大鼠烧伤模型研究全层皮肤热烧伤和感染

摘要

模拟烧伤和感染临床情况的模型对于进一步烧伤研究是必要的。本协议展示了一种与人类相当的简单且可重复的大鼠烧伤感染模型。这有助于研究烧伤后烧伤和感染，以开发新的局部抗生素治疗。

摘要

烧伤诱导方法在大鼠模型中的描述不一致。代表临床情况的统一烧伤创面模型对于进行可重复的烧伤研究是必要的。本协议描述了一种简单且可重复的方法，可在大鼠中产生~20%的总体表面积（TBSA）全层烧伤。在这里，将22.89cm² （直径5.4cm）铜棒在水浴中加热97°C以诱导烧伤。具有高导热性的铜棒能够将热量散发到皮肤组织中的更深处，从而产生全层灼伤。组织学分析显示表皮减毒，真皮和皮下组织的全层厚度存在凝血损伤。此外，该模型代表了在烧伤后住院烧伤患者中观察到的临床情况，例如免疫失调和细菌感染。该模型可以概括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的全身性细菌感染。综上所述，本文提出了一种易于学习且稳健的大鼠烧伤模型，该模型模拟了包括免疫失调和细菌感染在内的临床情况，对于开发用于烧伤创面和感染的新型外用抗生素具有相当大的实用性。

引言

烧伤是最具破坏性的创伤形式之一，即使在专门的烧伤中心，死亡率也达到 12%¹，^2，3。根据最近发表的报告，美国每年有~486，000名烧伤患者需要医疗护理，其中近3，500人死亡¹，²，³，⁴，^5，6。烧伤对患者的免疫系统构成重大挑战，并形成明显的开放性伤口，愈合缓慢，使他们容易受到皮肤、肺部和全身性院内机会性细菌的定植。免疫失调与细菌感染相结合与烧伤患者的发病率和死亡率增加有关⁷。

动物烧伤和感染模型对于研究皮肤损伤和烧伤创伤相关免疫抑制后细菌感染的发病机制至关重要。这些模型能够设计和评估治疗烧伤患者细菌感染的新方法。大鼠和人类具有先前记录的相似的皮肤生理和病理特征⁸。此外，与较大的动物模型相比，大鼠的体型更小，使它们更容易处理、更实惠、更容易采购和维护。

这些特征使大鼠成为研究烧伤和感染的理想模式动物⁹。不幸的是，烧伤诱导技术不一致，并且通常描述最少¹⁰，¹¹，¹²，^13，14。本协议旨在开发一种简单，具有成本效益和可重复的程序，用于在模拟临床场景的大鼠模型中创建一致的全层烧伤损伤，并可用于评估免疫抑制和细菌感染。

研究方案

所有程序均由北卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照其既定指南进行。使用7-9周龄的雄性和雌性Sprague Dawley大鼠（250-300g）进行实验。所有动物均被饲养在12 h:12 h明暗循环中，可随意获取食物 和水。在研究开始之前，请务必与您的机构兽医合作制定镇痛计划。

1.为大鼠准备烧伤

1. 在烧伤前24小时准备动物烧伤。
2. 在诱导室中用5%异氟醚在100%氧气中麻醉大鼠5分钟（流速:2L / min），直到呼吸减慢。
3. 一旦大鼠被深度麻醉（对四肢的脚趾捏没有反应），将大鼠移到俯卧位的加热垫上，并将异氟醚在氧气中减少到1.5%，以便通过鼻锥维持。
4. 为防止麻醉后和手术过程中角膜干燥，请使用棉头涂抹器在双眼角膜上涂抹眼睛润滑剂。
5. 使用电动剪剃除大鼠的背部区域（见 材料表），并在从肩胛骨到尾巴底部的大矩形中尽可能多地去除毛发（图2A）。
6. 用浸有生理盐水的纸巾清洁剃须区域，以擦去松散的毛发。使用棉头涂抹器将脱毛化妆水涂抹在剃须区域，并保持~3分钟。
   注意:使用参考脱毛化妆水超过3分钟会在皮肤上引起红色皮疹。
7. 用湿纱布海绵擦拭该区域两次，以去除化妆水并防止皮肤刺激。
8. 关闭异氟醚，取出鼻锥，将大鼠放入恢复笼中。
   注意:在恢复笼中放一个加热垫。
9. 将回收的动物转移到干净的外壳笼中进行第二天的燃烧程序（大鼠从麻醉中恢复可能需要~10-15分钟）。

2.诱导大鼠烧伤

1. 在燃烧当天，将水浴温度设置为97°C，并放置所有四根铜棒（每根420克; 图1）在燃烧实验前1小时在水浴中，让棒均匀升温。
   注意:杆必须浸入水中。实验前使用温度计检查数字温度显示的准确性。
2. 如第1节所述麻醉大鼠。
3. 一旦大鼠对所有肢体的脚趾捏没有反应，将其放在俯卧位的加热垫上，氧气中含有1.5%异氟醚以进行维持（图2A）。
4. 通过腹膜内（腹腔内）途径注射吗啡（20 mg / kg体重）以进行疼痛管理⁶.
5. 检查水浴中的水温。设置计时器并戴上耐热手套。
6. 从水浴中取出一根加热的铜棒，将其触摸在大鼠的背部区域7秒以诱导烧伤。
   注意:水浴和动物之间保持最小距离（10-15厘米），以尽量减少热量损失，并且在诱导灼伤时不要对杆施加压力（即必须通过重力保持接触）。
7. 施用四次烧伤，每个烧伤部位使用一根杆，一个接一个，以产生大约20%TBSA全接触烧伤（图2B）。
8. 烧伤后，通过腹腔注射乳酸林格氏溶液（0.1mL/g 体重）使动物复苏。
   注意:使用体温调节的乳酸铃声溶液来复苏大鼠。
9. 关闭异氟醚，取出鼻锥，将大鼠放在加热垫上进行恢复。

3.细菌接种物和感染的制备

1. 在烧伤实验前 2 天，在 Muller Hinton 琼脂 （MHA） 平板上划线铜 绿假单胞 菌 PAO1 和 金黄色葡萄球菌s ATCC25923 的冷冻样品。
2. 第二天，从盘子中选择一个生长细菌菌落，并使用接种环将其从盘子上轻轻刮掉。然后，将其放入培养管中以接种10mL穆勒辛顿肉汤（MHB），并在培养箱振荡器中于37°C培养过夜。
3. 在烧伤和感染当天，将培养物以4，000 ×g 离心5分钟。用生理盐水（0.9%NaCl溶液）洗涤沉淀。
4. 将细菌沉淀重悬于盐水中，并稀释至0.1 OD 600nm（_600nm 处的光密度）。通过取 200 μL 该细菌悬浮液并将其与 800 μL 盐水混合来稀释细菌接种物，以获得所需的 2 ×^{10 7} CFU/mL 细菌接种物。
5. 在烧伤后15分钟将上一步制备的50μL 铜绿假单胞 菌或 金黄色葡萄球菌接种物（感染剂量1×10^6CFU ）注射到麻醉大鼠中，使用29G针皮下尽可能靠近烧伤创面。
6. 感染烧伤伤口后，将大鼠放在加热垫上恢复。一旦动物恢复（~15-20分钟），将其放在干净的笼子里。
   注意:烧伤后，每个笼子里养一只老鼠。使用水湿食物颗粒便于咀嚼，并将它们放在笼子地板上以便于触及。
7. 用加了吗啡的水（0.4 mg/mL）填充笼子中的水瓶以控制疼痛。
   注意:口服吗啡反映了人类烧伤患者的临床情况。这项研究利用口服吗啡使这些实验与人类烧伤患者在多次咨询兽医人员后相当。在整个实验过程中保持饮酒和体重日志。在所有过程中使用相同的饮水系统。其他镇痛药，如丁丙诺啡，可根据机构动物护理指南皮下/腹膜内给药。
8. 填写监测清单，并在整个实验过程中密切监测动物的痛苦或疾病。

4.烧伤的评估

1. 烧伤后立即从颜色和边缘方面评估皮肤烧伤。
2. 用苏木精和伊红（H&E）染色烧伤的皮肤，以可视化烧伤伤口结构和上皮间隙¹⁵ （参见步骤5.6进行样品处理）。

5. 大鼠样品的后处理和细菌计数

1. 在烧伤后24，48和72小时用过量麻醉对大鼠实施安乐死。
2. 通过心脏穿刺 从 大鼠中提取血液样本，并将其收集在迷你收集管中。
   1. 分析血液样本中的全血细胞计数，以确定烧伤诱导对宿主免疫系统的影响。
3. 在安乐死时收获皮肤、皮下组织、肌肉、肺和脾脏。
   注意:保留一部分（~1厘米×1厘米;重量~200-300毫克）皮肤用于H&E染色，另一部分用于细菌计数。
4. 将组织收集在 10 mL 收集管中，并将它们置于冰上的生理盐水中以进行细菌计数。
5. 用生理盐水归一化组织重量，并使用组织均质器均质化样品（参见 材料表）。
   1. 在生理盐水中连续稀释组织匀浆。
   2. 板100μL未稀释的匀浆和西曲胺琼脂平板上每个组织样品的所有稀释液，用于从感染 铜绿假单胞菌的大鼠收集的样品。
      注意:使用甘露醇琼脂平板对从感染 金黄色葡萄球菌的大鼠收集的样品进行电镀。
   3. 将板在37°C培养箱中孵育16-18小时。
   4. 第二天，计数平板上的细菌菌落，乘以稀释比以获得CFU / mL计数，并与组织的重量归一化以计算CFU / g组织。
   5. 使用数据分析软件绘制不同采样时间点不同器官中的细菌计数。
6. 对烧伤的皮肤进行H&E染色，以可视化伤口结构和上皮间隙。
   1. 使用剪刀和齿镊子，从烧伤区域切下1cm x 1cm的皮肤贴片，并将其浸入固定剂（10%中性缓冲福尔马林，NBF）中，在室温下48小时。
      注意:旋转容器以确保所有组织完全浸入固定剂中，固定剂的体积是组织体积的 30 倍。
   2. 在室温下用70%（v / v）乙醇使皮肤组织脱水72小时。
   3. 在石蜡块中处理脱水样品以切割切片并用H&^{E 15}染色。
   4. 使用40倍物镜在载玻片扫描仪（参见 材料表）中对染色载玻片进行数字成像。
   5. 使用软件分析扫描的图像（有关分析图像的处理，请参见 补充文件1 ;请参阅 材料表）。
   6. 检查染色皮肤切片的所有区域，以评估表皮、真皮、皮下组织和骨骼肌的状况。

结果

这里提出的方案是高度可重复的，并导致大鼠三度全层烧伤。烧伤诱导后烧伤创面呈蜡白色（图2B）。烧伤后72小时烧伤的颜色从白色变为棕色（图2B-E）。

组织学分析证实烧伤后24小时全层烧伤（深度>2.61毫米; 图 3B）。与完整的非烧伤皮肤相比，烧伤动物的皮肤样本在烧伤后24、48和7...

讨论

已经提出了几种烧伤模型来研究烧伤的病理生理学⁸，¹²，^16，17。在本研究中，我们采用大鼠模型开发了一种简单且可重复的方案，以诱导全层烧伤，然后是细菌感染，以模拟患者的感染烧伤创伤。选择大鼠作为动物模型来模拟人类条件是基于成本、易用性、可重复性和数据可靠性的平衡。本文中使用...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm