Strisciare il campione congelato di Pseudomonas aeruginosa PAO1 e Staphylococcus aureus ATCC25923 su piastre di Muller Hinton Agar (MHA), 2 giorni prima dell'esperimento di combustione.
2. Il giorno successivo, selezionare una singola colonia di batteri cresciuti dalla piastra e, utilizzando un ciclo di inoculazione, raschiarla leggermente dalla piastra. Quindi, metterlo nel tubo di coltura per inoculare 10 ml di Muller Hinton Broth (MHB) e coltura per una notte a 37 ° C in uno shaker incubatore.
3. Il giorno dell'ustione e dell'infezione, centrifugare la coltura a 4.000 × g per 5 minuti. Lavare il pellet con soluzione salina normale (soluzione di NaCl allo 0,9%).
4. Risospendere il pellet batterico in soluzione salina e diluire fino a 0,1 OD 600nm (densità ottica a₆₀₀ nm). Diluire l'inoculo batterico prendendo 200 μL di questa sospensione batterica e mescolandolo con 800 μL di soluzione salina per ottenere l'inoculo batterico desiderato di 2 × 10⁷ CFU/mL.
5. Iniettare 50 μL di P. aeruginosa o S. aureus inoculum preparato nella fase precedente (dose di infezione 1 × 10⁶ CFU) nel ratto anestetizzato 15 minuti dopo l'ustione, utilizzando un ago da 29 G per via sottocutanea il più vicino possibile alla ferita da ustione.
6. Dopo aver infettato la ferita da ustione, posizionare il topo sulla piastra elettrica per il recupero. Una volta che l'animale si riprende (~15-20 min), ospitalo in una gabbia pulita.
   NOTA: Dopo la ferita da ustione, ospitare un topo per gabbia. Utilizzare pellet di cibo umido d'acqua per una facile masticazione e posizionarli sul pavimento della gabbia per una facile raggiungibilità.
7. Riempire le bottiglie d'acqua nella gabbia con acqua con morfina (0,4 mg / ml) per la gestione del dolore.
   NOTA: La morfina orale rispecchia la situazione clinica dei pazienti ustionati da ustioni umane. Questo studio ha utilizzato la morfina orale per mantenere questi esperimenti paragonabili ai pazienti ustionati umani dopo aver consultato il personale veterinario in numerose occasioni. I registri di bere e peso sono stati mantenuti durante l'esperimento. Utilizzare lo stesso sistema di abbeveraggio durante tutte le procedure. Altri analgesici, come la buprenorfina, possono essere somministrati per via sottocutanea / intraperitoneale secondo le linee guida istituzionali per la cura degli animali.
8. Compilare la lista di controllo del monitoraggio e monitorare attentamente gli animali per l'angoscia o la malattia per l'intera durata dell'esperimento.

4. Valutazione della lesione da ustione

1. Valutare morfologicamente la lesione da ustione cutanea in termini di colore e margine immediatamente dopo la lesione da ustione.
2. Colorare la pelle bruciata con ematossilina ed eosina (H & E) per visualizzare la struttura della ferita da ustione e il gap epiteliale¹⁵ (vedere il passaggio 5.6 per l'elaborazione del campione).

5. Post-elaborazione di campioni di ratto ed enumerazione batterica

1. Eutanasia il ratto a 24, 48 e 72 ore dopo l'ustione con un sovradosaggio di anestesia.
2. Prelevare campioni di sangue dai ratti tramite puntura cardiaca e raccoglierli in una mini provetta.
   1. Analizzare l'emocromo completo dai campioni di sangue per determinare l'effetto dell'induzione dell'ustione sul sistema immunitario dell'ospite.
3. Raccogliere la pelle, il tessuto sottocutaneo, i muscoli, i polmoni e la milza al momento dell'eutanasia.
   NOTA: Conservare una parte (~1 cm × 1 cm; peso ~200-300 mg) della pelle per la colorazione H & E e un'altra parte per l'enumerazione batterica.
4. Raccogliere i tessuti in una provetta di raccolta da 10 ml e metterli in soluzione salina normale su ghiaccio per l'enumerazione batterica.
5. Normalizzare il peso del tessuto con soluzione salina normale e omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore tissutale (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Diluire serialmente gli omogenati tissutali in soluzione salina normale.
   2. Piastra 100 μL di omogenato non diluito e tutte le diluizioni di ciascun campione di tessuto su piastre di agar cetrimide per campioni prelevati da ratti infetti da P. aeruginosa.
      NOTA: Utilizzare piastre di agar mannitolo per placcare campioni raccolti da ratti infetti da S. aureus.
   3. Incubare le piastre a 37 °C in un incubatore per 16-18 ore.
   4. Il giorno successivo, contare le colonie batteriche sulle piastre, moltiplicare per il rapporto di diluizione per ottenere il conteggio CFU / mL e normalizzare con il peso del tessuto per calcolare il tessuto CFU / g.
   5. Utilizzare un software di analisi dei dati per tracciare la conta batterica in diversi organi nei diversi punti temporali di campionamento.
6. Eseguire la colorazione H & E della pelle bruciata per visualizzare la struttura della ferita e il gap epiteliale.
   1. Utilizzando forbici e pinze dentate, tagliare un cerotto cutaneo di 1 cm x 1 cm dalla zona ustionata e immergerlo in un fissativo (formalina tamponata neutra al 10%, NBF) per 48 ore a temperatura ambiente.
      NOTA: Ruotare il contenitore per assicurarsi che tutti i tessuti siano completamente immersi nel fissativo, con il volume del fissativo 30 volte il volume del tessuto.
   2. Disidratare il tessuto cutaneo con etanolo al 70% (v/v) per 72 ore a temperatura ambiente.
   3. Elaborare i campioni disidratati in blocchi di paraffina per tagliare le sezioni e colorare con H & E¹⁵.
   4. Immagini digitali delle diapositive macchiate in uno scanner di diapositive (vedere la tabella dei materiali) utilizzando un obiettivo 40x.
   5. Analizzare l'immagine acquisita utilizzando un software (vedere File supplementare 1 per l'elaborazione dell'immagine per l'analisi; vedere la tabella dei materiali).
   6. Esaminare tutti i campi della sezione della pelle colorata per valutare le condizioni dell'epidermide, del derma, del tessuto sottocutaneo e del muscolo scheletrico.

Risultati

Il protocollo qui presentato è altamente riproducibile e ha provocato una lesione da ustione di terzo grado a tutto spessore nei ratti. La ferita da ustione appare bianca cerosa dopo l'induzione dell'ustione (Figura 2B). Il colore della lesione da ustione è cambiato da bianco a marrone nel corso di 72 ore dopo l'ustione (Figura 2B-E).

L'analisi istologica ha confermato un'ustione a tutto spessore (p...

Discussione

Sono stati presentati diversi modelli di ustioni per studiare la fisiopatologia delle ustioni 8,12,16,17. Nel presente studio, abbiamo impiegato un modello di ratto per sviluppare un protocollo semplice e riproducibile per indurre un'ustione a tutto spessore seguita da un'infezione batterica per simulare un trauma da ustione infetto nei pazienti. La scelta del ratto come modello animale per imi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm