Modèle de brûlure de rat pour étudier les brûlures thermiques cutanées de pleine épaisseur et l’infection

Résumé

Un modèle imitant le scénario clinique des brûlures et des infections est nécessaire pour faire avancer la recherche sur les brûlures. Le présent protocole démontre un modèle simple et reproductible d’infection par brûlure chez le rat, comparable à celui de l’homme. Cela facilite l’étude des brûlures et des infections après brûlure pour le développement de nouveaux traitements antibiotiques topiques.

Résumé

Les méthodologies d’induction des brûlures ne sont pas décrites de manière cohérente dans les modèles de rats. Un modèle uniforme de brûlure, qui représente le scénario clinique, est nécessaire pour effectuer des recherches reproductibles sur les brûlures. Le présent protocole décrit une méthode simple et reproductible pour créer des brûlures de toute épaisseur de ~20% de la surface corporelle totale (TBSA) chez les rats. Ici, une tige de cuivre de 22,89 cm² (5,4 cm de diamètre) chauffée à 97 °C dans un bain-marie a été appliquée sur la surface de la peau du rat pour provoquer la brûlure. Une tige de cuivre avec une conductivité thermique élevée a pu dissiper la chaleur plus profondément dans le tissu cutané pour créer une brûlure de pleine épaisseur. L’analyse histologique montre un épiderme atténué avec des dommages coagulatifs à toute l’épaisseur du derme et du tissu sous-cutané. De plus, ce modèle est représentatif des situations cliniques observées chez les patients hospitalisés souffrant de brûlures à la suite de brûlures telles qu’une dysrégulation immunitaire et des infections bactériennes. Le modèle peut récapituler l’infection bactérienne systémique par les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. En conclusion, cet article présente un modèle de brûlure de rat robuste et facile à apprendre qui imite les situations cliniques, y compris la dysrégulation immunitaire et les infections bactériennes, ce qui est d’une utilité considérable pour le développement de nouveaux antibiotiques topiques pour les brûlures et les infections.

Introduction

Les brûlures sont parmi les formes de traumatisme les plus dévastatrices, avec des taux de mortalité atteignant 12%, même dans les centres spécialisés^dans les grands brûlés ^1,2,3. Selon des rapports récemment publiés, ~ 486 000 patients brûlés nécessitent des soins médicaux chaque année aux États-Unis, avec près de 3 500 décès 1,2,3,4,5,6. Les brûlures constituent un défi majeur pour le système immunitaire des patients et créent une plaie ouverte importante, qui est lente à guérir, les laissant vulnérables à la colonisation cutanée, pulmonaire et systémique par des bactéries nosocomiales et opportunistes. La dérégulation immunitaire combinée à l’infection bactérienne est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients brûlés⁷.

Un modèle de brûlure et d’infection animale est essentiel pour étudier la pathogenèse des infections bactériennes à la suite de lésions cutanées et d’une suppression immunitaire associée à un traumatisme par brûlure. De tels modèles permettent la conception et l’évaluation de nouvelles méthodes de traitement des infections bactériennes chez les patients brûlés. Les rats et les humains partagent des caractéristiques physiologiques et pathologiques cutanées similaires qui ont été précédemment documentées⁸. De plus, les rats sont de plus petite taille, ce qui les rend plus faciles à manipuler, plus abordables et plus faciles à se procurer et à entretenir que les modèles animaux plus grands.

Ces caractéristiques font des rats un animal modèle idéal pour étudier les brûlures et les infections⁹. Malheureusement, la technique d’induction des brûlures est incohérente et souvent décrite de manière minimale10,11,12,13,14. Le présent protocole est conçu pour mettre au point une procédure simple, rentable et reproductible pour créer une brûlure constante sur toute l’épaisseur dans un modèle de rat qui simule le scénario clinique et peut être utilisé pour évaluer l’immunosuppression et l’infection bactérienne.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord et ont été menées conformément à ses lignes directrices établies. Des rats Sprague Dawley mâles et femelles (250-300 g) âgés de 7 à 9 semaines ont été utilisés pour les expériences. Tous les animaux ont été logés dans un cycle lumière-obscurité de 12 h:12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau ad libitum. Travaillez toujours avec votre vétérinaire institutionnel au sujet d’un plan analgésique avant le début de l’étude.

1. Préparer les rats à la brûlure

1. Préparez les animaux aux brûlures 24 heures avant la brûlure.
2. Anesthésier le rat avec 5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène dans une chambre d’induction pendant 5 min (débit: 2 L / min) jusqu’à ce que la respiration ait ralenti.
3. Une fois que le rat est profondément anesthésié (ne répond pas au pincement des orteils sur tous les membres), déplacez le rat vers un coussin chauffant en position couchée et réduisez l’isoflurane à 1,5% en oxygène pour le maintien par un cône nasal.
4. Pour éviter le séchage de la cornée après l’anesthésie et pendant la procédure, appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les cornées des deux yeux à l’aide d’un applicateur à embout de coton.
5. Rasez la région dorsale du rat à l’aide d’une tondeuse électrique (voir le tableau des matériaux) et enlevez autant de poils que possible dans un grand rectangle des omoplates jusqu’à la base de la queue (figure 2A).
6. Nettoyez la zone rasée avec un mouchoir imbibé de solution saline pour essuyer les poils lâches. Appliquez la lotion dépilatoire sur la zone rasée à l’aide d’un applicateur à embout de coton et laissez-la agir pendant ~3 min.
   REMARQUE: L’application de la lotion d’épilation référencée pendant plus de 3 minutes induira des éruptions cutanées rouges sur la peau.
7. Essuyez la zone avec une éponge de gaze humide deux fois pour enlever la lotion et prévenir l’irritation de la peau.
8. Éteignez l’isoflurane, retirez le cône nasal et placez le rat dans la cage de récupération.
   REMARQUE: Placez un coussin chauffant dans la cage de récupération.
9. Transférez l’animal récupéré dans une cage de logement propre pour la procédure de brûlure du lendemain (cela peut prendre ~ 10-15 minutes pour que le rat se remette de l’anesthésie).

2. Provoquer la brûlure chez le rat

1. Le jour de la combustion, régler la température du bain-marie à 97 °C et placer les quatre tiges de cuivre (420 g chacune; Graphique 1) Au bain-marie 1 h avant l’expérience de brûlure pour laisser les tiges se réchauffer uniformément.
   NOTE: Les tiges doivent être immergées dans l’eau. Vérifiez la précision de l’affichage numérique de la température à l’aide d’un thermomètre avant l’expérience.
2. Anesthésiez le rat comme mentionné à la section 1.
3. Une fois que le rat ne répond pas au pincement des orteils sur tous les membres, placez-le sur un coussin chauffant en position couchée avec 1,5 % d’isoflurane dans de l’oxygène pour l’entretien (figure 2A).
4. Injecter de la morphine (20 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale (i.p.) pour la gestion de la douleur⁶.
5. Vérifiez la température de l’eau dans le bain-marie. Réglez la minuterie et mettez les gants résistants à la chaleur.
6. Retirez une tige de cuivre chauffée du bain-marie et touchez-la sur la région dorsale du rat pendant 7 s pour provoquer la brûlure.
   REMARQUE : Gardez une distance minimale (10-15 cm) entre le bain-marie et l’animal pour minimiser les pertes de chaleur et ne mettez pas de pression sur les tiges tout en provoquant la brûlure (c.-à-d. que le contact doit être maintenu par gravité).
7. Appliquer quatre brûlures, en utilisant une tige par site de brûlure, l’une immédiatement après l’autre pour produire une brûlure TBSA de contact complet d’environ 20 % (figure 2B).
8. Après la brûlure, réanimer l’animal par injection intraveineuse de solution de Ringer lactée (0,1 mL/g de poids corporel).
   REMARQUE : Utilisez une solution de sonnerie lactée ajustée à la température corporelle pour réanimer les rats.
9. Éteignez l’isoflurane, retirez le cône nasal et placez le rat sur le tapis chauffant pour le récupérer.

3. Préparation de l’inoculum bactérien et de l’infection

1. Étaler l’échantillon congelé de Pseudomonas aeruginosa PAO1 et Staphylococcus aureus ATCC25923 sur des plaques de gélose Muller Hinton (MHA), 2 jours avant l’expérience de brûlure.
2. Le lendemain, choisissez une seule colonie de bactéries cultivées dans l’assiette et, à l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez-la légèrement de l’assiette. Ensuite, placez-le dans le tube de culture pour inoculer 10 ml de bouillon Muller Hinton (MHB) et cultivez-le pendant la nuit à 37 °C dans un agitateur d’incubateur.
3. Le jour de la brûlure et de l’infection, centrifuger la culture à 4 000 × g pendant 5 min. Laver la pastille avec une solution saline normale (solution de NaCl à 0,9%).
4. Resuspendre la pastille bactérienne dans une solution saline et diluer jusqu’à 0,1 OD 600nm (densité optique à_{600 nm} ). Diluer l’inoculum bactérien en prenant 200 μL de cette suspension bactérienne et en le mélangeant avec 800 μL de solution saline pour obtenir l’inoculum bactérien désiré de 2 × 10⁷ UFC/mL.
5. Injecter 50 μL d’inoculum de P. aeruginosa ou de S. aureupréparé à l’étape précédente (dose d’infection 1 × 10⁶ UFC) dans le rat anesthésié 15 min après la brûlure, à l’aide d’une aiguille de 29 G par voie sous-cutanée aussi près que possible de la plaie brûlée.
6. Après avoir infecté la brûlure, placez le rat sur le coussin chauffant pour la récupération. Une fois que l’animal a récupéré (~15-20 min), logez-le dans une cage propre.
   REMARQUE: Après la brûlure, logez un rat par cage. Utilisez des granulés de nourriture humide à l’eau pour faciliter la mastication et placez-les sur le sol de la cage pour une portée facile.
7. Remplissez les bouteilles d’eau dans la cage avec de l’eau enrichie de morphine (0,4 mg/mL) pour la gestion de la douleur.
   REMARQUE: La morphine orale reflète la situation clinique chez les patients brûlés humains. Cette étude a utilisé de la morphine orale pour garder ces expériences comparables aux patients brûlés humains après avoir consulté le personnel vétérinaire à de nombreuses reprises. Les journaux de consommation d’alcool et de poids ont été maintenus tout au long de l’expérience. Utilisez le même système de consommation pendant toutes les procédures. D’autres analgésiques, comme la buprénorphine, peuvent être administrés par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale, conformément aux lignes directrices institutionnelles en matière de soins aux animaux.
8. Remplissez la liste de contrôle de surveillance et surveillez étroitement les animaux pour détecter toute détresse ou maladie pendant toute la durée de l’expérience.

4. Évaluation de la brûlure

1. Évaluez morphologiquement la brûlure cutanée en termes de couleur et de marge immédiatement après la brûlure.
2. Colorer la peau brûlée avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) pour visualiser la structure de la plaie de brûlure et l’espace épithélial¹⁵ (voir l’étape 5.6 pour le traitement des échantillons).

5. Post-traitement des échantillons de rats et dénombrement des bactéries

1. Euthanasier le rat à 24, 48 et 72 h après la brûlure avec une surdose d’anesthésie.
2. Prélever des échantillons de sang sur les rats par ponction cardiaque et les recueillir dans un mini tube de prélèvement.
   1. Analyser la numération globulaire complète des échantillons de sang pour déterminer l’effet de l’induction de brûlures sur le système immunitaire de l’hôte.
3. Prélever la peau, le tissu sous-cutané, les muscles, les poumons et la rate au moment de l’euthanasie.
   REMARQUE: Conservez une partie (~ 1 cm × 1 cm; pesant ~ 200-300 mg) de la peau pour la coloration H & E et une autre partie pour le dénombrement bactérien.
4. Prélever les tissus dans un tube de prélèvement de 10 ml et les placer dans une solution saline normale sur de la glace pour le dénombrement bactérien.
5. Normaliser le poids des tissus avec une solution saline normale et homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire (voir le tableau des matériaux).
   1. Diluer en série les homogénats tissulaires dans une solution saline normale.
   2. Plaque 100 μL d’homogénat non dilué et toutes les dilutions de chaque échantillon de tissu sur des plaques de gélose au cétrimide pour les échantillons prélevés sur des rats infectés par P. aeruginosa.
      REMARQUE : Utiliser des plaques de gélose au mannitol pour plaquer des échantillons prélevés sur des rats infectés par S. aureus.
   3. Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur pendant 16-18 h.
   4. Le lendemain, comptez les colonies bactériennes sur les plaques, multipliez par le taux de dilution pour obtenir le nombre d’UFC/mL et normalisez avec le poids du tissu pour calculer le tissu UFC/g.
   5. Utiliser un logiciel d’analyse de données pour tracer le nombre de bactéries dans différents organes aux différents points de temps d’échantillonnage.
6. Effectuer une coloration H & E de la peau brûlée pour visualiser la structure de la plaie et l’espace épithélial.
   1. À l’aide de ciseaux et de pinces dentées, couper un patch cutané de 1 cm x 1 cm de la zone brûlée et l’immerger dans un fixateur (formol tamponné neutre à 10 %, FBN) pendant 48 h à température ambiante.
      REMARQUE: Remuez le récipient pour vous assurer que tous les tissus sont complètement immergés dans le fixateur, le volume du fixateur étant 30 fois supérieur au volume tissulaire.
   2. Déshydrater le tissu cutané avec de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant 72 h à température ambiante.
   3. Traiter les échantillons déshydratés dans des blocs de paraffine pour couper les sections et colorer avec H&E¹⁵.
   4. Imagez numériquement les diapositives colorées dans un scanner de diapositives (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un objectif 40x.
   5. Analysez l’image numérisée à l’aide d’un logiciel (voir le fichier supplémentaire 1 pour le traitement de l’image à analyser; voir le tableau des matériaux).
   6. Examinez tous les champs de la section de la peau tachée pour évaluer l’état de l’épiderme, du derme, du tissu sous-cutané et du muscle squelettique.

Résultats

Le protocole présenté ici est hautement reproductible et a entraîné une brûlure au troisième degré de pleine épaisseur chez les rats. La plaie de brûlure apparaît blanc cireux après induction de la brûlure (Figure 2B). La couleur de la brûlure est passée du blanc au brun au cours des 72 heures suivant la brûlure (figure 2B-E).

L’analyse histologique a confirmé une combustion sur tout...

Discussion

Plusieurs modèles de brûlures ont été présentés pour étudier la physiopathologie des brûlures 8,12,16,17. Dans la présente étude, nous avons utilisé un modèle de rat pour développer un protocole simple et reproductible pour induire une brûlure de pleine épaisseur suivie d’une infection bactérienne pour simuler un traumatisme de brûlure infecté chez les patients. Le choix du ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD, USA	309597	Used to inject the analgesic
1.7 mL Microtube	Olympus, USA	24-282	Used to carry morphine
10% NBF	VWR, USA	16004-115	Used to fix the skin piece for staining
30 mL syringe	BD, USA	302832	Used to inject the lactate ringer solution
70% ethyl alcohol	Fischer Scientific, USA	BP28184
Aperio AT2 Digital Pathology  Slide Scanner with ImageScope software	Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA	n/a	Scanning of H & E slides and analysis
Cetrimide agar plates	BD, USA	285420	Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth
Copper rods	n/a	n/a	Used to induce the burn injury
Cotton tipped applicators	OMEGA Surgical supply, USA	4225-IMC	Used to apply eye ointment
Electric shaver	Oster, USA	Golden A5	Used to remove the dorsal side hairs
Eye lube	Dechra, UK	n/a	The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness
Fluff filled underpads	Medline, USA	MSC281225	Used in the burn procedure
Forcep	F.S.T.	11027-12	Used to hold the skin piece
Gauze sponges	Oasis, USA	PK412	Used to clean the applied nair cream from the dorsal side
Heat-resistant gloves	n/a	n/a	Used to hold the heated copper rods
Hematology Analyzer	IDEXX laboratories, USA	ProCyte Dx
Induction chamber	Kent Scientific, USA	vetFlo-0730	Used to anesthesize the animals
Insulin syringe	BD, USA	329461
Isoflurane	Pivetal, USA	NDC46066-755-04	Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness
Isoflurane vaporiser	n/a	n/a
Lactated ringer's solution	icumedical, USA	NDC0990-7953-09	Used to resuscitate the rats
L-shaped spreader	Fischer Scientific, USA	14-665-230
Mannitol Agar	BD, USA	211407	Selective media plates for Staphylococcus aureus growth
Minicollect tubes (K2EDTA)	greiner bio-one, USA	450480	Used to collect the blood
Morphine	Mallinckrodt, UK	NDC0406-8003-30	This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain
Muller Hinton Broth	BD, USA	275730
Muller Hinton II Agar	BD, USA	211438
Nair hair removal lotion	Nair, USA	n/a	Used to remove the residual hairs on dorsal side
Needle 23 G	BD, USA	305193	Used to inject the lactate ringer solution
Normal saline	n/a	n/a
Spectrophotometer	ThermoScientific, USA	Genesys 30
Sprague-Dawley rats, male and female	Charles River Labs	n/a	7-9 weeks old for burn induction
Surgical Scissor	F.S.T.	14501-14	Used to cut the desired skin piece
Tissue collection tubes	Globe Scientific	220101236
Tissue Homogenizer	Kinematica, Inc, USA	POLYTRON PT2100	Used to homogenize the tissue samples
Water bath	Fischer Scientific, USA	n/a	Used to induce the burn injury
Weighted heating pad	Comfytemp, USA	n/a	Used during the procedure to keep rat's body warm