Модель ожога крысы для изучения термического ожога кожи на всю толщину и инфекции

Резюме

Модель, имитирующая клинический сценарий ожоговой травмы и инфекции, необходима для дальнейших исследований ожогов. Настоящий протокол демонстрирует простую и воспроизводимую модель ожоговой инфекции крыс, сравнимую с таковой у людей. Это облегчает изучение ожогов и инфекций после ожога для разработки новых местных методов лечения антибиотиками.

Аннотация

Методики индукции ожогов непоследовательно описаны в моделях на крысах. Однородная модель ожоговой раны, представляющая клинический сценарий, необходима для проведения воспроизводимых ожоговых исследований. Настоящий протокол описывает простой и воспроизводимый способ получения ожогов на всю толщину с общей площадью поверхности тела (TBSA) ~20% у крыс. Здесь медный стержень размером 22,89 см² (диаметр 5,4 см), нагретый до 97 ° C на водяной бане, был нанесен на поверхность кожи крысы, чтобы вызвать ожоговую травму. Медный стержень с высокой теплопроводностью был способен рассеивать тепло глубже в тканях кожи, создавая ожог на всю толщину. Гистологический анализ показывает ослабленный эпидермис с коагуляционным повреждением на всю толщину дермы и подкожной клетчатки. Кроме того, эта модель репрезентативна для клинических ситуаций, наблюдаемых у госпитализированных пациентов с ожогами после ожоговой травмы, такой как иммунная дисрегуляция и бактериальные инфекции. Модель может повторять системную бактериальную инфекцию как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями. В заключение, в этой статье представлена простая в освоении и надежная модель ожога крыс, которая имитирует клинические ситуации, включая иммунную дисрегуляцию и бактериальные инфекции, что имеет большое значение для разработки новых местных антибиотиков для лечения ожоговых ран и инфекций.

Введение

Ожоговые травмы являются одними из самых разрушительных форм травм, при этом смертность достигает 12% даже в специализированных ожоговых центрах ^1,2,3. Согласно недавно опубликованным отчетам, ~ 486 000 пациентов с ожогами ежегодно нуждаются в медицинской помощи в Соединенных Штатах, при этом почти 3 500 смертей 1,2,3,4,5,6. Ожоговая травма представляет собой серьезную проблему для иммунной системы пациентов и создает значительную открытую рану, которая медленно заживает, делая их восприимчивыми к кожной, легочной и системной колонизации нозокомиальными, условно-патогенными бактериями. Иммунная дисрегуляция в сочетании с бактериальной инфекцией связана с повышенной заболеваемостью и смертностью у ожоговых больных⁷.

Модель ожогов и инфекций животных имеет важное значение для изучения патогенеза бактериальных инфекций после повреждения кожи и подавления иммунитета, связанного с ожоговой травмой. Такие модели позволяют разрабатывать и оценивать новые методы лечения бактериальных инфекций у ожоговых больных. Крысы и люди имеют сходные физиологические и патологические характеристики кожи, которые были задокументированы^{ранее 8}. Кроме того, крысы меньше по размеру, что делает их более легкими в обращении, более доступными и простыми в приобретении и обслуживании, чем более крупные модели животных.

Эти характеристики делают крыс идеальным модельным животным для изучения ожогов и инфекций⁹. К сожалению, техника индукции ожога непоследовательна и часто минимально описана 10,11,12,13,14. Настоящий протокол предназначен для разработки простой, экономически эффективной и воспроизводимой процедуры для создания последовательной ожоговой травмы на всю толщину в модели крысы, которая имитирует клинический сценарий и может быть использована для оценки иммуносупрессии и бактериальной инфекции.

протокол

Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Северной Каролины и проводились в соответствии с установленными им руководящими принципами. Для экспериментов использовали самцов и самок крыс Sprague Dawley (250-300 г) в возрасте 7-9 недель. Все животные были размещены в 12-часовом цикле свет-темнота со свободным доступом к пище и воде ad libitum. Всегда работайте со своим ветеринарным врачом над планом обезболивания до начала исследования.

1. Подготовка крыс к ожоговой травме

1. Подготовьте животных к ожогу за 24 часа до ожога.
2. Обезболивают крысу 5% изофлураном в 100% кислороде в индукционной камере в течение 5 мин (скорость потока: 2 л/мин) до тех пор, пока дыхание не замедлится.
3. После того, как крыса будет глубоко анестезирована (не реагирует на защемление пальцев ног на всех конечностях), переместите крысу на грелку в положении лежа и уменьшите содержание изофлурана до 1,5% в кислороде для поддержания через носовой конус.
4. Чтобы предотвратить высыхание роговицы после анестезии и во время процедуры, нанесите смазку для глаз на роговицу обоих глаз с помощью аппликатора с ватным наконечником.
5. Побрейте спинную область крысы с помощью электрической машинки для стрижки (см. Таблицу материалов) и удалите как можно больше волос в большом прямоугольнике от лопаток до основания хвоста (рис. 2А).
6. Очистите выбритый участок салфеткой, смоченной в физиологическом растворе, чтобы стереть выпавшие волоски. Нанесите лосьон для удаления волос на выбритый участок с помощью аппликатора с ватным наконечником и оставьте на ~ 3 минуты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применение упомянутого лосьона для удаления волос более 3 минут вызовет красную сыпь на коже.
7. Дважды протрите область влажной марлевой губкой, чтобы удалить лосьон и предотвратить раздражение кожи.
8. Выключите изофлуран, удалите носовой конус и поместите крысу в клетку для восстановления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите грелку в клетку для восстановления.
9. Переведите выздоровевшее животное в чистую клетку для ожоговой процедуры на следующий день (крысе может потребоваться ~ 10-15 минут, чтобы оправиться от анестезии).

2. Индуцирование ожоговой травмы у крыс

1. В день ожога установите температуру водяной бани 97 °C и поместите все четыре медных стержня (по 420 г каждый; Рисунок 1) на водяной бане за 1 ч до обжига опыта, чтобы стержни равномерно прогрелись.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удилища должны быть погружены в воду. Перед экспериментом проверьте точность цифрового отображения температуры с помощью термометра.
2. Обезболивайте крысу, как указано в разделе 1.
3. Как только крыса перестает реагировать на ущипывание пальцев ног на всех конечностях, поместите ее на грелку в положении лежа с 1,5% изофлурана в кислороде для поддержания (рис. 2А).
4. Вводят морфин (20 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно (внутривенно ) для обезболивания⁶.
5. Проверьте температуру воды на водяной бане. Установите таймер и наденьте термостойкие перчатки.
6. Выньте один нагретый медный стержень из водяной бани и прикоснитесь им к спинной области крысы в течение 7 с, чтобы вызвать ожог.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте минимальное расстояние (10-15 см) между водяной баней и животным, чтобы свести к минимуму потери тепла, и не давите на стержни, вызывая ожог (т. е. контакт должен поддерживаться силой тяжести).
7. Нанесите четыре ожога, используя по одному стержню на место ожога, один сразу за другим, чтобы получить примерно 20% полноконтактный ожог TBSA (рис. 2B).
8. После ожога реанимировать животное путем внутривенного введения лактатного раствора Рингера (0,1 мл/г массы тела).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте раствор Рингера с регулируемой температурой тела, чтобы реанимировать крыс.
9. Выключите изофлуран, удалите носовой конус и поместите крысу на тепловой коврик для восстановления.

3. Подготовка бактериального посева и инфекции

1. Проложите замороженный образец Pseudomonas aeruginosa PAO1 и Staphylococcus aureus ATCC25923 на планшетах Muller Hinton Agar (MHA) за 2 дня до эксперимента с ожогом.
2. На следующий день выберите из тарелки одну колонию выросших бактерий и с помощью инокуляционной петли слегка соскребите ее с тарелки. Затем поместите его в культуральную пробирку, чтобы инокулировать 10 мл бульона Мюллера Хинтона (MHB) и культивировать в течение ночи при 37 ° C в шейкере инкубатора.
3. В день ожога и инфицирования центрифугируют культуру при концентрации 4 000 × г в течение 5 мин. Промойте гранулы обычным физиологическим раствором (0,9% раствор NaCl).
4. Ресуспендировать бактериальную гранулу в физиологическом растворе и разбавить до 0,1 OD 600 нм (оптическая плотность при_{600 нм} ). Разбавьте бактериальный посевной материал, взяв 200 мкл этой бактериальной суспензии и смешав ее с 800 мкл физиологического раствора, чтобы получить желаемый бактериальный инокулят 2 × 10⁷ КОЕ / мл.
5. Через 15 минут после ожога введите 50 мкл инокулята P. aeruginosa или S. aureu, приготовленного на предыдущем этапе (доза инфекции 1 × 10⁶ КОЕ), крысе, находящейся под наркозом, используя иглу 29 г подкожно как можно ближе к ожоговой ране.
6. После инфицирования ожоговой раны поместите крысу на грелку для восстановления. Как только животное выздоровеет (~15-20 мин), поместите его в чистую клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После ожога держите одну крысу в клетке. Используйте влажные гранулы корма для легкого жевания и положите их на пол клетки для легкого доступа.
7. Наполните бутылки с водой в клетке водой с морфином (0,4 мг / мл) для обезболивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пероральный морфин отражает клиническую ситуацию с пациентами с ожогами человека. В этом исследовании использовался пероральный морфин, чтобы эти эксперименты были сопоставимы с пациентами с человеческими ожогами после многочисленных консультаций с ветеринарным персоналом. Журналы питья и веса велись на протяжении всего эксперимента. Используйте одну и ту же питьевую систему во время всех процедур. Другие анальгетики, такие как бупренорфин, можно вводить подкожно/внутрибрюшинно в соответствии с рекомендациями по уходу за животными.
8. Заполните контрольный список мониторинга и внимательно следите за животными на предмет стресса или болезни в течение всего эксперимента.

4. Оценка ожоговой травмы

1. Оцените ожоговую травму кожи морфологически с точки зрения цвета и края сразу после ожоговой травмы.
2. Окрашивание обожженной кожи гематоксилином и эозином (H&E) для визуализации структуры ожоговой раны и эпителиального промежутка¹⁵ (см. шаг 5.6 для обработки образца).

5. Постобработка образцов крыс и перепись бактерий

1. Усыпляют крысу через 24, 48 и 72 ч после ожога при передозировке анестезии.
2. Возьмите образцы крови у крыс с помощью пункции сердца и соберите их в мини-пробирку.
   1. Проанализируйте общий анализ крови из образцов крови, чтобы определить влияние индукции ожога на иммунную систему хозяина.
3. Собирайте кожу, подкожную клетчатку, мышцы, легкие и селезенку во время эвтаназии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте одну часть (~ 1 см × 1 см; вес ~ 200-300 мг) кожи для окрашивания H&E, а другую часть - для бактериального подсчета.
4. Соберите ткани в пробирку для сбора объемом 10 мл и поместите их в обычный физиологический раствор на льду для подсчета бактерий.
5. Нормализуют массу ткани физиологическим раствором и гомогенизируют образцы с помощью тканевого гомогенизатора (см. Таблицу материалов).
   1. Последовательно разводят тканевые гомогенаты в физиологическом растворе.
   2. Планшет 100 мкл неразбавленного гомогената и все разведения каждого образца ткани на цетримидных агаровых пластинах для образцов, собранных у крыс, инфицированных P. aeruginosa.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластины с маннитовым агаром для покрытия образцов, собранных у крыс, инфицированных S. aureus.
   3. Инкубировать планшеты при 37 °C в инкубаторе в течение 16-18 ч.
   4. На следующий день подсчитайте бактериальные колонии на планшетах, умножьте на коэффициент разведения, чтобы получить количество КОЕ/мл, и нормализуйте с весом ткани, чтобы рассчитать КОЕ/г ткани.
   5. Используйте программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить график количества бактерий в разных органах в разные моменты времени.
6. Выполните окрашивание обожженной кожи H&E, чтобы визуализировать структуру раны и эпителиальный промежуток.
   1. С помощью ножниц и зубчатых щипцов отрежьте участок кожи размером 1 см х 1 см от области ожога и погрузите его в фиксатор (10% нейтральный буферный формалин, NBF) на 48 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вкрутите контейнер, чтобы убедиться, что все ткани полностью погружены в фиксатор, при этом объем фиксатора в 30 раз превышает объем ткани.
   2. Обезвоживание кожных тканей 70% (об./об.) этанола в течение 72 ч при комнатной температуре.
   3. Обработайте обезвоженные образцы в парафиновых блоках, чтобы разрезать срезы и окрасить H&E¹⁵.
   4. Оцифруйте окрашенные слайды в цифровом виде на сканере слайдов (см. Таблицу материалов) с помощью 40-кратного объектива.
   5. Проанализируйте отсканированное изображение с помощью программного обеспечения (см. Дополнительный файл 1 для обработки изображения для анализа; см. Таблицу материалов).
   6. Исследуйте все области окрашенного участка кожи, чтобы оценить состояние эпидермиса, дермы, подкожной клетчатки и скелетных мышц.

Результаты

Представленный здесь протокол обладает высокой воспроизводимостью и привел к ожоговой травме третьей степени на всю толщину у крыс. Ожоговая рана выглядит восково-белой после индукции ожога (рис. 2B). Цвет ожоговой травмы изменился с белого на коричневый в течение 72 часо...

Обсуждение

Для изучения патофизиологии ожоговой травмы^было представлено несколько моделей ожогов 8,12,16,17. В настоящем исследовании мы использовали модель крысы для разработки простого и воспроизводимого протокола, чтобы вызв?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm